Summary
Uma técnica experimental para o tratamento de lesões condrais no joelho do coelho é descrito. O implante de condrócitos autólogos semeadas numa matriz é um método bem aceite para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular que fornecem resultados satisfatórios a longo prazo. Matrix-assistida transplante de condrócitos autólogos (MACT) oferece um método padronizado e implante clinicamente estabelecida.
Abstract
Defeitos da cartilagem articular são consideradas um importante problema de saúde porque a cartilagem articular tem uma capacidade limitada de auto-regeneração 1. Lesões de cartilagem não tratadas levar a dor contínua, afetam negativamente a qualidade de vida e predispõem para a osteoartrose. Durante as últimas décadas, várias técnicas cirúrgicas têm sido desenvolvidos para o tratamento de tais lesões. No entanto, até agora não foi possível conseguir uma reparação completa em termos de cobertura com o defeito da cartilagem articular ou hialina de proporcionar recuperação satisfatória a longo prazo 2-4. Portanto, as lesões da cartilagem articular continuam a ser um alvo privilegiado para técnicas regenerativas, como Engenharia de Tecidos. Em contraste com outras técnicas cirúrgicas, que muitas vezes conduzem à formação de tecido fibroso ou fibrocartilaginoso, Tissue Engineering visa restaurar completamente a complexa estrutura e as propriedades da cartilagem articular original usando o potencial condrogénico das células transplantadas. Rdesenvolvimentos ecent abriu possibilidades promissoras para terapias de regeneração da cartilagem.
A primeira abordagem baseada em células para o tratamento de cartilagem em toda a espessura ou lesões osteocondrais foi realizada em 1994 por Lars Peterson e Pad Brittberg pioneiro condrócitos autólogos clínica (ACI) 5. Hoje em dia, a técnica está bem estabelecido clinicamente para o tratamento de grandes defeitos na cartilagem hialina do joelho, mantendo bons resultados clínicos até 10 a 20 anos após a implantação 6. Nos últimos anos, o implante de condrócitos autólogos foram submetidos a uma rápida progressão. O uso de um tridimensional colagénio matriz artificial no qual as células são replantadas subsequentemente transformou-se cada vez mais popular 7-9.
MACT composto por dois procedimentos cirúrgicos: Em primeiro lugar, a fim de recolher os condrócitos, uma biópsia da cartilagem precisa ser realizada a partir de uma área de cartilagem não peso-rolamento de tjoint ele joelho. Em seguida, os condrócitos a ser extraídos, purificados e expandiu-se para um número suficiente de células in vitro. Os condrócitos são então semeadas em uma matriz tridimensional e pode ser subsequentemente re-implantado. Ao preparar um implante de tecido de engenharia, a taxa de proliferação e capacidade de diferenciação são fundamentais para a regeneração de tecidos bem sucedida 10. A utilização de uma matriz tridimensional, como uma célula transportadora é pensado para apoiar estas características celulares 11.
O protocolo a seguir vai resumir e demonstrar uma técnica para o isolamento de condrócitos a partir de biópsias de cartilagem, a sua proliferação in vitro e a sua sementeira em um 3D-matriz (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suíça). Finalmente, a implantação das células-matriz-construções em defeitos condrais criadas artificialmente de articulação do joelho de um coelho vai ser descrito. Esta técnica pode ser usada como uma configuração experimentalpara novas experiências de reparação da cartilagem.
Protocol
A. Cartilagem Biópsia (Room Cirurgia; passos 1-5 na sala de preparação não-estéril)
- Realizar um controlo de peso final do coelho (coelho branco da Nova Zelândia, fêmea, 3,5-4,0 kg de peso corporal, 6 meses de idade) a fim de ser capaz de drogas de dose adequada e para monitorar o peso após a cirurgia.
- Induzir a anestesia ao coelho por uma injecção intravenosa de 10 mg / kg de propofol.
- Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg por via intravenosa de fentanil. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca.
- Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele.
- Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada.
- Palpar a patela e realizar uma incisão medial da patela.
- Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Tente evitar qualquer corte pequeno suvasos sanguíneos perficial.
- Deslocar a patela lateralmente.
- Inspecione a articulação do joelho para eventuais anomalias e lesões de cartilagem macroscópicos.
- Retire cuidadosamente pequenos pedaços de cartilagem (2-3 mm) para fora da tróclea femoral ossis com um bisturi estéril (Figura 1).
- Colocar imediatamente estas biópsias da cartilagem num tubo de 50 ml com meio completo (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para continuar com o direito em cultura in vitro, após a operação.
- Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril.
- Mude a posição da patela dentro do sulco da tróclea.
- Fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl). Use material de sutura absorvível.
- Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água.
B. In vitro Cultura
- Processar a biópsia cpeças artilage o mais rapidamente possível após a operação em um fluxo laminar tecido capa de cultura estéril.
- Lava-se a estéril colhida cartilagem 2x em PBS com subsequente centrifugação a 500 xg durante 3 minutos, à TA.
- Cortar cartilagem em pedaços de 1 mm, 3, a transferência para um Falcon de 50 ml e digerem num agitador durante 30 min com 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml de PBS durante 30 min
- Após 30 minutos, parar a tripsinização adicionando meio completo. Então, agite as peças de cartilagem para o outro para 12 horas com colagenase A (0,21 U / mg) em meio livre de soro (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugar a solução resultante a 170 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Ressuspender sedimentos celulares em 5 ml de meio completo.
- Semente os condrócitos isolados sobre a 25 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 5 ml de meio completo e manter numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cresça condrócitos a uma densidade de 80%.
- Solte a células ffrascos rom por lavagem em PBS 2x antes de expor a 0,05% de tripsina-EDTA por 3 minutos. Uma vez que os condrócitos separar, parar de tripsinização pela adição de 10 mL médio completo.
- Centrifugar a suspensão a 300 xg (3 minutos) e ressuspender o pellet em meio completo.
- Células de sementes em frascos de cultura de tecidos (75 cm 2) e por partes a uma razão de 1:3 (~ 5.000 células / cm 2) a cada 5 ° dia ou ao 80% de confluência.
- Determinar o número de células e viabilidade de tripan coloração azul.
C. Cell-semeadura da Matriz
- Antes da implantação de lavagem e as células de libertação, tal como descrito acima. Efectuar a contagem de células e transferir 5 x 10 4 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Depois centrifugar a 500 xg durante 5 min à TA.
- Ressuspender o sedimento em 15 mL meio completo para uma completa saturação da matriz.
- Corte a bicamada colágeno andaime para as dimensões exatas do defeito trochlear por uma biópsia estérilsoco.
- Matriz lugar num prato de cultura de tecido de tamanho adequado (por exemplo, placas de 24 poços).
- Células de semente para o lado poroso, por células da matriz adesiva. Isto impede a migração de células para longe da matriz.
- Adicione matrizes de células semeadas, sem mais meio de cultura de células dentro de uma incubadora durante 1 hora para permitir a aderência completa dos condrócitos.
- Em seguida, coloque célula-matriz-construções em recipientes de cultura (por exemplo, placas de 24 poços) com meio completo fresco. Tome cuidado para não lavar as células fora da matriz, mesmo que forte adesão é esperado.
- Agora, célula-matriz-construções podem ser levados para a sala de cirurgia para re-implantação.
D. Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos
- Realizar artrotomia parapatelar ao joelho contralateral como acima descrito (A. 1-8).
- Criar dois defeitos condrais isoladas no sulco troclear com um operatin ar estérilg furadeira (3,6 mm de diâmetro).
- Limpar o defeito e lavar com solução salina estéril.
- Deve ser dada atenção para não abrir a cavidade da medula, a qualquer momento. Se necessário, vedar a parte inferior dos defeitos com cauterização eléctrica contra a hemorragia.
- Implante as matrizes semeados com os condrócitos de cultura com o lado poroso virados para baixo (Figura 2). Em seguida, pressione-se encaixam nos furos e lave a superfície circundante.
- Vedar as matrizes implantados com um pouco de cola de fibrina (Tissucol Duo S) para garantir a fixação segura.
- Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e aplicar gama completa de movimento para a articulação do joelho algumas vezes.
- Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verifique se há algum evento ou sinal de fixação instável. As matrizes devem ser realizadas ainda no local.
- Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas e spray de vestir, como descrito acima.
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Representative Results
A técnica cirúrgica descrita permite uma implantação bem sucedida e isolamento de condrócitos autólogos para um defeito condral artificial. A configuração experimental resultou em uma integração bem sucedida do implante na cartilagem ao redor.
Após 12 semanas in vivo, o defeito condral foi preenchido por tecido de reparação com uma superfície homogénea e intacta, o que reduziu tensão de cisalhamento e danos no implante (Figura 4). Além disso, nenhuma hipertrofia ou calcificação do implante foi observado. O tecido de reparação mostrou uma qualidade rígida e sólida, a qual foi comparável à do tecido de cartilagem saudável circundante. Este foi um aspecto importante porque o aumento da carga sobre a cartilagem adjacente devido a propriedades biomecânicas insuficientes do implante seria um risco para a degeneração prematura. Além disso, o enxerto não ocorreu delaminação. Depois de cortar a membrana com o mesmo tamanho do defeito no pré-operatório, qualquer fissuanel ou fendas entre o implante eo cartilagem ao redor foram evitadas.
Figura 1. Monocamada de condrócitos de cultura primária a 80% de confluência.
Figura 2. Tomando uma biópsia da cartilagem fora do sulco da tróclea femoral.
Figura 3. Criado artificialmente defeito da cartilagem da tróclea.
Figura 4. Abertos articulação do joelho 12 semanas após a implantação de uma membrana semeada com condrócitos autólogos para uma pré-Perfurados defeito condral (seta vermelha).
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Discussion
O protocolo apresentado fornece uma técnica estabelecida 9,12,13 e facilmente reprodutível para isolar condrócitos autólogos para a proliferação e posterior re-implantação em defeitos da cartilagem criadas artificialmente em joelhos de coelho. A utilização de condrócitos autólogos para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular já está em uso clínico proporcionar resultados satisfatórios a longo prazo 6.
Principais problemas como, por exemplo, a hipertrofia do periósteo e calcificação do enxerto delaminação ou doador local morbidade ocorreu com a primeira e segunda geração de autólogo de condrócitos 14. Portanto, os investigadores têm desenvolvido técnicas que utilizam materiais bioabsorvíveis exógenos para entregar condrócitos para o local do defeito. O efeito positivo do sistema de cultura tridimensional sobre a manutenção das características condrocítico tem sido repetidamente demonstrado, por exemplo, quando usando agarose 15, Poli - dioxanon poliglactina e 16, poliésteres poli (L-lactido) (PLLA) e poli (D, L-lactido-coglycolide) (PLGA), 17, 12 de fibrina, hialuronano 18, alginato de 19, 20 de colagénio ou colagénio-matrizes 9 .
A membrana de colagénio bicamada Chondro-Gide utilizada neste estudo foi aplicado com sucesso em vários estudos pré-clínicos antes de 9,21,22 e já faz parte de aplicações clínicas 21,23. A estrutura da bicamada da membrana de colagénio oferece um microambiente para a integração estável de condrócitos e a proliferação, permite uma distribuição homogénea das células dentro da matriz e elimina a possibilidade de fuga de células, como é visto em ACI convencional 11. Através da utilização desta técnica MACT, os condrócitos transplantados são mantido localmente com viabilidade mantida. Transplante de condrócitos autólogos matriz assistida leva à síntese decartilagem como regeneração de tecidos e é clinicamente aplicável 21.
O modelo animal descrito é bem aceito no tratamento experimental de lesões da cartilagem articular 11,24,25. No entanto, a rotina de tradução para o clínico dos possíveis resultados de experiências que utilizam a técnica apresentada é difícil, por diversas razões. Num modelo animal, é quase impossível de alcançar non ou parcial de suporte de peso nos primeiros dias / semana após a cirurgia que seriam geralmente recomendadas para permitir que as células implantadas para começar com os processos de integração precoce. Peso tendo imediatamente após a cirurgia poderia prejudicar o transplante e, portanto, pode influenciar o resultado. Mas esta configuração era similar em todos os modelos animais comparáveis 9,12. Experimentos com animais maiores, assemelhando-se mais de perto a situação humana, são necessários mais estudos em animais.
Em resumo, no entanto, um e estabelecidamodelo animal Xperimental como é descrito acima fornece uma base para futuros estudos experimentais de reparação da cartilagem e pode até facilitar a realização eo desempenho de ambientes de estudo complexos. Exames experimentais com fatores de crescimento, indução de genes e alterar as propriedades da matriz usando este modelo animal pode ser útil para melhorar as situações clínicas estabelecidas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pela Associação Alemã de Pesquisa (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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