Summary
用于治疗在兔子的膝关节软骨缺损的实验技术进行说明。在矩阵上的自体软骨细胞植入是被广泛接受的方法重塑和修复关节软骨病变提供满意的长期效果。基质辅助自体软骨细胞移植（MACT）提供一个标准化的临床植入方法。
Abstract
关节软骨缺损被认为是一个主要的健康问题，因为关节软骨具有自我再生能力是有限的。未处理的软骨病变导致持续的疼痛，生活质量造成不利影响，并易患骨关节炎。在过去的几十年中，一些外科技术已被开发来治疗这种病变。然而，到现在为止，这是不可能实现了全覆盖肺透明关节软骨缺损或提供令人满意的长期恢复2-4维修。因此，关节软骨损伤仍然再生技术，如组织工程的首要目标。相反，其他外科手术技术，这往往导致纤维或纤维软骨组织的形成，组织工程的目的是充分恢复原来的关节软骨的复杂结构和性能的影响通过使用诱导成软骨细胞的移植细胞的潜力。 ŗ最近几个发展开辟了前景的可能性再生软骨疗法。
第一个单元格为基础的全层软骨或骨软骨病变的治疗方法是在1994年由Lars彼得森和Mats Brittberg的的谁率先临床自体软骨细胞移植（ACI）5。如今，该技术在临床上以及建立大型的膝盖软骨缺损的治疗，植入后6甚至10至20年中保持了良好的临床效果。近年来，自体软骨细胞植入经历了快速进展。使用一个人工的三维胶原基质上的细胞，其后再植变得越来越流行7-9。
MACT包括两个手术：首先，为了收集软骨细胞，软骨活检需要执行从非负重软骨区的t他的膝关节。然后，软骨细胞的提取，纯化，并扩展到足够的细胞数量的影响 。软骨细胞，然后接种到一个三维矩阵，并随后可以被重新注入。当准备植入组织工程，增殖率和分化的能力是至关重要的一个成功的组织再生10。一个三维基质作为细胞载体的使用被认为是支持这些细胞的特征11。
以下协议将总结并展示一种技术，用于隔离的软骨细胞软骨活检，其在体外增殖和他们的播种到一个三维矩阵（ 软骨纪德 ，Geistlich生物材料，Wollhusen，瑞士）。最后，植入到人工创造的兔子的膝关节软骨缺损的细胞和基质的构建进行说明。这种技术可以用作一个实验设定进一步的实验中软骨修复。
Protocol
A.软骨活检（外科室;步骤1-5在非无菌制剂室）
- 执行最终控制体重的兔子（新西兰白兔，女性，体重3.5-4.0公斤，6个月大），以便能够正确剂量的药物，并监测手术后的重量。
- 兔静脉注射10毫克/公斤的丙泊酚麻醉。
- 插管后，1.5毫克/公斤/分钟异丙酚和0.05毫克/千克静脉注射芬太尼维持麻醉。使用二氧化碳监测，脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉。
- 剃须用电动推剪和真空皮草膝盖上进行操作。
- 剃了膝盖彻底消毒，并用无菌敷料覆盖，其余的兔子。
- 触诊髌骨与髌骨内侧进行皮肤切口。
- 打开膝关节内侧髌骨关节切开，在无菌条件下。尽量避免切割任何小苏perficial血管。
- 横向置换髌骨。
- 检查任何异常的膝关节和宏观软骨病变。
- 小心剥离出滑车ossis的股二头肌的小软骨片（2-3毫米）用无菌手术刀（ 图1）。
- 立即将这些软骨活检到50毫升管与完全培养基（DMEM + 10％新生小牛血清（FCS）的+ 1％青霉素/链霉素（青/链霉素））的操作后，继续在体外培养权利。
- 清洁的缺陷，他们用无菌生理盐水冲洗。
- 重新髌骨内滑车槽。
- 伤口缝合在单纽扣缝线（4-0薇乔）和持续皮肤缝合（4-0 MONOCRYL）层。使用可吸收缝合材料。
- 最后，密封伤口，喷雾敷料可渗透水蒸汽。
B. 在体外培养
- 处理的活检Cartilage件尽快在无菌层流手术后的组织文化引擎盖。
- 在500×g离心3分钟，在RT下，洗净无菌收获的软骨2倍的PBS中，然后离心。
- 剪切软骨件为1毫米3，转移到50ml隼，在振荡器上30分钟，用10 ml的胰蛋白酶-EDTA（0.25％）和10毫升PBS和消化30分钟
- 30分钟后，停止加入完全培养基胰蛋白酶。然后，摇动另一软骨片胶原酶A（0.21 U /毫克）的无血清培养基（DMEM + 1％PEN /链球菌）12小时。
- 离心得到的溶液，在170×g离心3分钟，在RT。
- 在5毫升完全培养基中重悬细胞沉淀。
- 种子的25cm 2的组织培养瓶中，在5毫升的完整的介质中，并保持在潮湿的细胞培养箱在37℃下，5％CO 2的分离软骨细胞。
- 软骨细胞的生长密度为80％。
- 释放的细胞F罗烧瓶洗涤暴露于0.05％胰蛋白酶-EDTA 3分钟前，在PBS中2倍。一旦软骨细胞分离，停止胰蛋白酶，加入10微升的完全培养基。
- 离心悬浮在300 XG（3分钟）和完全培养基重悬沉淀。
- 在组织培养瓶（75厘米2）和1:3的比例（〜5000个细胞/ cm 2），每5天或80％汇合后，分割的种子细胞。
- 台盼蓝染色确定细胞的数量和活力。
C.细胞播种矩阵
- 注入洗涤和释放细胞之前，如上所述。进行细胞计数和5×10 4细胞转移到1.5毫升离心管中。然后在500 XG离心5分钟，在室温。
- 矩阵为一个完整的饱和度的15微升的完全培养基中重悬沉淀。
- 切的双层胶原蛋白支架滑车缺损的确切尺寸的无菌活检一拳。
- 将基体置于适当大小的组织培养皿中（ 如 24孔板）。
- 到多孔的，细胞基体的粘接剂侧的种子细胞。这阻碍了细胞迁移，相差的矩阵。
- 留下种子细胞矩阵没有进一步的细胞培养液中，1小时内的孵化器，，允许完全遵守的软骨细胞。
- 然后，细胞-基质构造成新鲜的完全培养基的培养容器（ 如 24孔板）与。小心不要洗出任何基质细胞脱落，即使预期附着力强。
- 现在，细胞 - 基质的结构可以采取重新植入手术的空间。
D.矩阵辅助自体软骨细胞移植
- 执行（A. 1-8）如上所述对侧膝髌骨关节切开。
- 创建两个隔离软骨缺损用无菌空气业庭在滑车沟G电源钻（直径3.6毫米）。
- 清洁的缺陷，并用无菌生理盐水冲洗。
- 应注意，在任何时候不开骨髓腔。如果有必要，密封的底部与电烙术的缺陷，防止出血。
- 植入与多孔面朝下（ 图2）与培养的软骨细胞接种的矩阵。然后压入钻孔冲洗周围表面。
- 带着一点点的纤维蛋白胶（Tissucol铎S），以确保安全可靠固定密封植入矩阵。
- 凝固后，滑车沟搬迁髌骨内全方位的运动，并应用到膝关节几次。
- 横向置换髌骨再次检查任何事件或固定不稳定的迹象。矩阵必须持有还是很到位的。
- 再次更换髌骨层和喷雾穿衣如上所述做完手术伤口缝合。
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Representative Results
手术技术允许一个成功的隔离和自体软骨细胞植入到人工软骨缺损。实验装置的植入导致一个成功的整合到周围的软骨。
12周后， 在体内的 ，均匀的和完整的表面，从而减少了到植入物（ 图4）的剪切应力和损坏软骨缺损修复组织填充。此外，没有肥厚或钙化的植入物被看见了。修复组织呈僵硬和坚实的质量，这是与周围健康软骨组织。这是一个重要的方面，因为由于没有足够的生物力学特性的植入物相邻软骨上的负载增加将是一个过早退化的风险。此外，嫁接分层并没有发生。切膜术前同样大小的缺陷，任何fissu避免植入物和周围的软骨环之间或裂。
图1。单层软骨细胞的原代培养，80％汇合。
图2。软骨活检的股骨滑车沟。
图3。人为制造滑车软骨缺损。
图4。开业膝关节植入后12周的膜与自体软骨细胞接种到一个预钻软骨缺损（红色箭头）。
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Discussion
该协议提供了一个建立了9,12,13和容易复制的技术，人为制造的兔子膝盖软骨缺损随后的增殖和再植入自体软骨细胞隔离。使用自体软骨细胞的重构和修复关节软骨病变已经在临床使用中提供满意的长期效果（6）。
例如骨膜肥厚和钙化的主要问题，移植物剥离，或与第一代和第二代的自体软骨细胞植入14发生的供体部位的发病率。因此，研究人员已经开发使用外源性的生物可降解材料的技术，提供软骨细胞的缺损部位。三维培养系统的维护软骨细胞的特性带来的正面影响已反复证明，例如，当使用琼脂糖15，的的聚- dioxanon和聚乳糖16，聚酯聚（L-丙交酯）（PLLA）和聚（D，L-丙交酯-coglycolide）（PLGA）17 12纤维蛋白，透明质酸18，藻酸盐19 20，胶原蛋白或胶原基质9 。
几种处于临床前研究，已成功地应用于双层胶原膜在这项研究中所使用的软骨纪德 9,21,22前已经临床应用的一部分21,23。胶原膜的双层膜结构的软骨细胞融合和增殖提供了一个稳定的微环境，允许细胞在基质中的均匀分布，并消除了细胞泄漏的可能性，因为它被认为是在传统的ACI 11。利用这种MACT技术，移植的软骨细胞留成保持活力。基质辅助的自体软骨细胞移植导致的合成再生软骨样组织和临床应用21。
所描述的动物模型以及接受实验性治疗关节软骨病变11,24,25。然而，临床上常规的翻译可能使用该技术的实验结果是困难的原因有几个。在动物模型中，这几乎是不可能实现非或部分负重，在手术后，一般会建议允许植入的细胞从早期一体化进程的第一天/周。可能损害移植手术后立即完全负重，因此可能会影响结果。但是这个设置是相似的动物模型与9,12。在进一步的动物研究实验较大的动物，类似人类的处境更加紧密，是必要的。
综上所述，然而，一个公认的ê上述的混合实验动物模型提供了基础，为进一步的实验研究软骨修复，甚至可以方便的实现复杂的研究设置和性能。使用这种动物模型实验考试与生长因子，基因诱导和不断变化的矩阵的性质可能有利于提高临床既定设置。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
该项目由德国研究协会（DFG，何4578/3-1）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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