Summary
ウサギの膝関節内の軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。マトリックス上に播種自家軟骨細胞の移植は、満足の長期的な結果を提供する関節軟骨病変の改造や修理のために広く受け入れ方法です。マトリックス支援自家軟骨細胞移植（MACT）が標準化され、臨床的に確立された注入方法を提供しています。
Abstract
関節軟骨は自己再生1限られた容量を有するので、関節軟骨の欠陥が重大な健康問題と考えられている。未処理の軟骨病変は進行中の痛みにつながる、否定的に生活の質に影響を与えると変形性関節症のためにやすく。過去数十年の間に、いくつかの外科技術は、このような病変を治療するために開発されてきた。しかし、今まで、硝子関節軟骨を有する欠陥を覆う又は十分な長期の回復2-4を提供するという点で完全な修復を達成することは不可能であった。したがって、関節軟骨の損傷は、そのような組織工学などの再生技術のための主な目標のまま。多くの場合、繊維状または線維軟骨組織の形成をもたらす他の外科技術とは対照的に、組織工学は、完全に移植された細胞の軟骨産生能を使用して、元の関節軟骨複合体の構造および特性を回復することを目的とする。 Recent発展は再生軟骨の治療のための有望な可能性を開いた。
全層軟骨や骨軟骨病変の治療のための最初のセルベースのアプローチは、臨床自家軟骨細胞移植（ACI）5を開拓ラース·ピーターソンとマットBrittbergによって1994年に行われた。今日では、技術は臨床的にも、10〜20年後に移植6良好な臨床結果を維持し、膝の大硝子軟骨欠損の治療のために十分に確立されています。近年では、自家軟骨細胞の移植は、急速な進行を受けた。その後、細胞を植え替えされた人工的な三次元コラーゲンマトリックスの使用は、ますます人気7-9となった。
MACTが2つの外科的処置を含む：軟骨細胞を収集するために、まず、軟骨生検は、tの非体重を支える軟骨領域から行う必要がある彼は膝関節を。その後、軟骨細胞は、抽出、精製し、 インビトロで十分な細胞数に拡張されている。軟骨細胞は、その後、三次元マトリックス上に播種され、その後、再移植することができる。組織工学インプラントを調製する場合、増殖速度および分化能力が成功した組織再生10にとって極めて重要である。細胞担体としての三次元マトリクスの使用は、これらの細胞の特性11を支持すると考えられる。
以下のプロトコルは、3Dマトリックス（ 軟骨·ジッド 、Geistlichバイオマテリアル、Wollhusen、スイス）の上に軟骨生検、in vitroでのそれらの増殖とその播種から軟骨細胞を単離するための手法を要約し、デモンストレーションを行います。最終的に、ウサギの膝関節の人工的に作成された軟骨細胞の欠陥にマトリクス構築物の注入について説明する。この技術は、実験的な設定として使用することができる軟骨修復のさらなる実験のために。
Protocol
A.軟骨生検（手術室、非滅菌準備室の手順1-5）
- 適切に用量薬することができるように、手術後の体重を監視するために、ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ、女性、3.5〜4.0キロの体重、生後6ヶ月）の最終重量の制御を行う。
- 10 mg / kgをプロポフォールの静脈内注射によりウサギに麻酔を誘導する。
- 挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kgでフェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。
- 電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。
- 徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングでウサギの残りの部分をカバーしています。
- 膝蓋骨を触診し、膝蓋骨の内側に皮膚切開を行います。
- 無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さなSUを切断回避しようperficial血管。
- 横方向に膝蓋骨を置換。
- 任意の異常や巨視的軟骨病変に対する膝関節を点検。
- 慎重に滅菌メス（ 図1）と滑 車骨大腿の外に小さな軟骨片（2-3 mm）の皮をむく。
- 使用直後の体外培養右を続行する完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 mlチューブにこれらの軟骨生検を配置。
- 欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。
- 滑車の溝内に膝蓋骨の位置を変更。
- シングルボタンの縫合（4-0 VICRYL）、継続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖。吸収性縫合糸の素材を使用しています。
- 最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。
体外培養における B.
- 生検Cを処理無菌層流の組織培養フード内操作後できるだけ早くartilageはピース。
- 室温で3分間、500×gで遠心分離し、後続とのPBS中の滅菌収穫軟骨2倍を洗ってください。
- 30分間1ミリメートル3、50ミリリットルファルコンへの転送部分で軟骨をカットし、10ミリリットルトリプシン-EDTA（0.25％）および10 mlのPBSで30分間シェーカーでそれらを消化
- 30分後、完全培地を添加することにより、トリプシン処理を停止する。その後、無血清培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）のコラゲナーゼ（0.21 U / mg）を、12時間のために別のために軟骨の部分を横に振る。
- 室温で3分間、170×gで得られた溶液を遠心分離。
- 5ミリリットル完全培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
- シード5ミリリットル完全培地で25cm 2の組織培養フラスコに上の孤立した軟骨細胞と37℃加湿組織培養インキュベーター中で保つ℃、5％CO 2。
- 80％の密度に軟骨細胞を成長させる。
- 細胞fを放し3分間0.05％トリプシン-EDTAにさらす前に、PBS 2倍で洗浄することによりROMフラスコ。軟骨は切り離したら、10μlの完全培地の添加によりトリプシン処理を停止します。
- 完全培地中300 XG（3分）とペレットを再懸濁しでサスペンションを遠心分離。
- 種子組織培養フラスコ中の細胞（75cm 2の ）と1:3（〜5,000細胞/ cm 2）ごとに5 日目または80％コンフルエント時で分割。
- トリパンブルー染色により細胞数と生存率を決定します。
マトリックスのC.の細胞播種
- 上述したように、注入洗浄および剥離細胞に先立っ。細胞数を実行し、1.5 mlのマイクロチューブに5×10 4個の細胞を移す。その後、室温で5分間、500×gで遠心。
- 行列の完全な飽和状態のために15μlの完全培地中でペレットを再懸濁します。
- 無菌の生検によって滑車欠陥の正確な寸法に重層コラーゲン足場をカットパンチ。
- 適切な大きさの組織培養皿（ 例えば、24ウェルプレート）に、プレース行列。
- マトリックスの多孔質、細胞接着面への種子の細胞。これは離れてマトリックスから細胞遊走を阻止。
- 軟骨細胞の完全な遵守を可能にするために1時間インキュベーター内でさらに細胞培養培地なしで細胞播種行列をしておきます。
- 新鮮な完全培地で培養容器（ 例えば 、24ウェルプレート）に続いて、場所細胞-マトリックス構築物。強力な遵守が期待されるにもかかわらず行列オフ任意の細胞を洗い流すないように注意してください。
- 現在、細胞 - マトリックス構築物は、再移植のための手術室に取り出すことができる。
D.マトリックス支援自家軟骨細胞移植
- （A. 1-8）上記のように反対側の膝にparapatellar関節切開を行います。
- 無菌の空気のoperatinと滑車溝に2つの孤立した軟骨欠損を作成Gパワードリル（直径3.6ミリメートル）。
- 欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水で洗い流してください。
- 注目はいつでも骨髄腔を開くために支払われるべきではない。必要であれば、出血に対する電気焼灼と欠陥の底部をシールします。
- 多孔質の側面下に（ 図2）で培養軟骨細胞を播種行列を植え込む。その後、ドリル穴に圧入し、周囲の表面を洗い流す。
- 安全な固定を保証するためにフィブリン糊を少し（TissucolデュオS）を移植した行列を封印。
- 数回凝固した後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、膝関節への動きの完全な範囲を適用する。
- もう一度横膝蓋骨を置換し、不安定な固定のいずれかのイベントやサインを確認してください。行列は場所ではまだ開催されている必要があります。
- 再び膝蓋骨を交換して、上記のようにドレッシング層とスプレーで創傷閉鎖して操作を終了します。
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Representative Results
記載外科技術は、人工軟骨欠損部に自家軟骨細胞の正常な分離と移植を可能にします。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。
in vivoでの 12週間後、軟骨欠損は、インプラント（ 図4）にせん断応力及び損傷を低減均一で無傷の表面で修復組織によって充填した。また、インプラントのない肥大や石灰化が見られなかった。修復組織は健全な周囲の軟骨組織と同等であった、硬いと固体品質を示した。インプラントの不十分な生体力学的特性のために隣接した軟骨に負荷の増加は時期尚早変性のリスクになるので、これは重要な側面であった。また、層間剥離グラフトは発生していない。術前に欠陥の同じサイズ、任意のfissuに膜をカットしたインプラントと周囲の軟骨の間にリングや裂け目は避けた。
図1。 80％コンフルエントで軟骨細胞初代培養の単層。
図2。軟骨は大腿骨滑車溝の外に生検取る。
図3。人為的に滑車軟骨欠損を作成しました。
図4。開いた膝関節12週間前に自家軟骨細胞を播種膜の移植後ドリル軟骨欠損（赤矢印）。
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Discussion
提示プロトコルは、ウサギのひざで人工的に作成された軟骨欠損へのその後の増殖および再移植のため自家軟骨細胞を単離する9,12,13を設立し、簡単に再現可能な技術を提供する。関節軟骨損傷のリモデリングおよび修復のための自家軟骨細胞の使用は満足な長期的結果を提供すること6臨床既に使用されている。
骨膜肥大や石灰化などのような主要な問題は、移植片が剥離またはドナー部位の罹患率は、自家軟骨細胞移植14の第一および第二世代で発生。したがって、研究者は、欠陥部位に軟骨細胞を提供する外因性生体吸収性材料を用いた手法を開発しました。アガロース15を使用する際に軟骨の特性を維持する上で三次元培養系の正の効果を繰り返し、例えば、実証されている、ポリ- dioxanonとポリグラクチン16、ポリエステル、ポリ（L-ラクチド）（PLLA）とポリ（D、L-ラクチド-コグリコリド）（PLGA）17、フィブリン12、ヒアルロン酸18、アルギン酸19、コラーゲン20又はコラーゲンマトリックス9 。
本研究で用いた二分子コラーゲン膜軟骨ジッドが正常9,21,22前に、いくつかの前臨床試験に適用され、すでに臨床応用21,23の一部であるされています。コラーゲン膜の二重層構造は、軟骨細胞統合および増殖のための安定した微小環境を提供し、マトリックス内の細胞の均一な分布を可能にし、それは従来のACI 11に見られるように、セル漏れの可能性を排除する。このMACT手法を用いることにより、移植軟骨細胞は局所的に維持存続に保持されます。マトリックス支援自家軟骨細胞移植はの合成につながる再生組織を軟骨好き21臨床的に適用されます。
記載の動物モデルはよく関節軟骨病変11,24,25の実験的治療に受け入れられている。しかし、提示手法を用いた実験の可能な結果の臨床ルーチンへの変換は、いくつかの理由で困難である。動物モデルでは、一般的には移植された細胞は、早期の統合プロセスを開始できるようにすることが推奨される手術後の最初の日/週で体重を支える非または部分を達成することはほとんど不可能である。すぐに手術後ベアリング全重量は、潜在的に移植に悪影響を及ぼす可能性があるので、結果に影響を及ぼす可能性があります。しかし、この設定は、9,12匹敵するすべての動物モデルにおいて同様であった。より密接に人間の状況に似た大型動物を用いた実験は、さらに動物実験で保証されています。
要約すると、しかしながら、電子を設立それは上述したようにxperimental動物モデルは、軟骨修復のさらなる実験的研究のための基礎を提供し、複雑な研究の設定の実現と性能を容易にするかもしれない。この動物モデルを用いた実験的な成長因子と検査、遺伝子誘導と変化マトリックスプロパティは、確立された臨床を改善するために役立つかもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/3-1）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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