כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים<em> In vivo</em>. שיטה זו מעסיקה לחיות<em> דרוזופילה</em> עובר כמודל רב עוצמה לphagocytosis הניטור של תאים אפופטוטיים באמצעות תיוג ספציפי של תאים וphagocytes אפופטוטיים.
Abstract
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis שלאחר מכן (אישור תאים אפופטוטיים) הוא חיוני להתפתחות תקינה בכל היצורים מטזואניים. אישור תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד קשר אינטימי עם מוות של תאים, תאים אפופטוטיים unengulfed נראים בקושי in vivo בתנאים רגילים. על מנת להבין את השלבים של אישור תאים אפופטוטיים השונים ולהשוות phagocytes "מקצועי" – מקרופגים ותאים דנדריטיים ל" הלא מקצועי "- תאים שכנים רקמת התושב, בהדמיה לחיות vivo של התהליך הוא יקר מאוד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללימוד אישור תאים אפופטוטיים בעוברים תסיסנית חיים. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של שלבים שונים בphagocytosis אנו משתמשים סמנים ספציפיים לתאים וphagocytes אפופטוטיים. בנוסף, אנו יכולים לעקוב אחר שתי מערכות תא בלען במקביל: מקרופאגים 'מקצועיים' ו 'חצי profeגליה 'ssional במערכת העצבים המרכזית בפיתוח (CNS). השיטה המתוארת כאן מעסיקה את עובר דרוזופילה כמודל מצוין ללימודים בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים.
Introduction
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis הבא הוא קריטי להתפתחות עוברית, כמו גם לאיזון רקמות במבוגר. Phagocytosis של תאים אפופטוטיים או סילוק תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד אשר ממשיך בארבעה שלבים: (1) גיוס של phagocytes לתאים אפופטוטיים ("למצוא אותי"), (2) הכרה בתא כיעד לphagocytosis ( 'אוכל אותי') ו (3) היבלעות, ואחריו (4) הבשלת phagosome והשפלה של החלקיקים אפופטוטיים 1-5. ישנם שני סוגים של phagocytes: מקרופגים "מקצועיים" ותאים דנדריטיים, ולא בשלה "הלא מקצועי" תאים שכנים רקמת תושבים, שהם חיוניים לשחרור מתאים אפופטוטיים במהלך מטזואניים פיתוח 6,7.
בפיתוח דרוזופילה, חיסול התאים מיותרים באמצעות אפופטוזיס מתרחש בשלושה מ 'שלבים ראשון בעין, באמצע לעובר מאוחר, ואז באמצע שנתי הגולם, ושוב בבוגרים המוקדמים. במהלך embryogenesis חלקיקים אפופטוטיים יוסרו על ידי phagocytes "מקצועי", מקרופאגים, ועל ידי האאקטודרם וגליה 8,9 "לא מקצועיים".
בעבודה הקודמת שלנו שזיהינו קולט phagocytic, שישה מיקרונים-תחת (Simu), אשר בא לידי ביטוי אך ורק בתאים phagocytic במהלך embryogenesis. באמצעות אמרגן Simu נוצר סמן ספציפי לאוכלוסיות תאי phagocytic (Simu-cytGFP) אשר מאפשרת לנו לעקוב אחר מקרופאגים, האאקטודרם וגליה במקביל בעובר חי 8 בפיתוח. בנוסף לכך, על ידי שימוש בסמנים ספציפיים לתאים אפופטוטיים בשלבים של אפופטוזיס שונים, אנו מסוגלים לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים in vivo.
Protocol
כדי לעקוב אחר הדינמיקה של אישור אפופטוטיים תא in vivo שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מתויגים: תאי phagocytic ותאים אפופטוטיים. כדי לסמן אוכלוסיות תאי phagocytic אנו משתמשים שורת דרוזופילה המכילים את הסמן Simu-cytGFP, אשר תוויות ?…
Representative Results
מסגרות נציג מסרט שבו תאים אפופטוטיים מסומנים עם Annexin V, וגליה, האאקטודרם ומקרופאגים מסומנים עם Simu-cytGFP מוצגות באיור 2. כל מסגרת היא השלכה של 3 פרוסות 2 מיקרומטר כל אחד. העובר של שלב 15 ממוקם כראוי מראה את מערכת עצבים העובר…
Discussion
אישור תאים אפופטוטיים הוא שלב אחרון קריטי של אפופטוזיס, שהוא מאוד דינמי. לכן לימודים בזמן אמת של התהליך הם בעלי חשיבות עליונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר ניטור של אישור תאים אפופטוטיים בחיים עובר תסיסנית מתפתחים. בהליך זה, שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי Reintegration גרנט (IRG249084). אנו מודים לכל חברי המעבדה Kurant.
Shklyar, B., Shklover, J., Kurant, E. Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50151, doi:10.3791/50151 (2013).