Summary
Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere species
Abstract
Mucosale oppervlakken, ook in de gastro-intestinale, urogenitale en luchtwegen, bieden portals van binnenkomst voor ziekteverwekkers, zoals virussen en bacteriën 1. Slijmvliezen ook inductieve sites in de gastheer immuniteit tegen pathogenen, zoals de Peyers vlekken in het darmkanaal en de neus-geassocieerde lymforeticulair weefsel in de luchtwegen te genereren. Deze unieke eigenschap zorgt mucosale immuniteit als een cruciale speler van de afweer systeem. Veel studies zijn gericht op het gastro-intestinale en respiratoire slijmvliezen sites. Toch is er weinig onderzoek naar de reproductieve mucosale sites. De genitale tractus slijmvlies is de primaire plaats van infectie voor seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA), met inbegrip van bacteriële en virale infecties. SOA's zijn een van de meest kritische gezondheid uitdagingen voor de wereld van vandaag. Centers for Disease Control en Prevention schat dat er 19 miljoen nieuwe besmettelijke elk jaar in de Verenigde Staten. STDs kosten de Amerikaanse gezondheidszorg 17 miljard dollar per jaar 2, en de kosten individuen nog meer in directe en levenslange gevolgen voor de gezondheid. Om deze uitdaging het hoofd wordt een beter begrip van reproductieve mucosale immuniteit nodig en isoleren lymfocyten is een essentieel onderdeel van deze studies. Hier geven we een methode reproduceerbaar lymfocyten isoleren van murine vrouwelijke geslachtsorganen voor immunologische studies die kunnen worden aangepast voor aanpassing aan andere soorten. De hieronder beschreven methode is gebaseerd op een muis.
Protocol
1. Het verwijderen van de voortplantingsorganen
- Euthanaseren de muis met behulp van goedgekeurde richtlijnen. Maak lage middellijn incisie en trekken de huid.
- Isoleer en verwijder gehele genitale tractus, van eileider naar vaginale opening.
- Lengterichting Open het hele darmkanaal met een schaar.
- Snijd de voortplantingsorganen waarbij fijne chirurgische schaar in kleine stukjes (ongeveer <1 mm) in een petrischaal met complete RPMI-10/EDTA (zie onderstaande formule) en roer het weefsel in 125 ml kolf bij kamertemperatuur op een magnetische roerder ingesteld 15 min. Deze procedure wordt tweemaal herhaald en de supernatant, die epitheel en ander afval bevat, wordt verwijderd.
- Giet de inhoud van kolf door een cel zeef (40 pm). Afwassen EDTA residu met volledig medium.
Volledige RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% foetaal bovine serum (FBS), door warmte geïnactiveerd, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml 1M HEPES.
Volledige RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (zoals hierboven) met 5 uM EDTA
2. Het verteren van genitale weefsel
- Overdracht weefselstukken een nieuwe kolf met 20 ml verse RPMI-10/collagenase (zie recept hieronder) en verteren van het weefsel bij 37 ° C gedurende 1 uur op een magnetische roerder ingesteld krachtig te roeren het weefsel.
Volledige RPMI-10/collagenase: Vlak voor gebruik reconstitueren collagenase type VIII (Sigma, bij -20 ° C, of volgens de instructies van de fabrikant.), In volledige RPMI/10 aan een eindconcentratie van 450-500U/ml. - Na de eerste vertering, verzamel supernatanten door 100 um cel zeef, houden de cellen op ijs.
- Breng de onverteerde weefsel naar een nieuwe kolf en herhaal stap 2.1 nog tweemaal met vers compleet RPMI-10/collagenase voor een totaal van 3 afzonderlijke digesties. Op dit punt moet geen zichtbare weefselstukken in oplossing.
- Zwembad de alle bovenstaande vloeistoffen bij elkaar uit een steekproef en het verzamelen van door middel van 100 um cel zeef. Spin de cElls naar beneden. Celpellets worden gescheiden met behulp van Percoll gradiënten.
3. Het scheiden van het genitaal cellen met behulp van Percoll gradiënten
- Bereid elke concentratie van Percoll voor gebruik:
- 100% isotone Percoll: mix 9:01 voorraad Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH 7,4 aan met HCL.
- 40% Percoll oplossing mix van 40 ml isotone Percoll 100% en 60 ml compleet RPMI.
- 70% Percoll oplossing mix van 70 ml isotone Percoll 100% met 30 ml compleet RPMI.
- Resuspendeer elke cel pellet uit stap 6 in 40% Percoll oplossing. Een gelijk volume van 70% Percoll wordt gebruikt om de gradiënten maken. Er zijn twee manieren in te stellen gradiënt buizen:
- Onderlaag: celsuspensie eerst toevoegen met 40% Percoll in een gradiënt buis, vervolgens zorgvuldig onder-laag 70% Percoll.
- Over-laag: eerste 70% Percoll toe in de buis vervolgens voorzichtig en langzaam laden 40% Percoll met de cellen op detop.
- Gradient monsters worden gecentrifugeerd @ 900 xg, kamertemperatuur gedurende 20 min met de rem uit.
- De lymfocyten zullen op de grenslaag tussen 40% en 70% Percoll lagen. Voorzichtig oogsten van de interface laag, wassen met RPMI 1:3 en spin down op 740 xg. De lymfocyten worden in de cel pellet en zijn klaar voor verder gebruik.
4. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van isolatie van lymfocyten uit muizen genitaal en flow cytometrie (FACS) analyse wordt getoond in figuur 1. Genitaal werd uit Chlamydia muridarum intravaginaal geinfekteerd muis 7 dagen na infectie. Twee geslachtsorganen werden samengevoegd om voldoende lymfocyten functionele fenotype onderzoek hebben door FACS. Ontleed weefsels werden verwerkt door de spijsvertering en isolatiestappen zoals hierboven beschreven. De enkele celsuspensie werd gekleurd voor verschillende fluorochroom-geconjugeerdemonoklonale antilichamen tegen muis CD3, CD4 en CD8. Figuur 1 een dot-plot presentatie van CD4 positieve T-cellen versus CD8 positieve T-cellen gated op CD3 positieve T lymfocyten. Onze procedure kan onderzoeken lymfocyten geïsoleerd van genitale stukken van verschillende ziekten modellen voor verschillende immuuncellen functionele en fenotypische kenmerken te beoordelen in verschillende ziekten in muismodel. Deze omvatten diverse immuuncellen, zoals dendritische cellen, neutrofielen, macrofagen NK, NKT, T cellen (Ag specifieke T-cellen), B-cellen etc. 3-10.
Figuur 1. Lymfocyten werden geïsoleerd uit genitale stukken muizen geïnfecteerd met chlamydia muridarum, met behulp van de methode die hier gepresenteerd. Na de volledige scheiding procedure werden lymfocyten gekleurd met fluorochroom-geconjugeerde CD3, CD4 en CD8. Het kwadrant data waren gated op CD3 + lymfocyten,met CD4 + en CD8 + met en percentage van de gated cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt getoond hoe lymfocyten te bereiden van de muis geslachtsorganen en is gemakkelijk onder de knie. De meest kritische punt van dit proces is cellevensvatbaarheid handhaven door hem de cellen op ijs. De cel opbrengst van deze werkwijze is afhankelijk van techniek, lossen vaardigheid, de infectieuze toestand van de muis (naïeve dagen na infectie), het pathogeen (bacteriële, virale, schimmel) en de sectie van de murine voortplantingsorganen onderzocht (eileider, uterus, vaginale segment of hele genitale tractus). Onze groep en anderen hebben gepubliceerd diverse studies op verschillende lymfocytenpopulaties van muis voortplantingsorganen 5-7. Op onze handen, van de ene naïeve BALB / c muis, kan volledige genitale genereren 2 x 10 6 cellen met 90% levensvatbaarheid. In veel gevallen zullen de lymfocyten worden gebruikt voor verdere functionele en / of flowcytometrische analyse 3-10. In vergelijking met de gebruikelijke isolatiemethode 11 door onze methode de cell opbrengst wordt verhoogd 10 keer. Deze procedure is tamelijk lang, maar het kan vereenvoudigd worden afhankelijk van het verdere gebruik van de geïsoleerde lymfocyten. Wanneer de cellen worden gebruikt voor niet-functionele assays zoals flowcytometrieanalyse kan de werkwijze worden kortgesloten sla Percoll gradient stap. Deze methode biedt een krachtige en een doeltreffend instrument om mucosale lymfocyten bestuderen en geven inzicht in infectieziekten onderzoek, te vergemakkelijken latere ontwikkeling van een vaccin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen NIH bedanken voor de financiering van subsidies R01-AI026328 (KAK) en R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
