Summary
Vi beskriver en elektrokjemisk sensor assay metode for deteksjon og rask bakteriell identifikasjon. Analysen innebærer en sensor array funksjonaliseres med DNA oligonukleotide fangst prober for ribosomale RNA (rRNA) artsspesifikke sekvenser. Sandwich hybridisering av target rRNA med fangst sonde og en pepperrotperoksidase-linked DNA oligonukleotid detektor probe produserer en målbar amperometrisk strøm.
Abstract
Elektrokjemiske følere er mye brukt for hurtig og nøyaktig måling av blodglukose og kan tilpasses for påvisning av en rekke forskjellige analytter. Elektrokjemiske sensorer opererer ved transdusering av en biologisk gjenkjennelse hendelse til en nyttig elektrisk signal. Signaltransduksjon oppstår ved kobling av aktiviteten til et enzym til en redoks-elektrode amperometrisk. Sensor spesifisitet enten er en iboende egenskap av enzymet, glukose oksidase i tilfelle av en glukose-sensor, eller et produkt av sammenheng mellom enzym og et antistoff eller sonde.
Her beskriver vi en elektrokjemisk sensor assay metode til direkte å påvise og identifisere bakterier. I hvert fall sondene som er beskrevet her er DNA-oligonukleotider. Denne metoden er basert på brødskiven hybridisering av fangst og detektor prober med target ribosomal RNA (rRNA). Den capture probe er forankret til sensoroverflaten, mens detektoren sonde er knyttet til horseradish peroksidase (HRP). Når et substrat slik som 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) tilsettes til en elektrode med fangst-target-påviserkomplekser bundet til sin overflate, er substratet oksidert av HRP og redusert ved arbeidselektroden. Dette redoks syklus resulterer i skytteltrafikk av elektroner i det substrat fra elektroden til HRP, produsere strømgjennomgang i elektroden.
Introduction
Ved hjelp av rRNA som et målmolekyl for bakteriell påvisning og identifikasjon har en rekke fordeler. Utbredelsen av rRNA i bakterieceller gir en følsomhet grense så lav som 250 bakterier per milliliter uten behov for en target amplifikasjon. Bakteriell rRNA inneholder unike artsspesifikke sekvenser som er tilgjengelige for hybridisering med DNA-prober. Følgelig kan en rekke elektrokjemiske sensorer brukes til å identifisere ukjente bakterier, hvor hver sensor funksjonaliseres med et annet artsspesifikk capture probe. Positive kontroll sensorer bør inkluderes for et syntetisk oligonukleotid mål som "broer" Fangst og detektor sonder for å skape en intern kalibrering signal.
Elektrokjemiske sensorer har et bredt spekter av grunnleggende og translasjons forskning. For eksempel beskrev analysen her er brukt til å nøyaktig måle effekten av E. coli vekstfase på RRNA og pre-rRNA kopiere numre, som er av stor interesse for forskere interessert i bakteriell fysiologi to. Følsomheten av elektrokjemisk sensor analysen bestemmes av signal til støyforhold. En rekke signal forsterkning og støyreduksjon har vært utprøvd. Vi finner at forbedring av kjemien i sensorflaten er nøkkelen til å redusere ikke-spesifikk binding av proben detektor-og / eller HRP-enzymet. Spesielt har en blandet monolag av alkanedithiols og mercaptohexanol blitt funnet å redusere bakgrunnsstøyen ved å dekke elektrodeoverflaten mer fullstendig og samtidig beholde tilgjengelighet av capture probe til target hybridisering 3.. Disse overflatekjemi behandlingene er spesielt viktig for analyser som involverer komplekse biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Funksjonalisering av elektrokjemiske sensorer
- Klargjør tiolerte capture probe ved en konsentrasjon på 0,05 mM i 300 mM 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA og inkuberes i mørke ved romtemperatur i 10 min . Inkubering av den tiolerte capture probe med HDT sikrer at tiolgruppe på fangst proben reduseres, noe som resulterer i mer konsistente resultater.
- Anvende en nitrogenstrøm for å bart gull 16 sensorgruppe brikken (e) i 5 sekunder for å fjerne fuktighet og / eller partikler.
- Påfør 6 mL av HDT-tiolerte capture probe blanding til arbeidselektroden på alle 16 sensorene til sensorarrayet og lagre sensorbrikken (e) i en dekket petriskål ved 4 ° C over natten. Tiolerte fangst prober binde direkte til bart gull elektroden og HDT handlinger for å hindre overpacking av fangst prober og holde dem i en utvidet konformasjon som fremmer hybridisering med målet.
- DenDagen etter, vaskes sensorbrikken med avionisert H2O til 2-3 sekunder og tørk under en strøm av nitrogen i 5 sek.
- Påfør 6 pl av 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-heksanol (MCH) til arbeidselektroden på alle 16 sensorer og inkuber i 50 min. Dette og alle etterfølgende sensorbrikke Inkubasjoner utført i en dekket petriskål ved romtemperatur. MCH virker som et blokkerende middel, fylle eventuelle hull hvor den tiolerte capture probe eller HDT ikke er tilstede på elektrodeoverflaten.
2. Sample Preparation
- Overføre 1 ml av bakteriell kultur i logaritmisk fase av vekst (OD 600 ≈ 0,1) til et mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 16.000 xg i 5 min. Fjern kultursupernatanten. Den bakterielle pellet kan bearbeides umiddelbart eller lagret ved -80 ° C for senere bruk.
- Grundig resuspender den bakterielle pellet i 10 ul av 1 M NaOH ved anvendelse av pipettespissen botennen av mikrosentrifugerør og pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber suspensjonen ved romtemperatur i 5 min.
- Nøytraliser den bakterielle lysatet ved tilsetning av 50 pl av 1 M fosfatbuffer, pH 7,2, inneholdende 2,5% bovint serumalbumin (BSA) og 0,25 mM av et fluorescein-modifisert detektor probe. Inkuber nøytralisert lysatet i 10 min ved romtemperatur. Fluorescein-modifisert detektor hybridiserer med bakteriell rRNA målmolekylene.
3. Elektrokjemisk Sensor analysen
- Vask den MCH fra sensorbrikken med avionisert H2O til 2-3 sek og tørre under en strøm av nitrogen i 5 sek.
- Påfør 4 mL av nøytralisert bakteriell lysat til arbeidselektroden for hver av sensorene 14 og inkuber i 15 min. Target-detektor probe komplekser hybridisere til immobilisert tiolerte fangst prober.
- Påfør fire ul av en nM bygge bro oligonucleotide i en M fosfatbuffer, pH 7,2, inneholdende 2,5% BSA og 0,25 μ M fluorescein-modifisert detektor sonde til to positive kontroll sensorer (brukes for signal normalisering) og inkuberes i 15 min.
- Vask sensorbrikken med avionisert H2O til 2-3 sek og tørre under en strøm av nitrogen i 5 sek.
- Påfør 4 pl av 0,5 U / ml anti-Fluorescein-HRP i 1 M fosfatbuffer, pH 7,2, inneholdende 0,5% kasein til arbeidselektroden på alle 16 sensorer og inkuber i 15 min. Den anti-Fluorescein-HRP binder seg til den immobiliserte fluorescein-modifiserte detektor-prober.
- Vask sensorbrikken med avionisert H2O til 2-3 sek og tørre under en strøm av nitrogen i 5 sek.
- Påfører et tynt lag godt klistremerke på overflaten av følerbrikken og laste inn i sensorbrikken montere. Pipetter 50 mL av TMB substrat på alle 16 sensorer og lukke sensor chip mount.
- Skaff amperometry og sykliske Voltammetri målinger for alle 16 sensorer ved hjelp av Helios Chip Reader. Amperometrisk strøm er proporsjonal med frekvensen av TMB reduction på sensorens overflate (se figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en elektrokjemisk analyse som er strukturert i likhet med en sandwich ELISA. Som vist i figur 1, target ribosomal RNA (rRNA) hybridisering med fangst-og detektor prober er utviklet av en redoks-reaksjon katalysert av HRP-konjugert anti-fluorescein antistoff-fragmenter som binder til 3'-fluorescein linkage på detektoren probe. En viktig komponent av assay følsomhet er overflatekjemi av gull-elektroden. Vi har funnet at en ternær monolag bestående av tiolert capture sonder, mercaptohexanol og hexanedithiol forbedrer signal-til-støy-forholdet ved å redusere ikke-spesifikk bakgrunn binding av reporter proteinet 3.. Assayene er beskrevet her benytter en GeneFluidics 16 sensorgruppe chip vist i figur 2.. Hver av sensorene i matrisen inneholder tre elektroder, jobber, referanse og hjelpesystemer, som har kontaktpunkter på kanten av brikken fire. Brikken leseeh har pogo pinner som kobles med hver av kontaktpunkter. Brikken leseren fungerer som et grensesnitt for sensorgruppen et potensiometer styres av en datamaskin algoritme.
Eksempler på elektrokjemisk sensor strømgjennomgang er vist i figur 3.. Strømmen som går i sensorene er kunstig høy i løpet av de første få sekunder etter amperometrisk måling begynner på grunn av akkumulering av oksydert substrat i løpet av tiden fra påføring av TMB til føleroverflaten å initiere leseren algoritmen. Strømmen kommer raskt en steady state og nøyaktige sensoravlesninger kan sikkert oppnås innen seksti sekunder. Sensor-analyser blir vanligvis utført i duplikat som en intern kontroll for føler variabilitet. Vi har funnet at sensor-to-sensor-variabilitet er forholdsvis konstant, slik at det er mulig å utføre 16 forskjellige sensor-analyser i parallell på de GeneFluidics 16-chip sensor array. Positive og negative kontroller er essenrende. Som en positiv kontroll, inkluderer vi et syntetisk "bridging" DNA-oligonukleotid som hybridiserer til både fange-og detektor-prober, og tjener som en syntetisk mål av kjent konsentrasjon. På denne måten kan resultatene oppnådd ved bruk av brokoblingene oligonukleotid fungerer som en intern kalibrering som minimerer chip-til-chip variasjon.
Ved testing fangst og detektor prober, bør påvisningsgrensen bestemmes ved seriell fortynning av en prøve av kjent konsentrasjon. Som vist i figur 4, er det en log-log lineær korrelasjon mellom prøven konsentrasjon og signalutgang over dynamiske området av analysen. Deteksjonsgrensen er definert som konsentrasjonen av target er nødvendig for å generere et signal som er 3,29 standardavvik større enn den midlere av fem bakgrunnssignaler. For identifisering av bakterier i en ukjent prøve, er et panel av relevant fangst og detektor probe par valgt. Valget av sonder is bestemt av de typer bakterier som mistenkes i en bestemt type prøve. Selvfølgelig kan uvanlige bakterier av og til bli funnet i en hvilken som helst prøve, så anbefales det at en eubakteriell sonde paret bli inkludert som har evne til å hybridisere til rRNA konserverte regioner av eventuelle bakterier. Figur 5 viser representative resultater for prøver som inneholdt E. coli og K. pneumoniae, som ofte finnes i urinen til pasienter med urinveisinfeksjon. Signaler for de fleste av sensorene vil være lav og lignende, og disse negative resultatene kan samles som bakgrunnssignal.
Figur 1. Skjematisk diagram over den elektrokjemiske sensoren analysen. Gullet elektrode er belagt med mercaptohexanol og hexanedithiol og funksjonalisert ved tilsetning av tiolert DNA oligonukleotid capture prober (blå). Sandwich hybridization av målet 16S rRNA med DNA-oligonukleotid capture probe og fluorescein-merket DNA-oligonukleotid-probe detektor (rød), resulterer i et kompleks som er detektert ved tilsetning av anti-fluorescein - pepperrot peroksidase (HRP) konjugat og TMB substrat. Amperometrisk strøm genereres av redoks-syklus som resulterer fra oksydasjonen av TMB med HRP og reduksjon av TMB av elektroner fra elektroden.
Figur 2. . Bakteriell identifikasjon sensorgruppe og chip montere Hver sensor i oppstillingen består av tre elektroder: en sentral arbeidselektrode, en omkrets-referanse-elektrode og en ekstra elektrode for signal stabilisering. De elektroder som arbeider i hver sensor i oppstillingen er funksjonalisert med et panel av prober capture spesifikk for bakterielle arter av interesse (se tabell 3) som vi ll som en EU (eubakteriell) capture sonde som hybridiserer til alle bakterielle 16S rRNA molekyler og en Brol "bygge bro" oligonukleotide som fungerer som positiv kontroll for signal kalibrering. Signal måles ved å plassere array i en chip leseren med Pogo pinner som grensesnitt med sensorelektroden kontaktpunkter.
Figur 3. Amperometrisk strømutgang under målingen. Amperometrisk strøm måles i parallell for alle 16 sensorene i rekken. Strømmen er i utgangspunktet svært negativt på grunn av opphopning av oksidert TMB substrat før du kobler matrisen til chip-leser og starter målingen. Deretter stabiliserer nåværende raskt og sensoravlesninger er bokført til 60 sek. Elektroder med større negativ strøm har de høyeste signaler.
"Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Figur 4. Serial tidoblet utvanning av E. coli for å bestemme grensen for deteksjon. Sensorer ble testet i duplikat med serielle ti ganger fortynninger av en kjent konsentrasjon av E. coli lysatet. De observerte signal opplesninger, plottet som svarte sirkler, ble brukt til å forutsi en idealisert signal kurve. Den oppsamlede standardavvik for alle replikater og bakgrunnssignal ved laveste målkonsentrasjonen ble brukt for å beregne deteksjonsgrensen (blå linje), definert som 3,29 standard avvik over bakgrunnen.
Figur 5. Representative elektrokjemisk sensor analyseresultatene for Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae. E. coli og K. pneumonIAE ble testet for reaktivitet med probe par som er beskrevet i tabell 2 og 3.. Reaktivitet med KE probe paret skiller K. pneumoniae fra E. coli. Forbindelsesdelen oligonucleotide (Brol) fungerer som positiv kontroll og intern kalibrering standard.
| Probe Navn | Ribosomal subenhet og beliggenhet * | Sekvens |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EU Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabell 2. DNA oligonukleotidprobe Pair sekvenser. Capture (Cap) sonder er syntetisert med tiol sammenhengene (S). Detektor (Det) prober er syntetisert med fluorescein (F) modifikasjoner. Merk at probe par innebære enten en 5'-tiolerte fangst sonde og en 3'-fluorescein-modifisert detektor sonde eller en 3'-tiolerte fangst sonde og en 5'-fluorescein-modifisert detektor probe. De to EL capture prober er blandet før bruk. For å forenkle analysen kan detektor-prober bli anvendt for hver sensor som en blanding uten vesentlig kryssreaktivitet. KE - Klebsiella og Enterobacter, EK - E.coli og K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Enterobacteriaceae familien, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubakteriell, Brol - Bridging Oligonucleotide. * - Beliggenhet numbra refererer til avstanden fra starten til 16S eller 23S genet.
| Bakteriearter | Reaktive Probe Pairs |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Enterobacter arter | KE + EB eller EL + EB eller KE + EL + EB |
Tabell 3. Anerkjennelse av bakteriearter ved Probe Pairs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den elektrokjemiske sensoren analysen beskrevet her muliggjør rask deteksjon av nukleinsyre-mål. Sensitivitet og spesifisitet avhenger blant annet av den frie energien av target-probe hybridisering, som igjen avhenger av lengden og GC innholdet på fangst og detektor sonder. Vi utfører vanligvis hybridisering trinn ved romtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Imidlertid kan hybridiserings-fremgangsmåten (3.2 og 3.3) også utføres ved høyere temperaturer i en hybridiserings-ovn hvis brikken er plassert i en dekket kammer som inneholder fuktet filterpapir for å forhindre fordamping 7, 8.. Optimalt signal oppnås med fangst-detektor probe par som hybridiserer til tilstøtende områder på nukleinsyre-målet uten et gap mellom hybridiserings områder 8. Denne forbedring av signal er tenkt å arbeide ved base-par stabling og ved å øke hybridiserings-tilgjengelighet av tilstøtende regioner, kjent som en "hjelper probe"-effekt. Capture-detektor probe hybridisering til tilstøtende områder er også viktig fordi alkalisk lysis av bakteriene resulterer i fragmentering av target rRNA 5.. Denne metoden kan anvendes på deteksjon av enten RNA eller DNA-mål, med en lang rekke kliniske og forskning. For eksempel bør det være mulig å benytte denne metode for å studere cellulære funksjoner som er regulert ved små RNA eller for å påvise antibiotikaresistens genet mål enten som enten DNA eller mRNA. Pre-amplication kan være nødvendig for å oppdage objekter til stede i lave kopi-tall. I tillegg bør RNase inhibitorer tilsettes under tillagingen for å forhindre nedbrytning av potensielt ustabile RNA-mål.
Denne metode har flere fordeler fremfor andre metoder for å detektere og identifisere bakterier. Standard klinisk mikrobiologi metoder krever bakterievekst på agar medium for kvantifisering og anvendelse av identifikasjon metoder. Vekst av bakterier til synlige kolonier involverer vanligvisinkubasjon over natten, betydelig forsinke tiden fra prøvetaking til rapportering av resultater. Det er stor interesse for utviklingen av raskere, molekylære metoder for deteksjon av patogen, inkludert elektrokjemisk biosensorer ni. Imidlertid har lite oppmerksomhet har blitt gitt til utførelsen av DNA biosensorer i rå biologiske prøver. Den elektrokjemiske sensoren analysen beskrevet her kan utføres direkte på serum og urinprøver uten et betydelig tap av følsomhet 7.. Bruken av tiolert capture prober og blandet monolags beskrevet her gjengir føleroverflaten motstandsdyktig til ikke-spesifikt protein absorpsjon, beholder følsomhet i rå biologiske prøver, inkludert serum eller urin 10.. Så få som en bakteriell celle pr sensor (250 bakterier per milliliter) er synlig, er som kan sammenlignes med følsomheten av PCR forsterker teknikker en. Flere PCR baserte bakteriell identifikasjon metoder har blitt beskrevet 11, 12. Selv PCR potensielt kan detektere målmolekyler færre enn den elektrokjemiske sensoren analysen beskrevet her, har PCR-baserte metoder oppnådde begrenset innføringen på grunn av den høye utstyr anskaffelse og / eller reagens kostnader, i forhold til standard kliniske mikrobiologiske metoder. I kontrast, elektrokjemiske sensorer er relativt billig å produsere. Selv om elektrodene er fabrikkert av gull sputtering, mengden av gull per chip er lav fordi elektroden tykkelse er bare 1000 ångstrøm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne er oppfinnerne på patenter som er relevante for de metodene som er beskrevet. En av disse patentene har blitt lisensiert til Qvella Corporation. BMC og DAH har eierandel i Qvella Corporation. VG er president i GeneFluidics, som er produsenten av elektrokjemisk sensor array chip, chip mount og chip leseren beskrevet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av samarbeidsavtale Award AI075565 (til DAH) fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer og ved Wendy og Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC er Judith og Robert Winston Chair i Pediatric Urology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
