Summary
Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.
Abstract
Sensori elettrochimici sono ampiamente utilizzati per la misurazione rapida e accurata del glucosio nel sangue e possono essere adattati per il rilevamento di una grande varietà di analiti. Sensori elettrochimici operano trasducendo un evento di riconoscimento biologico in un segnale elettrico utile. Trasduzione del segnale avviene accoppiando l'attività di un enzima redox a un elettrodo amperometrico. Sensore specificità è o una caratteristica inerente l'enzima, glucosio ossidasi nel caso di un sensore di glucosio, o un prodotto di legame tra l'enzima ed un anticorpo o sonda.
Qui, descriviamo un metodo di saggio sensore elettrochimico per rilevare direttamente e identificare i batteri. In ogni caso, le sonde descritte qui sono oligonucleotidi di DNA. Questo metodo si basa sul panino ibridazione di catturare ed identificare sonde con bersaglio RNA ribosomiale (rRNA). La sonda di cattura è ancorata alla superficie del sensore, mentre la sonda rivelatore è legata horseradish perossidasi (HRP). Quando un substrato quale 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) è aggiunto ad un elettrodo con complessi di cattura-target-rivelatore legati alla sua superficie, il substrato viene ossidato da HRP e ridotto l'elettrodo di lavoro. Questo redox ciclo sono presenti spola di elettroni da parte del substrato dall'elettrodo a HRP, producendo flusso di corrente nel dell'elettrodo.
Introduction
Usando rRNA come molecola bersaglio per il rilevamento e l'identificazione batterica ha una serie di vantaggi. L'abbondanza di rRNA in cellule batteriche prevede un limite di sensibilità a partire da 250 batteri per ml senza la necessità di amplificazione del target 1. RRNA batterico contiene uniche sequenze specie-specifici che sono accessibili a ibridazione con sonde di DNA. Di conseguenza, un array di sensori elettrochimici può essere utilizzato per identificare batteri sconosciuti, dove ogni sensore è funzionalizzato con un diverso sonda di cattura specie-specifica. Sensori di controlli positivi devono essere inclusi per un target oligonucleotide sintetico che "ponti" la cattura e sonde rivelatore per creare un segnale di calibrazione interno.
Sensori elettrochimici hanno una vasta gamma di applicazioni di ricerca di base e traslazionale. Per esempio, il saggio qui descritto è stato usato per misurare con precisione l'effetto di E. coli fase di crescita su RRNA e numero di copie pre-rRNA, che è di grande interesse per i ricercatori interessati alla fisiologia dei batteri 2. La sensibilità del saggio sensore elettrochimico è determinato dal rapporto segnale-rumore. Una varietà di amplificazione del segnale e di metodi di riduzione del rumore sono stati esplorati. Troviamo che migliorando la chimica della superficie del sensore è fondamentale per ridurre il legame non specifico della sonda rivelatore e / o enzima HRP. In particolare, un monostrato misto di alkanedithiols e mercaptohexanol è stato trovato per ridurre sfondo coprendo la superficie dell'elettrodo più completamente mantenendo accessibilità della sonda di cattura per bersaglio ibridazione 3. Questi trattamenti chimici superficiali sono particolarmente importanti per saggi con campioni biologici complessi.
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Protocol
1. Funzionalizzazione di Sensori elettrochimici
- Preparare la sonda di cattura tiolato ad una concentrazione di 0,05 pM a 300 pM 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min . Incubazione della sonda di cattura tiolato con HDT assicura che il gruppo tiolo sulla sonda di cattura è ridotto, con conseguente risultati più coerenti.
- Applicare una corrente di azoto a nudo oro 16 chip di array di sensori (s) per 5 secondi per rimuovere l'umidità e / o particolati.
- Applicare 6 microlitri della HDT-tiolato mix sonda di cattura per l'elettrodo di lavoro di tutti i 16 sensori della matrice di sensori e memorizzare il chip sensore (s) in una capsula di Petri coperta a 4 ° C durante la notte. Sonde di cattura tiolati legano direttamente l'elettrodo d'oro nudo e la HDT atti a prevenire addensamento delle sonde di cattura e di tenerli in una conformazione estesa che promuove l'ibridazione con il target.
- Glidopo giorno, lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
- Applicare 6 pl di 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-esanolo (MCH) per l'elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 50 min. Questa e tutte le successive fasi di incubazione chip del sensore vengono eseguiti in una capsula di Petri coperto a temperatura ambiente. MCH agisce come un agente bloccante, riempiendo tutti gli spazi in cui la sonda di cattura o tiolato HDT non è presente sulla superficie dell'elettrodo.
2. Preparazione del campione
- Trasferire 1 ml di coltura batterica in fase logaritmica di crescita (OD 600 ≈ 0,1) in una provetta e centrifugare a 16.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante cultura. Il pellet batterico può essere elaborata immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso successivo.
- Accuratamente risospendere il pellet batterico in 10 ml di 1 M di NaOH applicando la punta della pipetta al bottom della provetta e pipettando su e giù diverse volte. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 5 min.
- Neutralizzare il lisato batterico aggiungendo 50 ml di 1 M di tampone fosfato, pH 7,2, contenente 2,5% di sieroalbumina bovina (BSA) e 0,25 mM di una sonda rivelatore fluoresceina modificata. Incubare il lisato neutralizzato per 10 min a temperatura ambiente. Sonde rivelatore fluoresceina modificati ibridano con rRNA batterici molecole bersaglio.
3. Sensore elettrochimico Assay
- Lavare il MCH dal chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
- Applicare 4 microlitri di lisato batterico neutralizzato per l'elettrodo di lavoro di ciascuno dei 14 sensori e incubare per 15 min. Obiettivo-detector complessi sonda ibridano per sonde di cattura tiolati immobilizzati.
- Applicare 4 microlitri di 1 nm ponte oligonucleotide in 1 M tampone fosfato, pH 7.2, contenente 2.5% BSA e 0.25 &mu, M sonda rivelatore fluoresceina-modificato a 2 sensori di controllo positivo (utilizzati per la normalizzazione del segnale) e incubare per 15 min.
- Lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
- Applicare 4 pl di 0,5 U / ml di anti-fluoresceina-HRP 1 M in tampone fosfato, pH 7,2, contenente 0,5% di caseina per l'elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 15 min. L'anti-fluoresceina-HRP si lega alle sonde rivelatore fluoresceina modificati immobilizzati.
- Lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
- Applicare un film ben adesivo alla superficie del chip del sensore e del carico nel supporto chip del sensore. Pipettare 50 ml di substrato TMB su tutti i 16 sensori e chiudere il monte chip del sensore.
- Ottenere amperometria e misure di voltammetria ciclica per tutti i 16 sensori che utilizzano la Helios Reader Chip. Corrente amperometrica è proporzionale al tasso di TMB reduction sulla superficie del sensore (vedi Figura 1).
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Representative Results
Descriviamo un saggio elettrochimico che è strutturato in modo simile a un sandwich ELISA. Come mostrato in Figura 1, l'RNA bersaglio ribosomiale (rRNA) ibridazione con sonde di cattura e rivelatore è sviluppato da una reazione redox catalizzata dalla HRP coniugato frammenti anticorpali anti-fluoresceina che legano il collegamento 3 'fluoresceina sulla sonda rivelatore. Una componente importante di sensibilità del test è la chimica di superficie dell'elettrodo oro. Abbiamo trovato che un monostrato ternario costituito da sonde tiolate cattura, mercaptohexanol e hexanedithiol migliora significativamente il rapporto segnale-rumore riducendo legame non specifico della proteina reporter di fondo 3. I saggi qui descritti impiegare un GeneFluidics 16 chip di array di sensori mostrato in Figura 2. Ciascuno dei sensori nell'array contengono tre elettrodi, di lavoro, di riferimento e ausiliari, che hanno punti di contatto sul bordo del chip 4. Il chip leggereer ha perni pogo che si collegano con ciascuno dei punti di contatto. Il lettore di chip funge da interfaccia per la matrice di sensore con un potenziometro controllato da un algoritmo informatico.
Esempi di sensore elettrochimico flusso di corrente sono mostrati in Figura 3. Flusso di corrente nei sensori è artificialmente alto durante i primi secondi dopo misurazioni amperometriche cominciano a causa dell'accumulo di substrato ossidato durante il tempo di applicazione del TMB alla superficie del sensore per avviare l'algoritmo lettore. Il flusso di corrente raggiunge velocemente uno stato stazionario e letture del sensore accurate può attendibilmente essere ottenuto entro 60 secondi. Saggi di sensori sono in genere eseguiti in duplicato come controllo interno per il sensore variabilità. Abbiamo scoperto che sensore-sensore variabilità è relativamente costante, per cui è possibile eseguire 16 differenti dosaggi di sensori in parallelo sul circuito integrato GeneFluidics matrice 16-sensore. I controlli positivi e negativi sono Essenziale. Come controllo positivo, includiamo un "ponte" oligonucleotide sintetico DNA che ibridizza sia la cattura e sonde rivelatore e serve come bersaglio sintetica di concentrazione nota. In questo modo, i risultati ottenuti utilizzando le funzioni oligonucleotidiche bridging come controllo calibrazione interna per minimizzare variazione chip-to-chip.
Durante il test cattura e sonde di rivelazione, il limite di rilevazione deve essere determinata mediante diluizione seriale di un campione a concentrazione nota. Come mostrato in figura 4, vi è una correlazione lineare tra il log-log concentrazione del campione e uscita del segnale per il range dinamico del dosaggio. Il limite di rilevamento è definito come la concentrazione del target richiesto per generare un segnale che è 3,29 deviazioni standard superiore alla media dei segnali di fondo 5. Per l'identificazione di batteri in un campione sconosciuto, un panel di rilevante cattura e coppie di sonde rivelatori vengono selezionati. La scelta di sonde is determinata dai tipi di batteri sospetti in un particolare tipo di campione. Naturalmente, i batteri inusuali può essere presenti in ogni campione, quindi si raccomanda che una coppia sonda eubatterica essere incluso che ha la capacità di ibridare a regioni rRNA conservate di tutti i batteri. Figura 5 mostra i risultati rappresentativi per i campioni contenenti E. coli e K. pneumoniae, che sono spesso trovato nelle urine di pazienti con infezione del tratto urinario. Segnali per la maggior parte dei sensori sarà bassa e simile, e questi risultati negativi possono essere messe in comune, come il segnale di fondo.
Figura 1. Rappresentazione schematica del saggio sensore elettrochimico. L'elettrodo è rivestita con oro e mercaptohexanol hexanedithiol e funzionalizzato mediante aggiunta di tiolate DNA oligonucleotide sonde di cattura (blu). Sandwich hybridization del bersaglio 16S rRNA con l'oligonucleotide sonda di cattura del DNA e DNA marcato con fluoresceina oligonucleotide sonda rivelatore (rosso), si traduce in un complesso che viene rilevata mediante aggiunta di anti-fluoresceina - perossidasi di rafano (HRP) e substrato TMB. Corrente amperometrico è generato dal ciclo redox che deriva dalla ossidazione di TMB HRP e dalla riduzione del TMB da elettroni dall'elettrodo.
Figura 2. . Batterica array di sensori di identificazione e di montaggio di chip Ogni sensore nel campo si compone di tre elettrodi: un elettrodo di lavoro centrale, un elettrodo di riferimento circonferenziale ed un elettrodo ausiliario per la stabilizzazione del segnale. Gli elettrodi di lavoro di ciascun sensore nella matrice vengono funzionalizzati con un gruppo di sonde di cattura specifico per la specie batteriche di interesse (vedere Tabella 3), come abbiamo ll come una sonda di cattura UE (eubatterica) che si ibrida con tutte le molecole di rRNA 16S batteriche e un Brol oligonucleotide "ponte" che funziona come controllo positivo per la calibrazione del segnale. Segnale viene misurato collocando la matrice in un lettore di chip con piedini pogo che si interfacciano con i punti di contatto degli elettrodi del sensore.
Figura 3. Uscita corrente amperometrica durante la misurazione. Corrente amperometrico è misurato in parallelo per tutti i 16 sensori dell'array. Il flusso di corrente è inizialmente estremamente negativo a causa dell'accumulo di ossidato substrato TMB prima di collegare la matrice al lettore di chip e partenza misurazione. Successivamente, la corrente si stabilizza rapidamente e letture del sensore sono registrati a 60 sec. Elettrodi con maggiore corrente negativa hanno i segnali più alti.
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Figura 4. Serial dieci volte diluizione di E. coli per determinare il limite di rilevazione. sensori sono stati testati in doppio con seriali dieci volte diluizioni di una concentrazione nota di E. coli lisato. Le letture dei segnali osservati, tracciati come cerchi neri, sono stati usati per predire una curva segnale idealizzato. La deviazione standard aggregata per tutte le repliche e il segnale di fondo alla concentrazione destinazione inferiore sono stati utilizzati per calcolare il limite di rilevazione (linea blu), definita come 3.29 deviazioni standard su sfondo.
Figura 5. Rappresentante sensore elettrochimico risultati del test per Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. E. coli e K. pneumonIAE stati testati per la reattività con coppie di sonde descritte nelle tabelle 2 e 3. Reattività con la coppia sonda KE distingue K. pneumoniae da E. coli. L'oligonucleotide bridging (Brol) serve come controllo positivo e standard di calibrazione interno.
| Nome Probe | Subunità ribosomiale e Località * | Sequenza |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| UE GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| UE Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| UE Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabella 2. DNA Sequenze oligonucleotidiche coppia di sonde. Capture sonde (PAC) sono sintetizzati con collegamenti con tiolo (S). Rivelatore di sonde (Det) sono sintetizzati con fluoresceina (F) modifiche. Si noti che le coppie di sonde coinvolgono sia una sonda 5'-tiolato cattura e una sonda rivelatore 3'-fluoresceina-modificato oppure una sonda di cattura 3'-tiolato e una sonda rivelatore 5'-fluoresceina-modificato. Le due sonde di cattura EL sono miscelati prima dell'uso. Per semplificare l'analisi, sonde rivelatore possono essere applicati ad ogni sensore come miscela senza significativa reattività crociata. KE - Klebsiella e Enterobacter, EK - E. coli e K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Enterobacteriaceae famiglia, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, UE - eubatterica, Brol - Bridging oligonucleotidi. * - Posizione numero riferisce alla distanza dall'inizio del 16S o 23S gene.
| Specie batteriche | Pairs Probe reattivi |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Specie Enterobacter | KE + EB o EL + EB o KE + EL + EB |
Tabella 3. Riconoscimento delle specie batteriche da Pairs Sonda.
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Discussion
Il test del sensore elettrochimico qui descritto consente una rapida individuazione di obiettivi di acidi nucleici. Sensibilità e specificità dipendono in parte l'energia libera di ibridazione sonda-bersaglio, che a sua volta dipende dalla lunghezza e il contenuto di GC della cattura e sonde rivelatore. Noi di solito eseguire i passaggi di ibridazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) 5, 6. Tuttavia, la procedura di ibridazione (3.2 e 3.3) possono essere eseguite anche a temperature più elevate in un fornetto se il chip è posto in una camera contenente coperto inumiditi carta da filtro per evitare l'evaporazione 7, 8. Ottimale del segnale è ottenuto con coppie sonda di cattura-rivelatore che ibridano a siti adiacenti sul acido nucleico bersaglio senza un gap tra i siti di ibridazione 8. Questo miglioramento segnale è pensato di lavoro coppia di basi impilamento e aumentando ibridazione accessibilità delle regioni adiacenti, noto come effetto "helper probe". Capture-detector probe ibridazione a siti adiacenti è importante anche perché lisi alcalina dei risultati di batteri nella frammentazione del bersaglio rRNA 5. Questo metodo può essere applicato a rilevamento di RNA o DNA target, con una grande varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. Ad esempio, dovrebbe essere possibile usare questo metodo per studiare le funzioni cellulari che sono regolati da piccoli RNA o di rilevare target gene di resistenza agli antibiotici o come DNA o mRNA. Pre-amplificazione può essere necessario rilevare bersagli presenti a basso numero di copie. Inoltre, dovrebbero essere aggiunti inibitori RNAsi durante la preparazione del campione per prevenire il degrado di obiettivi potenzialmente instabili RNA.
Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi per rilevare e identificare i batteri. Standard per i metodi di microbiologia clinica richiedono la crescita batterica su agar per la quantificazione e l'applicazione di metodi di identificazione. La crescita dei batteri di colonie visibili in genere comportadurante la notte di incubazione, ritardando in modo significativo il tempo di raccolta dei campioni per la rappresentazione dei risultati. C'è grande interesse per lo sviluppo di più rapidi, metodi molecolari di agenti patogeni, inclusi biosensori elettrochimici 9. Tuttavia, poca attenzione è stata data al rendimento di biosensori DNA in campioni biologici prime. Il saggio sensore elettrochimico qui descritta può essere eseguita direttamente su campioni di siero e nell'urina senza una significativa perdita di sensibilità 7. L'uso di sonde di cattura tiolate e il monostrato misto descritto qui rende la superficie del sensore resistente a non specifico assorbimento di proteine, mantenendo sensibilità in campioni biologici prime compreso siero o urina 10. Da un minimo di 1 cellula batterica per sensore (250 batteri per ml) sono rilevabili, che è paragonabile alla sensibilità delle tecniche di amplificazione PCR 1. Diversi metodi di identificazione batterica basati sulla PCR sono stati descritti 11, 12. Sebbene PCR può potenzialmente meno rilevare molecole bersaglio rispetto all'analisi sensore elettrochimico descritto qui, i metodi basati sulla PCR hanno raggiunto adozione limitato a causa della elevata acquisizione attrezzature e / o costi di reagenti, rispetto a metodi microbiologici cliniche standard. In contrasto, i sensori elettrochimici sono relativamente poco costosi da produrre. Anche se gli elettrodi sono fabbricati da oro sputtering, la quantità di oro per chip è bassa perché lo spessore dell'elettrodo è solo 1.000 Angstrom.
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Disclosures
Tutti gli autori sono gli inventori di brevetti relativi ai metodi descritti. Uno di questi brevetti è stato concesso in licenza a Qvella Corporation. BMC e DAH hanno partecipazione in Qvella Corporation. VG è il Presidente della GeneFluidics, che è il produttore del chip matrice di sensori elettrochimici, montaggio di chip, e lettore di chip descritto in questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da Cooperativa accordo Award AI075565 (a DAH) presso l'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive e da Wendy e Ken Fondo Rubino per l'Eccellenza in Pediatric Urology Research. BMC è la Giuditta e Robert Winston Cattedra di Urologia Pediatrica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
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