Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em> Drosophila</em> Embriogénesis
Summary
Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular apoptótica<em> In vivo</em>. Este método emplea vivir<em> Drosophila</em> Embriones como un poderoso modelo para el monitoreo fagocitosis de las células apoptóticas mediante un etiquetado específico de las células apoptóticas y los fagocitos.
Abstract
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrantes mediante apoptosis y la posterior fagocitosis (aclaramiento de las células apoptóticas) es crucial para el desarrollo normal en todos los organismos metazoos. Aclaramiento celular apoptótica es un proceso muy dinámico íntimamente asociada con la muerte celular, las células apoptóticas unengulfed apenas se observan in vivo en condiciones normales. Con el fin de entender los diferentes pasos de aclaramiento celular apoptótica y de comparar los fagocitos "profesionales" – macrófagos y las células dendríticas a 'no profesional' – células vecinas tejido residentes, en vivo de imágenes en vivo del proceso es extremadamente valiosa. Aquí se describe un protocolo para el estudio de aclaramiento celular por apoptosis en embriones de Drosophila vivas. Para seguir la dinámica de los diferentes pasos en la fagocitosis que utilizamos marcadores específicos de células apoptóticas y los fagocitos. Además, podemos controlar dos sistemas de fagocitos en paralelo: los macrófagos "profesionales" y "semi-profeglía ssional 'en el sistema nervioso central en desarrollo (SNC). El método descrito aquí utiliza el embrión de Drosophila como un excelente modelo para estudios en tiempo real de despacho de las células apoptóticas.
Introduction
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrante a través de la apoptosis y la subsiguiente fagocitosis es crucial para el desarrollo embrionario, así como para la homeostasis del tejido en el adulto. La fagocitosis de las células apoptóticas o el aclaramiento celular por apoptosis es un proceso muy dinámico que se desarrolla en cuatro etapas: (1) la contratación de los fagocitos a la célula apoptótica ("find-me»), (2) el reconocimiento de la célula como un objetivo para la fagocitosis ( "comer-me ') y (3) inmersión, seguido de (4) la maduración del fagosoma y la degradación de la partícula apoptosis 1-5. Hay dos tipos de fagocitos: macrófagos "profesionales" y las células dendríticas inmaduras, y el "no profesionales" células de tejidos vecinos residentes, que son cruciales para la remoción de células apoptóticas durante el desarrollo metazoos 6,7.
En el desarrollo de Drosophila, la eliminación de células superfluas a través de la apoptosis se produce en tres mfases Ain, por primera vez en la segunda mitad de embriones tarde, entonces a mediados de pupa, y de nuevo a principios del adulto. Durante la embriogénesis partículas apoptóticas son eliminados por los fagocitos "profesionales", los macrófagos y por ectodermo y glia 8,9 «no profesional».
En nuestro trabajo anterior hemos identificado un receptor fagocítico, seis micras-bajo (SIMU), que se expresa exclusivamente en las células fagocíticas durante la embriogénesis. Utilizando el promotor simulación que generó un marcador específico de las poblaciones de células fagocíticas (simu-cytGFP) lo que nos permite monitorear los macrófagos, ectodermo y glia simultáneamente en un concierto embrión en desarrollo 8. Además, mediante el uso de marcadores específicos para células apoptóticas en diferentes etapas de la apoptosis, somos capaces de seguir la dinámica de aclaramiento celular apoptótica in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aclaramiento celular apoptótica es una última etapa crítica de la apoptosis, la cual es altamente dinámico. Por lo tanto los estudios en tiempo real del proceso son de suma importancia. Aquí se describe un protocolo que permite la supervisión del despacho de células apoptóticas en el desarrollo de embriones de Drosophila vivir. En este procedimiento, dos poblaciones de células deben marcarse mediante marcadores específicos: las células apoptóticas y los fagocitos. El reportero simular cytGFP</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una Marie Curie Reintegración Grant (IRG249084). Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kurant.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
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