Summary
Une technique expérimentale pour le traitement de défauts chondraux dans l'articulation du genou du lapin est décrite. L'implantation de chondrocytes autologues ensemencées sur une matrice est une méthode bien acceptée pour la rénovation et la réparation des lésions du cartilage articulaire qui fournissent des résultats satisfaisants à long terme. Assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues (MACT) propose une méthode d'implantation standardisée et cliniquement établie.
Abstract
défauts du cartilage articulaire sont considérés comme un problème de santé majeur, car le cartilage articulaire a une capacité limitée pour l'auto-régénération 1. Lésions du cartilage non traitées mènent à la douleur en cours, affecter négativement la qualité de vie et prédisposer à l'arthrose. Au cours des dernières décennies, plusieurs techniques chirurgicales ont été développées pour traiter ces lésions. Toutefois, jusqu'à présent, il n'était pas possible d'obtenir une réparation complète en termes de couverture du défaut de cartilage articulaire hyalin ou de fournir récupération satisfaisante à long terme 2-4. Par conséquent, les blessures du cartilage articulaire restent une cible privilégiée pour les techniques régénératrices telles que l'ingénierie tissulaire. Contrairement à d'autres techniques chirurgicales, qui conduisent souvent à la formation de tissu fibreux ou fibrocartilaginous, génie tissulaire vise à rétablir pleinement la structure complexe et les propriétés du cartilage articulaire d'origine en utilisant le potentiel chondrogénique des cellules transplantées. Res dernières évolutions ont ouvert des perspectives prometteuses pour les thérapies régénératrices du cartilage.
La première approche à base de cellules pour le traitement de cartilage de pleine épaisseur ou de lésions ostéochondrales a été réalisée en 1994 par Lars Peterson et Mats Brittberg pionnier de l'implantation de chondrocytes autologues clinique (ACI) 5. Aujourd'hui, la technique est cliniquement bien établie pour le traitement des grands défauts du cartilage hyalin du genou, le maintien de bons résultats cliniques même de 10 à 20 ans après l'implantation 6. Au cours des dernières années, l'implantation de chondrocytes autologues a subi une progression rapide. L'utilisation d'une tridimensionnel de collagène matrice artificielle sur laquelle les cellules sont ensuite replantés est devenu de plus en plus populaire 9.7.
MACT comporte de deux interventions chirurgicales: d'abord, afin de recueillir des chondrocytes, une biopsie de cartilage doit être effectuée à partir d'une zone de cartilage non mise en charge de til articulation du genou. Ensuite, les chondrocytes sont extraits, purifiés et étendues à un nombre de cellules suffisant in vitro. Les chondrocytes sont ensuite ensemencées sur une matrice en trois dimensions et peuvent être ensuite réimplantées. Lors de la préparation d'un implant par génie tissulaire, le taux de prolifération et la différentiation sont cruciales pour une régénération des tissus réussi 10. L'utilisation d'une matrice tridimensionnelle comme un support de cellules est pensé pour soutenir ces caractéristiques cellulaires 11.
Le protocole suivant résumera et démontrer une technique pour isoler les chondrocytes à partir de biopsies de cartilage, leur prolifération in vitro et leur ensemencement sur une matrice 3D (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suisse). Enfin, l'implantation des cellules-matrice-constructions en défauts chondrales créés artificiellement de l'articulation du genou d'un lapin sera décrite. Cette technique peut être utilisée comme un cadre expérimentalpour d'autres expériences de la réparation du cartilage.
Protocol
A. biopsie de cartilage (Salle de chirurgie; étapes 1-5 dans la salle de préparation non stérile)
- Effectuer un contrôle du poids final du lapin (Nouvelle-Zélande lapin blanc, femelle, 3,5-4,0 kg de poids corporel, âgé de 6 mois) afin de pouvoir doser médicaments correctement et de surveiller le poids après la chirurgie.
- Induire une anesthésie au lapin par une injection intraveineuse de 10 mg / kg de propofol.
- Après l'intubation, maintenir l'anesthésie avec 1,5 mg / kg / min propofol et 0,05 mg / kg de fentanyl par voie intraveineuse. Surveiller anesthésie en utilisant la capnographie, l'oxymétrie de pouls et de la fréquence du pouls.
- Raser le genou à opérer avec une tondeuse électrique et vide la fourrure.
- Désinfecter le genou rasée à fond et couvrir le reste du lapin avec un pansement stérile.
- Palper la rotule et d'effectuer une incision de la peau médiane de la rotule.
- Ouvrez l'articulation du genou par une arthrotomie parapatellaire interne dans des conditions stériles. Essayez d'éviter de couper une petite suvaisseaux sanguins perficial.
- Déplacer la rotule latéralement.
- Inspectez l'articulation du genou pour toutes les anomalies et les lésions cartilagineuses macroscopiques.
- Retirer délicatement les petits morceaux de cartilage (2-3 mm) de la trochlée ossis fémoral avec un scalpel stérile (Figure 1).
- Immédiatement placer ces biopsies de cartilage dans un tube de 50 ml avec du milieu complet (DMEM + 10% sérum de veau foetal (FCS) + 1% de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep)) à poursuivre le du chef de culture in vitro après l'opération.
- Nettoyez les défauts et les rincer avec une solution saline stérile.
- Repositionner la rotule dans la gorge trochlée.
- Fermeture de la plaie en couches avec bouton sutures simples (4-0 Vicryl) et une suture cutanée continue (4-0 Monocryl). Utilisez du matériel de suture absorbable.
- Enfin, sceller la plaie avec un spray pansement perméable à la vapeur d'eau.
B. culture in vitro
- Traiter la biopsie cmorceaux de artilage dès que possible après l'opération dans une hotte de culture tissulaire à flux laminaire stérile.
- Laver le stérile récolté cartilage 2x dans PBS avec centrifugation subséquente à 500 g pendant 3 min à température ambiante.
- Couper en morceaux de cartilage 1 mm 3, transfert vers un Falcon 50 ml et digérer sur un agitateur pendant 30 min avec 10 ml de trypsine-EDTA (0,25%) et 10 ml de PBS pendant 30 min
- Après 30 minutes, arrêtez la trypsine en ajoutant un milieu complet. Ensuite, serrer les morceaux de cartilage pour un autre pendant 12 heures avec de la collagénase A (0,21 U / mg) dans un milieu sans sérum (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifuger la solution résultante à 170 g pendant 3 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les culots de cellules dans 5 ml de milieu complet.
- Ensemencer les chondrocytes isolés sur 25 cm 2 flacons de culture de tissus dans 5 ml de milieu complet et garder dans une culture tissulaire incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cultiver des chondrocytes à une densité de 80%.
- Libérer les cellules fflacons de ROM en lavage en PBS 2x avant de l'exposer à 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3 min. Une fois chondrocytes se détachent, arrêter la trypsine par addition de 10 pi de milieu complet.
- Centrifuger la suspension à 300 g (3 min) et remettre le culot dans un milieu complet.
- cellules de semences dans des flacons de culture de tissus (75 cm 2) et le partage dans un rapport de 1:3 (~ 5000 cellules / cm 2) toutes les 5 e jour ou à 80% de confluence.
- Déterminer le nombre de cellules et la viabilité par coloration au bleu trypan.
C. culture des cellules de la matrice
- Avant de lavage d'implantation et les cellules de libération tel que décrit ci-dessus. Effectuer le nombre de cellules et de transférer 5 x 10 4 cellules dans un tube de 1,5 ml. Puis centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
- Resuspendre le culot dans 15 ul de milieu complet pour une saturation complète de la matrice.
- Couper la bicouche échafaudage de collagène aux dimensions exactes du défaut trochlear par une biopsie stérilepunch.
- Lieu matrice dans un plat de culture de tissus de taille appropriée (par exemple des plaques à 24 puits).
- des cellules de semence sur la face poreuse, adhésif de cellule de la matrice. Cela décourage la migration cellulaire loin de la matrice.
- Laisser matrices de cellules ensemencées sans autre milieu de culture des cellules dans un incubateur pendant 1 heure pour permettre le plein respect des chondrocytes.
- Ensuite, placez cellule-matrice-constructions dans des récipients de culture (par exemple des plaques à 24 puits) avec un milieu complet frais. Prenez soin de ne pas laver les cellules au large de la matrice même si une forte adhésion est attendue.
- Maintenant, cell-matrix-constructions peuvent être prises pour la salle de chirurgie pour une nouvelle implantation.
D. assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues
- Effectuer arthrotomie parapatellaire au genou controlatéral comme décrit ci-dessus (A. 1-8).
- Créer deux défauts cartilagineuses isolées dans la gorge de la trochlée avec un operatin d'air stérileg perceuse électrique (3,6 mm de diamètre).
- Nettoyez le défaut et rincer avec une solution saline stérile.
- Il faut faire attention de ne pas ouvrir la cavité de la moelle à tout moment. Si nécessaire, sceller le fond des défauts avec cautérisation électrique contre les saignements.
- Implant les matrices ensemencées avec les chondrocytes en culture avec la face vers le bas de la face poreuse (figure 2). Puis press-fit dans les trous de forage et rincer la surface environnante.
- Sceller les matrices implantés avec un peu de colle de fibrine (Tissucol Duo S) afin d'assurer une fixation sûre.
- Après coagulation, déplacer la rotule à l'intérieur de la gorge de la trochlée et appliquer gamme complète de mouvement de l'articulation du genou à quelques reprises.
- Déplacer la rotule latéralement une fois de plus et vérifier pour tout événement ou signe de fixation instable. Les matrices doivent être tenus toujours en place.
- Remplacez à nouveau la rotule et terminer l'opération avec la fermeture des plaies dans les couches et les embruns s'habiller comme décrit ci-dessus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La technique chirurgicale décrite permet une isolation efficace et implantation de chondrocytes autologues dans un défaut chondral artificielle. Le dispositif expérimental a entraîné une intégration réussie de l'implant dans le cartilage environnant.
Après 12 semaines in vivo, le défaut chondral a été comblé par la réparation des tissus avec une surface homogène et intact, ce qui réduit la contrainte de cisaillement et des dommages à l'implant (Figure 4). En outre, aucune hypertrophie ou calcification de l'implant a été vu. La réparation des tissus a montré une solide rigide et de qualité, ce qui est comparable à la bonne santé des tissus environnants de cartilage. Ce fut un aspect important parce que la charge accrue sur le cartilage adjacent due à l'insuffisance propriétés biomécaniques de l'implant serait un risque pour la dégénérescence prématurée. En outre, une greffe délaminage n'a pas eu lieu. Après avoir coupé la membrane de la même taille du défaut avant l'intervention, une fissuanneau ou fentes entre l'implant et le cartilage entourant ont été évités.
Figure 1. Monocouche de chondrocytes culture primaire à 80% de confluence.
Figure 2. Prenant une biopsie de cartilage de la gorge trochlée fémorale.
Figure 3. Artificiellement créé lésion du cartilage trochlear.
Figure 4. Ouvert du genou 12 semaines après l'implantation d'une membrane ensemencée avec chondrocytes autologues dans un préForé défaut chondral (flèche rouge).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole présenté fournit une technique établie 9,12,13 et facilement reproductible pour isoler les chondrocytes autologues pour la prolifération ultérieure et la réimplantation dans des défauts du cartilage créés artificiellement à genoux de lapin. L'utilisation de chondrocytes autologues pour le remodelage et la réparation des lésions du cartilage articulaire est déjà en utilisation clinique fournissant des résultats satisfaisants à long terme 6.
Les principaux problèmes comme par exemple l'hypertrophie du périoste et la calcification, la greffe délaminage ou morbidité du site donneur eu lieu avec la première et la deuxième génération d'implantation de chondrocytes autologues 14. C'est pourquoi les chercheurs ont développé des techniques utilisant des matériaux biorésorbables exogènes à livrer chondrocytes au site de la lésion. L'effet positif du système de culture en trois dimensions sur le maintien des caractéristiques chondrocytaires a été démontré à maintes reprises, par exemple lors de l'utilisation d'agarose 15, Poly - dioxanon polyglactine et 16, les polyesters de poly (L-lactide) (PLLA) et le poly (D, L-lactide-coglycolide) (PLGA) 17, 12 fibrine, l'acide hyaluronique 18, 19 alginate, de collagène ou de collagène 20-matrices 9 .
La membrane de collagène bicouche Chondro-Gide utilisé dans cette étude a été appliquée avec succès dans plusieurs études précliniques avant 9,21,22 et fait déjà partie des applications cliniques 21,23. La structure bicouche de la membrane de collagène offre un microenvironnement stable pour l'intégration et la prolifération des chondrocytes, permet une répartition homogène des cellules dans la matrice et élimine la possibilité d'une fuite de la cellule tel qu'il est vu dans ACI classique 11. Par l'utilisation de cette technique MACT, les chondrocytes transplantés sont conservées localement avec la viabilité maintenu. La transplantation de chondrocytes autologues assistée par matrice conduit à la synthèse d'cartilage comme le tissu de régénération et est cliniquement applicable 21.
Le modèle animal décrit est bien acceptée dans le traitement expérimental de lésions du cartilage articulaire 11,24,25. Cependant, la traduction de routine clinique des résultats possibles d'expériences utilisant la technique présentée est difficile pour plusieurs raisons. Dans un modèle animal, il est presque impossible d'atteindre non ou partielle de port de poids dans les premiers jours / semaines après la chirurgie qui seraient généralement recommandé de permettre aux cellules implantées à commencer par les processus d'intégration rapide. Poids en charge complète immédiatement après la chirurgie pourrait nuire à la transplantation et pourrait donc influer sur le résultat. Mais cette option était similaire dans tous les modèles animaux comparables 9,12. Des expériences avec des animaux de grande taille, ressemblant de plus près la situation des droits sont garantis dans d'autres études sur les animaux.
En résumé, cependant, un courrier établimodèle animal Xperimental comme il est décrit ci-dessus fournit une base pour d'autres études expérimentales de réparation du cartilage et pourrait même faciliter la réalisation et la performance des paramètres d'étude complexes. Examens expérimentaux avec des facteurs de croissance, l'induction de gènes et modification des propriétés de la matrice en utilisant ce modèle animal pourrait être utile pour améliorer les paramètres cliniques établies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par l'Association allemande pour la recherche (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
