Summary
Metoden er beskrevet isolering og karakterisering av menneskelig tannpulpa stamceller (hDPSCs) ved hjelp av enten
Abstract
Introduction
Stamceller er clonogenic celler som besitter to bemerkelsesverdige funksjoner, kjent som multi-styrke og selvfornyelse 15. Blant alle stamceller med ulike replicative potencies, har dental stamceller som de postnatal stamceller trukket oppmerksomhet de siste årene på grunn av sin tilgjengelighet, plastisitet, og høy proliferativ evne sammenlignet med andre voksne stamceller 16. Karakteristisk, ligner på stamceller, dental pulp stamceller er adherente clonogenic celler som har multippel differensiering kapasitet inn mesenchyme og / eller ikke-mesenchyme linjene, både in vitro og in vivo. 1-8,17,18 DPSCs identifiseres ved deres negative uttrykk for blodkreft antigener (f.eks CD45, CD34, CD14), og positive uttrykk for CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 og STRO-1. 19,20
Enkel innhentet potensial med minimum smerte og sykelighet gjør menneskelige DPSCs som verdifullestand kilde MSCS forhold til ordinær kilder, for eksempel benmarg stamceller 21. Generelt har DPSCs blitt isolert ved enten utvekst metode, dvs. migrering av stamceller fra pulpavevet eksplanter (DPSC-OG) 22-24, og / eller ved enzymatisk fordøyelse (DPSC-ED) 4,6,25. Tidligere studier har vist at den isolasjon metoden og dyrkningsbetingelser kan indusere forskjellige populasjoner eller linjene under i vitro passasjer 26,27. I tilfelle av permanente tenner (pDPSCs), avslørte Huang et al at enzymatiske fordøyd pDPSCs har høyere spredning potensiale sammenlignet med de vokst DPSCs. 26 Videre, i tilfelle av melketenner (dDPSCs), ble det vist at STRO-1 & CD34 markører uttrykkes mer i dDPSC-ED sammenlignet med dDPSC-OG. I tillegg, viste dDPSC-ED høyere mineralisering rate i definerte osteo / odonto medium. 27 Derfor, på grunn av den enestående potensialet DPSCs i regenerative medisin, vil flere studier være nødvendig for bedre forståelse av mulige ulike populasjoner som er utledet fra ulike isolasjon metoder.
Her var det forsøk på å innføre enkel måte papirmasse ekstraksjon, ved å bruke en-trinns dental diamant disk å forenkle prosessen med papirmasse utvinning. Dessuten, etter isolering av humane papirmasse-avledede stamceller ved å bruke ED eller OG metoder ble generelle egenskaper og differensiering kapasitet mellom to grupper også undersøkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Enzyme Solution og spredning Medium (PM)
- Merke collagenase Type I Løsning: Vei opp kollagenase type I (12 mg / ml) og oppløses i 1 ml PBS og filteret med en 0,2 um sprøytefilter. Deretter plasserer den 15 ml tube og holde det ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Merke dispase Løsning: Vei opp dispase (16 mg / ml) og oppløses i 1 ml PBS og filteret med en 0,2 um sprøytefilter. Deretter plasserer den 15 ml tube og holde den ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Merke enzymoppløsning: Tilsett 1 ml collagenase type I løsninger (12 mg / ml) og 1 ml dispase løsninger (16 mg / ml) i 2 ml sterilt PBS inneholdende 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin. Totale konsentrasjonen av dispase og kollagenase I i sluttvolum bør være 4 mg / ml og 3 mg / ml, receptively. Deretter, alikvoter dette volumet i til fire 15 ml rør, hver inneholdende 1 ml enzymoppløsning. Hvert rør kan brukes for en papirmasse fordøyelsen.
- Gjøre vask: Tilsett 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin i PBS.
- Merke basismediene Alpha modifikasjon av Eagles medium (α-MEM) supplert med 10% FBS og 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin.
- Gjør spredningssikkerhet Media (PM), Alpha modifikasjon av Eagles medium (α-MEM) supplert med 10% FBS, 100 uM L-askorbinsyre 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,25 mg / ml amfotericin B.
- Merke Odontogenic medier: Alpha modifikasjon av Eagles medium (α-MEM) supplert med 10% FBS, 100 uM L-askorbinsyre 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,01 uM deksametason, 5 mM β-glycerol-fosfat, 1,8 mM Monokaliumfosfat.
2. Forbered Menneskelig Dental pulpavevet for Dental Pulp Stem Cell Isolation
- Normale menneskelige tredje jekslene ble samlet inn fra voksne (21-29 år) ved tannklinikken av Imam Ali under godkjente Institutional Review Board (IRB).
- Tennene ble plassert inn i den basisk medium (α-MEM supplert med 10% FBS) og ble overført til laboratorium ved 4 ° C.
- Under sterile, arbeider innenfor et biologisk laminær hette, set-up ble gjort en 100 mm petriskåler for hver tann som skal behandles. Tannoverflatene ble renset ved 70% etanol.
- Mens arbeider i et av de Petri-retter, ble tann holdt av dental pinsett og en skalpell blad ble brukt til å rense ut rusk og periodontal ligament på røttene.
- Cemento-emalje krysset ble sakte skåret ved hjelp sterilisert dental plate å avsløre pulpa. Det bør tas i betraktning at skjæreprosessen må utføres langsomt for å redusere overoppvarming av dental vev.
- Pulpavevet ble forsiktig separert fra kronen og roten. Pulpavevet ble skåret i små stykker ved hjelp av en skalpell blad.
3. Menneskelig Dental Pulp Isolation
- Pulp vev gjennomgikk enten enzymatisk dissosiasjon av pulpavevet eller direkte celleutvekst fra pulpavevet explants for isolering av hDPSCs.
- Enzymatisk dissosiasjon av pulpavevet:
- Små biter av pulp vev ble overført til enzymoppløsning i 1 time ved 37 ° C. Vortex hvert 30 min for å hjelpe bryte opp vev.
- Etterpå ble store celleaggregatene fjernet og Single-cellesuspensjoner ble resultatet av at cellene gjennom en 70-iM celle sil.
- Single-cellesuspensjoner ble sentrifugert ved 1200 rpm i 5 min ved romtemperatur.
- Supernatanter ble nøye pipettert av og pelleten ble re-suspendert i 1 ml medium proliferasjon (PM). (Merk: FBS i spredning medium avslutte enzymatisk disAssociation.)
- Encellede suspensjoner av tannpulpa ble podet inn i 25 cm 2 kultur kolbe med PM og deretter inkubert ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Kulturmediet ble endret hver tredje dag til cellen sammenflyting ble oppnådd.
- Direkte celleutvekst fra pulpavevet explants:
- Pulpavevet ble hakket i 1-2-mm fragmenter, og hver brikke ble plassert i 25-cm 2 kultur kolber med PM og deretter inkubert ved 37 ° C i 5% CO 2. Det bør tas i betraktning at den totale volum av PM for utvekst av cellen må støtte festing av pulp stykker for ytterligere celleutvekst (2-3 ml pr kolbe).
- Medium ble endret etter utvekst ble observert.
- De outgrown cellene ved samløpet var sub-dyrket ved forholdet 1:4 (passasje 1).
4. Immunfenotyping
- 250000 celler /tube av begge typer celler i passasjen 3 ble inkubert ved PE eller FITC-konjugerte anti-humane antistoffer med sine isotyper i 30 minutter ved 4 ° C i mørkt sted. (Merk:. Konsentrasjonen av antistoffer ble brukt i henhold til fremstillingen protokollen)
- Etter inkubasjonstiden ble 100 ul PBS eller FACS fortynning tilsatt til hvert rør og sentrifugert ved 1200 opm i 5 min i mørkt sted.
- Supernatanter ble fjernet og pellets ble resuspendert i 100 pl PBS eller FACS fortynning i mørkt sted.
- Målrettet overflate markører (CD markører) ble evaluert av BD FACSCalibur.
5. Induksjon av Differensiering av DPSCs inn mineralisert Cells & kvantifiserte Alizarin Red S Assay
- DPSCs som ble innhentet ved enten enzymatisk dissosiasjon av pulpavevet (kjent som DPSC-ED) eller direkte celleutvekst fra pulpavevet explants (DPSC-OG) var sub-kultivert for 3 passeringer.
- At Passage 3 ble cellene frø i en 6 brønners plate ved 5000 celle / brønn.
- Ved sammenløpet av 60%, ble odontogenic medium erstattet med konvensjonell PM. Tre brønner ble forble som en negativ kontroll ved tilsetning vekstmedium.
- Medium endre hver 3 dager før dag 21.
- På dag 21, ble cellene vasket med PBS, og ble løst av 1 ml / brønn 10% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
- Deretter paraformaldehyd ble pipettert av, forsiktig og celler ble vasket 3 ganger (5-10 min for hver gang) med destillert H 2 O. (Merk: Unngå å forstyrre monolayer.)
- Etter vasking, ble 1 ml / brønn Alizarin rødt S lagt i 20 min ved romtemperatur.
- Celler ble vasket med avionisert H 2 O fire ganger (5 min hver gang med milde rocking) for å fjerne ytterligere Alizarin rød.
- 1 ml / brønn H 2 O ble tilsatt for å hindre at cellene fra tørking.
- Platene ble antatt å visuelle inspection og / eller bildeopptak.
- For Alizarin Red S kvantifisering analyse ble H 2 O erstattes av 1 ml 10% eddiksyre til hver brønn av seks-brønners plate og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med risting.
- Deretter var celle monolag / brønn skrape & begge eddiksyre & celler ble overført til separate 1,5 ml mikro-sentrifugerør. (Merk:. Hver brønn bør være overføring til en egen tube dvs. tre testbrønner og tre kontroll brønner for hver ED & OG grupper)
- Rør ble virvlet kraftig i 30 sek.
- Varm opp til 85 ° C i 10 min. (Merk: For å unngå fordampning, ble rør forseglet med parafilm.)
- Etter oppvarming, ble rør overført til is i 5 min. (Merk: Slanger bør ikke åpnes før blitt avkjølt.)
- De oppslemminger ble sentrifugert ved 20.000 xg i 15 min. Mens sentrifugering ble Alizarin Red standarder lagetopp.
Alizarin Red S standard ble fremstilt ved først å fortynne fortynningsbuffer & brukt for å lage 2-fold seriefortynninger basert på tabellen.
| High Range konsentrasjon av fargestoff | Lav Range konsentrasjon av fargestoff | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 pM | 250 pM | 125 pM | 62,5 pM | 31,3 pM | 15,6 pM | 7,8 pM | 3,9 pM | 1,9 pM | 0,9 pM | 0,4 pM | Blank |
- Etter sentrifugering, ble 1 ml av supernatanten / rør overført til nye separate 1,5 ml mikro-sentrifugerør.
- PH ble nøytralisert med ~ 375 pl 10% Ammoniumhydroksyd per rør. (Merk: pH raseri bør være 04.01 til 04.05.)
- 150 ul standard & prøver (omfatter separate tester og kontroller) ble tilsatt inn i en ugjennomsiktig vegger, gjennomsiktig bunn 96-brønns plate.
- Absorbansen ble lest ved 405 nm og OD verdier fra prøvene ble sammenlignet med standard tomt for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- DPSCs som ble innhentet ved enzymatisk dissosiasjon (DPSC-ED) er vist her på 10 dag, 15,18 (figur 1). Koloniene iverksatt for å danne på nesten 3 til 5 dager etter isolasjon.
- Outgrown DPSCs (DPSC-OG) er vist i figur 2 på 5 dag, 10, 13 & 18. Fibroblast-lignende celler begynte å migrere fra pulpavevet i flaska ved parallelle bestilling av nesten 5 dager etter såing.
- DPSCs på passasjen 3 med begge metoder er vist i figur 3.. Begge typer DPSCs var nesten i samme størrelse og morfologi.
- Immunophenotyping resultater i DPSC-ED og DPSC-OG (figur 4). Disse resultatene indikerte tilstedeværelse av mesenchymale stilk cellens markører som CD44, CD73, CD105 & CD90, og fraværet av hematopoetiske & endotelisk markører som CD34, CD45 og CD11b . Uttrykk for CD105 & CD146 (perivaskulær markør) var mer i DPSC-OL i sammenligning med DPSC-ED.STRO-1 var negativ i begge gruppene. (Blå streker henvist til OG gruppen, mens røde linjer nevnt ED en, gule linjer indikerte isotyper.)
- Alizarin Red S morfologi & kvantifisering resultater for evaluering av mineralisert vev formasjonen i DPSC-ED og DPSC-OG på dag 21 er vist i Figur 5. Jo mer absorberende røde farge mer kalsium deponering. Disse resultatene indikerer mer kalsium deponering i differensiert DPSC-ED (d) sammenlignet med DPSC-OG (c). (Triplikat tekniske replications) kvantifisering av Alizarin Red S også indikerte signifikant (*) høyere konsentrasjon av fargestoff mellom DPSC-ED sammenlignet med OG grupper. (Dye konsentrasjon også økt betydelig (**, ***) mellom testene og kontroller av hver gruppe (ED eller OG) som er angitt på kalsium deponering etter differensiering prosessen)
(NB: En paret t-test-analyse ble brukt for å bestemme forskjellene imengden mineralisert Slimet ED og OG grupper etter induksjon av differensiering. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (Betydning antatt for P <0,05)
- QPCR resultater for ekspresjon av odontoblast og mineralisert-relaterte gener (DSPP) og (MEPE, ALP) henholdsvis, i differensiert DPSC-ED & DPSC-OG er vist i Figur 6. Disse resultatene indikerte betydelig opp-regulering av ALP & MEPE etter differensiering av ED og OG grupper. I mellomtiden var ALP og MEPE uttrykk betydelig høyere i differensiert DPSC-ED forhold til den differensierte DPSC-OG. Imidlertid, er det ingen forskjell i uttrykket av DSPP i differensierte celler mellom begge gruppene (husholdningsgenet: Tyrosin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooksygenase aktivering protein (YWHAZ)). 28
(Merk:. Den qPCR data ble analysert ved hjelp av den komparative CT metode A pa IRED t-test-analyse ble brukt for å bestemme forskjellene i genekspresjon mellom ED & OG grupper før og etter differensiering, og også mellom differensierte celler av to grupper. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (Betydning antatt for P <0,05) (Triplikat tekniske replications)
Figur 1. Enzymatisk dissosiert DPSC (DPSC-ED) på 10 dag, 15 & 18 år. Forstørrelse bar = 200 mikrometer.
Figur 2. Outgrown DPSCs (DPSC-OG) på 5 dag, 10, 13 og 18.. Forstørrelse bar = 200 mikrometer.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Vokst DPSCs (DPSC-OG) og enzymatiske fordøyd DPSCs (DPSC-ED) morfologi i passasjen 3. Forstørrelse bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Kledde Histogram av immunfenotyping resultater i DPSC-ED (mørk rød) og DPSC-OG (blå). (Gule linjer representerer isotyper). Klikk her for å se større figur .
hres.jpg "/>
Figur 5. Alizarin Red S farging gir differensiert DPSC-OG (c), og differensiert DPSC-ED (d). (A) og (b) som er nevnt med kontrollene. Kvantifisering av Alizarin Red S analysen viser mer fargestoff absorpsjon i differensiert DPSC-ED forhold til den differensierte OG gruppen (e). Klikk her for å se større figur .
Figur 6. QPCR resultatene av uttrykk for odontoblast og mineralisert-relaterte gener (DSPP) og (MEPE, ALP) henholdsvis i differensiert DPSC-ED & DPSC-OG. Uttrykket av MEPE, ALP, og DSPP i differensierte celler i forhold til kontroll bekreftet differensiering av begge grupper i odontoblast (ac). Disse results indikerte betydelig oppregulering av ALP & MEPE etter differensiering av ED og OG grupper (a & b). I mellomtiden var ALP og MEPE uttrykk betydelig høyere i differensiert DPSC-ED forhold til den differensierte DPSC-OG (a & b). Det er imidlertid ingen forskjell i uttrykket av DSPP i differensierte celler i begge gruppene (c) (husholdningsgenet: Tyrosin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooksygenase aktivering protein, YWHAZ). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver prosessen med isolering og karakterisering av hDPSCs fra tannpulpa ved hjelp av to metoder, enzymatisk dissosiasjon og direkte resultat av stamceller fra pulpavevet explants. I tillegg, i vitro differensiering av disse cellene til odontoblaster, ble vurdert av kvantitativ Alizarin Red S analysen & QPCR.
Eksisterende protokoller for å isolere pulpavevet fra menneskelig tann hadde blitt brukt ulike instrumenter som tang (bein tang) 9, utryddelsen 29 nål, Gracey curette 30, dental fissure burs 4, etc. Disse metodene er tidkrevende, mens vurderer lavt overoppheting av papirmasse ved å tilsette vann kontinuerlig. Imidlertid, i dagens teknikk, er dental diamant plate som brukes for isolering av papirmasse vev, som er en rask måte å kutte tann med minimum forurensning i ett-trinns prosess, og minimerer overoppheting av papirmasse under en kapping. Videre hDPSCs enre endelig differensiert i odontoblaster som aldri har blitt sammenlignet i tilfelle av menneskelige permanente tenner ved diskutert mål. Sammenlignende vurdering av differensierte hDPSCs (ED & OG grupper) av kvantitativ Alizarin Red S analysen indikerte høyere mineralisering potensialet hDPSC-ED sammenlignet med OG gruppen. Disse resultatene bekreftes også av QPCR. DSPP, ALP og MEPE som mineraliseringen markører oppregulert etter odontoblast differensiering i begge gruppene. På den annen side, var uttrykkene MEPE & ALP høyere i differensiert hDPSC-ED i forhold til kontrollen. Etter avtale med forrige undersøkelse om melketenner 27, stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av ED eller OG isolasjon metoder også viser lignende differensiering atferd under de samme forhold. Videre, for bedre sammenlignende evaluering, i denne studien ble både hDPSC-ED & hDPSC-OG isolert fra de samme individene.
Uttrykk for MSC markører end. fravær av heamatopietic / endotelisk markører identifiserer begge typer hDPSCs som stamceller. På den annen side, var CD 105 / CD 146 høyere i DPSC-OG forhold til ED gruppene. Til tross for den eksisterende bevis henhold til tilstedeværelsen av STRO-1 i DPSCs 31, viste våre resultater ikke uttrykk for STRO-1 i begge gruppene. Kan imidlertid betydelig mangfold i overflaten markør uttrykk i ulike studier være grunn til enten vekstbetingelsene som passasje antall, sammensetning av medier, etc. eller interindividuelle variasjoner mellom ulike givere. Fraværet av STRO-1 i begge gruppene kan indikere at uttrykket av denne markøren ikke kan direkte påvirke odontoblast differensiering potensial (ikke vist i video).
Forskjellige hDPSCs isolasjon tilstand kan bringe annerledes differensiering kapasitet. Disse forskjellene kan skyldes eksistensen av forskjellige populasjoner i pulpavevet. Dermed velger isolasjon metoder might være nyttig for målrettet-vev bestemt reparasjon og regenerering for fremtidige kliniske tilnærminger. Våre resultater indikerte høyere mineralisering kapasiteten enzymatisk digestert DPSC forhold til outgrown seg. Imidlertid er ytterligere studier, som ved vurdering av dannelsen av rørformede struktur in vivo & in vitro, som kreves for å bestemme hvilken av disse to prosedyrer som gjelder for funksjonell dentin / pulpavevet regenerering terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takknemlig erkjenne Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei for sin kritiske diskos og Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif for hans tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al.
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
