Summary
טכניקה ניסויית לטיפול בפגמי chondral במפרק הברך של הארנב מתוארת. השתלת כונדרוציטים אוטולוגי זורעים על מטריצה היא שיטה מקובלת היטב לשיפוץ ותיקון של נגעי סחוס במפרק המספקים תוצאות מספקות לטווח ארוך. השתלה אוטולוגית chondrocyte מטריקס בסיוע (MACT) מציעה שיטת השתלה טופל וקליני מבוססת.
Abstract
פגמי סחוס במפרק נחשבים בעיה בריאותית משמעותית, כי סחוס במפרק יש קיבולת מוגבלת להתחדשות עצמית 1. נגעי סחוס שלא טופלו להוביל לכאבים מתמשך, להשפיע לרעה על איכות החיים ולהגביר את הנטייה לדלקת מפרקים ניוונית. במהלך העשורים האחרונים, מספר טכניקות כירורגיות פותחו לטיפול בנגעים מסוג זה. עם זאת, עד עכשיו זה לא היה ניתן להשיג תיקון מלא במונחים של כיסוי הפגם בסחוס במפרק hyaline או של מתן התאוששות ארוכת טווח 2-4 משביע רצון. לכן, פציעות סחוס במפרק תישאר מטרה עיקרית של טכניקות משובי כגון הנדסת רקמות. בניגוד לטכניקות כירורגיות אחרות, אשר לעתים קרובות להוביל להיווצרות של רקמה סיבית או fibrocartilaginous, הנדסת רקמות שמטרתו לשקם את המבנה המורכב והמאפיינים של הסחוס במפרק המקורי במלואו על ידי שימוש בפוטנציאל chondrogenic של תאים מושתלים. Rהתפתחויות ecent פתחו אפשרויות מבטיחות לטיפולי סחוס משובי.
הגישה מבוססת התא הראשון לטיפול בסחוס בעובי מלא או נגעי osteochondral בוצעה בשנת 1994 על ידי לארס פטרסון ומאטס Brittberg שהייתה חלוץ השתלת chondrocyte קלינית אוטולוגית (ACI) 5. כיום, הטכניקה היא קלינית ומבוססת לטיפול בפגמי סחוס hyaline הגדולים של הברך, שמירה על תוצאות קליניות טובות אפילו 10 עד 20 שנים לאחר השתלת 6. בשנים האחרונות, השתלת כונדרוציטים אוטולוגי עברה התקדמות מהירה. השימוש בקולגן מטריצה תלת ממדים מלאכותיים שבו תאים ניטעו מחדש לאחר מכן הפך יותר ויותר פופולריים 7-9.
MACT מורכבת משני ניתוחים: ראשית, על מנת לאסוף כונדרוציטים, ביופסית סחוס צריכה להתבצע מאזור סחוס שאינו נושאת משקל של לאהוא מפרק הברך. ואז, כונדרוציטים עוברים חילוץ, מטוהרים והתרחבו למספר תא מספיק במבחנה. Chondrocytes לאחר מכן זורעים על מטריצה תלת ממדית ולאחר מכן יכול להיות מחדש מושתל. בעת הכנת שתל רקמה מהונדס, קצב התפשטות ויכולת בידול חיוני להתחדשות רקמות מוצלחת 10. השימוש במטריצה תלת ממדית כנשא תא חשב לתמוך במאפיינים סלולריים אלה 11.
הפרוטוקול הבא יסכם ולהפגין טכניקה לבידוד של כונדרוציטים מביופסיות סחוס, התפשטותם במבחנה וזריעתם על 3D-מטריצה (Chondro-ז'יד, Biomaterials Geistlich, Wollhusen, שוויץ). לבסוף, ההשתלה של תאי מטריקס, מבנים לפגמי chondral נוצרו באופן מלאכותי של מפרק הברך של ארנב שיפורט. טכניקה זו יכולה לשמש כהגדרה ניסיוניתלניסויים נוספים של תיקון סחוס.
Protocol
א סחוס ביופסיה (חדר ניתוח; שלבי 1-5 בחדר הכנה ללא סטרילי)
- לבצע בקרת משקל סופית של הארנב (ניו זילנד ארנב לבן, נקבה, 3.5-4.0 ק"ג משקל גוף, גיל 6 חודשים) על מנת להיות מסוגל תרופות במינון נכון וכדי לפקח על משקל לאחר ניתוח.
- לגרום הרדמה לארנב על ידי הזרקה תוך ורידית של 10 propofol מ"ג / ק"ג.
- לאחר אינטובציה, לשמור על הרדמה עם 1.5 מ"ג / ק"ג / דקה propofol ופנטניל 0.05 מ"ג / ק"ג לוריד. לפקח הרדמה באמצעות capnography, oximetry דופק ודופק.
- לגלח את הברך להיות מופעלת על עם גוזז חשמלי וואקום הפרווה.
- לחטא את הברך מגולח ביסודיות ולכסות את שאר הארנב עם רוטב סטרילי.
- למשש את פיקת הברך ולבצע חתך בעור מדיאלית של הפיקה.
- פתח את מפרק הברך על ידי arthrotomy parapatellar המדיאלי בתנאים סטריליים. נסו להימנע מחיתוך כל su קטןכלי דם perficial.
- לעקור את פיקת הברך רוחבית.
- בדוק את מפרק הברך לכל מומים ונגעי סחוס מקרוסקופיים.
- זהירות לקלף חתיכות סחוס קטנות (2-3 מ"מ) מתוך trochlea ossis femoris עם אזמל סטרילי (איור 1).
- מייד למקום ביופסיות סחוס אלה לתוך צינור 50 מ"ל עם מדיום מלא (DMEM + 10% עוברי עגל בסרום (FCS) + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס)) להמשיך עם התרבות במבחנה מייד אחרי הניתוח.
- נקה את הפגמים ולשטוף אותם עם תמיסת מלח סטרילית.
- למקם מחדש את הפיקה בתוך חריץ trochlea.
- סגירת פצע בשכבות עם תפרי כפתור אחת (Vicryl 4-0) ותפר עורית מתמשכת (Monocryl 4-0). להשתמש בחומר תפר נספג.
- לבסוף, לאטום את הפצע עם תרסיס הלבשה חדירה לאדי מים.
ב 'במבחנה התרבות
- לעבד ג הביופסיהartilage חתיכות בהקדם האפשרי לאחר הניתוח במכסת מנוע זרימה למינרית סטרילי רקמת תרבות.
- שטוף את נקטף סחוס 2x סטרילי בPBS עם צנטריפוגה הבאה בXG 500 במשך 3 דקות ב RT.
- לחתוך סחוס בחתיכות של 1 מ"מ 3, העברה לפלקון 50 מ"ל ולעכל אותם על שייקר למשך 30 דקות עם 10 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%) ו10 מ"ל PBS למשך 30 דקות
- לאחר 30 דקות, להפסיק trypsinization ידי הוספה בינונית מלאה. לאחר מכן, לנער את חתיכות הסחוס לעוד 12 שעות עם collagenase (0.21 U / מ"ג) במדיום חופשי בסרום (DMEM + 1% עט / סטרפטוקוקוס).
- צנטריפוגה הפתרון שהתקבל ב 170 XG במשך 3 דקות ב RT.
- Resuspend כדורי תא ב5 מ"ל בינוני מלא.
- זרע כונדרוציטים המבודדים ל25 2 צלוחיות תרבית רקמת סנטימטר בינונית 5 מ"ל מלא ולשמור בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לגדול כונדרוציטים לצפיפות של 80%.
- שחרר את F התאיםצלוחיות rom על ידי השטיפה בPBS 2x לפני החשיפה ל0.05% טריפסין-EDTA במשך 3 דקות. ברגע שכונדרוציטים להתנתק, להפסיק trypsinization על ידי תוספת של 10 בינוניות מלא μl.
- צנטריפוגה ההשעיה XG 300 (3 דקות) וresuspend גלולה במדיום שלם.
- תאי זרע בצלוחיות תרבית רקמה (75 ס"מ 2) ופיצול ביחס של 1:3 (~ 5000 תאים / 2 ס"מ) בכל יום ה 5 או על 80% confluency.
- לקבוע מספרים סלולריים וכדאיות על ידי צביעת trypan הכחולה.
ג Cell-זריעה של מטריקס
- לפני שטיפת השתלת תאים ושחרור כפי שתואר לעיל. לבצע ספירת תאים ולהעביר 5 x 10 4 תאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. אז צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב RT.
- Resuspend גלולה ב15 בינונית מלא μl לרוויה של המטריצה שלמה.
- חותכים את bilayer קולגן הפיגום לממדי פגם trochlear המדויקים על ידי ביופסית סטריליאגרוף.
- מטריקס המקום לתוך צלחת תרבית רקמה בגודל המתאים (לדוגמה: 24 גם צלחות).
- תאי זרע על הצד הנקבובי, תא מודבקות של מטריקס. זה מרתיע את נדידת תאים מהמטריצה.
- השאר מטריצות תא זרע ללא תרבית תאים בינוניות נוספת בתוך חממה במשך שעה 1 כדי לאפשר היענות מלאה של כונדרוציטים.
- ואז, במקום תא מטריקס, בונה לתוך מכולות culturing (למשל 24 גם צלחות) עם מדיום מלא טרי. יש להיזהר שלא לשטוף את כל תאים מחוץ למטריצה למרות דבקות חזקה צפויה.
- עכשיו, ניתן לקחת תאי מטריקס, מבנים לחדר הניתוח להשתלה מחדש.
השתלת chondrocyte אוטולוגיים ד מטריקס בסיוע
- בצע arthrotomy parapatellar עד הברך הנגדית כמתואר לעיל (א '1-8).
- צור שני פגמי chondral מבודדים בחריץ trochlear עם operatin אוויר סטריליגרם מקדחה (3.6 מ"מ קוטר).
- נקה את הפגם ולשטוף עם תמיסת מלח סטרילית.
- יש לשים לב שלא לפתוח את חלל מח בכל עת. במידת צורך, לאטום את החלק התחתון של הפגמים עם כויה חשמלית נגד דימום.
- להשתיל את המטריצות נזרעו עם כונדרוציטים התרבותיים עם הפנים מטה הצד הנקבובי (איור 2). לאחר מכן קיבוע לתוך חורי הקידוח ולשטוף את המשטח שמסביב.
- לאטום את המטריצות המושתלות עם קצת דבק הפיברין (Tissucol Duo S) כדי להבטיח קיבוע מאובטח.
- לאחר קרישה, מיקום מחדש של הפיקה בתוך חריץ trochlear ולהחיל את טווח תנועה מלא למפרק הברך כמה פעמים.
- לעקור את פיקת הברך רוחבית שוב ולבדוק כל אירוע או סימן לקיבוע יציב. המטריצות חייבות להיות מוחזקות עדיין במקום.
- החלף את פיקת הברך שוב ולסיים את המבצע עם סגירת פצע בשכבות ותרסיס הלבשה כפי שתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה כירורגית תאר מאפשרת בידוד והשתלה מוצלחים של כונדרוציטים אוטולוגי לפגם chondral מלאכותי. ההתקנה הניסיונית הביאה לשילוב מוצלח של השתל לתוך הסחוס שמסביב.
לאחר 12 שבועות in vivo, פגם chondral היה מלא על ידי רקמת תיקון עם משטח אחיד ושלם, אשר הפחית את לחץ ונזק גזירה לשתל (איור 4). יתר על כן, אין היפרטרופיה או הסתיידות של השתל הייתה לראות. תיקון הרקמות הראו איכות נוקשה ומוצקה, שהייתה דומה לרקמת הסחוס המקיף בריאה. זה היה היבט חשוב כי עומס מוגבר על הסחוס הסמוך בשל מאפייני biomechanical מספיקים של השתל יהיה סיכון להתנוונות מוקדמת. יתר על כן, שתל delamination לא קרה. לאחר שחתך את הקרום לאותו הגודל של הפגם לפני ניתוח, כל fissuטבעת או בתרי בין שתל וסחוס שמסביב הייתה להימנע.
איור 1. Monolayer של התרבות העיקרית כונדרוציטים ב 80% confluency.
איור 2. לקיחת ביופסית סחוס מחוץ לחריץ trochlea הירך.
איור 3. נוצר פגם סחוס trochlear באופן מלאכותי.
איור 4. 12 שבועות מפרק הברך נפתחו לאחר ההשתלה של קרום זורעים עם כונדרוציטים אוטולוגי למראשפגם chondral-קדח (חץ אדום).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא מספק טכניקה הוקמה 9,12,13 ושחזור בקלות לבודד כונדרוציטים אוטולוגי עבור ההפצה הבאה והשתלה מחדש לפגמי סחוס בברכיים נוצרו באופן מלאכותי ארנב. השימוש בכונדרוציטים אוטולוגי עבור שיפוץ ותיקון של נגעי סחוס במפרק כבר נמצא בשימוש קליני מתן תוצאה מספקת לטווח ארוך 6.
בעיות עיקריות כמו למשל היפרטרופיה והסתיידות periosteal, שתל delamination או תחלואת אתר תורם התרחשה עם בני הדור הראשון והשני של השתלה אוטולוגית 14 chondrocyte. לכן חוקרים פיתחו טכניקות תוך שימוש בחומרי bioresorbable אקסוגניים לספק כונדרוציטים לאתר הפגם. ההשפעה החיובית של מערכת התרבות תלת ממדים על התחזוקה של מאפייני chondrocytic כבר הוכיחה שוב ושוב, למשל בעת השימוש בagarose 15, פולי - dioxanon וpolyglactin 16, פוליאסטר פולי (L-lactide) (PLLA) ופולי (D, L-lactide-coglycolide) (PLGA) 17, 12 הפיברין, hyaluronan 18, אלגינט 19, 20 או קולגן קולגן מטריצות 9 .
קרום קולגן bilayer Chondro-ז'יד השתמש במחקר זה יושם בהצלחה בכמה מחקרים פרה לפני 9,21,22 והוא כבר חלק מיישומים קליניים 21,23. מבנה bilayer של קרום קולגן מציע microenvironment יציב לאינטגרציה וריבוי chondrocyte, מאפשר חלוקה שווה של התאים בתוך המטריצה ומבטל את האפשרות של זליגת תא כפי שהיא נתפסת בקונבנציונלית 11 ACI. על ידי שימוש בטכניקת MACT זה, כונדרוציטים המושתלים נשמרים באופן מקומי עם כדאיות נשמרה. השתלה אוטולוגית chondrocyte מטריקס בסיוע מובילה לסינתזה שלכמו סחוס התחדשות רקמות וקליניים הוא ישים 21.
מודל החיה תאר מקובל גם בטיפול ניסיוני של נגעי סחוס במפרק 11,24,25. עם זאת, התרגום לשגרה קלינית של תוצאות אפשריות של ניסויים באמצעות הטכניקה המוצגת הנו קשה מכמה סיבות. במודל חיה זה כמעט בלתי אפשרי להשיג או חלקי שאינה נושאת משקל בימים / שבועות הראשונים לאחר ניתוח שיהיה מומלצים בדרך כלל כדי לאפשר לתאים המושתלים להתחיל עם תהליכי אינטגרציה מוקדמות. משקל מלא נושא מייד לאחר הניתוח עלול לפגוע בהשתלה, ולכן עשוי להשפיע על התוצאה. אבל הגדרה זו הייתה דומה בכל המודלים של בעלי החיים דומים 9,12. ניסויים בבעלי חיים גדולים יותר, שמזכירים את המצב האנושי באופן הדוק יותר, ניתן במחקרים בבעלי חיים נוספים.
לסיכום, לעומת זאת, הוקם דוארמודל החיה xperimental כפי שהיא מתוארת לעיל מהווה בסיס למחקרים ניסיוניים נוספים של תיקון סחוס ואולי אפילו להקל על מימוש וביצוע הגדרות מחקר מורכב. בדיקות ניסוייות עם גורמי גדילה, אינדוקציה גנטית ומאפיינים משתנים מטריקס באמצעות מודל חיה זה עשויות להיות מועילה כדי לשפר את ההגדרות הקליניות והמבוססות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי אגודת המחקר הגרמני (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
