Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata
Summary
Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.
Abstract
Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema valido modello per esplorare la funzione del muscolo scheletrico e per lo studio delle malattie muscolari umane. Nonostante i numerosi vantaggi offerti da analisi in vivo del muscolo scheletrico nel zebrafish, visualizzando l'ambiente proteina complesso e finemente strutturato responsabile per la funzione muscolare, soprattutto in embrioni interi, può essere problematico. Questo ostacolo deriva dalla piccola dimensione del muscolo scheletrico zebrafish (60 micron) e le dimensioni ancora più piccolo del sarcomero. Qui descriviamo e dimostrare un metodo semplice e rapido per isolare miofibre scheletriche da embrioni di zebrafish e larve. Abbiamo anche i protocolli che illustrano le tecniche di preparazione post utili per analizzare la struttura e la funzione muscolare. In particolare, abbiamo dettaglio la successiva localizzazione immunocitochimica delle proteine dei muscoli scheletrici e l'analisi qualitativa del rilascio del calcio stimolato via live Calcio Imaging cellulare. Nel complesso, questo videoarticolo fornisce un metodo straight-forward ed efficace per l'isolamento e la caratterizzazione di miofibre scheletriche zebrafish, una tecnica che prevede un condotto per la miriade di successivi studi di struttura e funzione muscolare.
Introduction
Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente specializzato responsabile della generazione delle forze necessarie motilità contrattili. La contrazione è iniziata attraverso un processo noto come eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento che converte i segnali elettrici di rilascio di calcio dai depositi intracellulari 1,2. Rilascio di calcio intracellulare attiva il sarcomero di accorciare e generare forza. I numerosi componenti specifici della macchina molecolare responsabile mediare la trasmissione neuromuscolare svincolo 3, accoppiamento EC 4,5, e actina-miosina contrazioni dipendenti 6 continuano ad essere oggetto continuo di intensa ricerca. Inoltre, le proteine che stabilizzano la membrana del muscolo durante la contrazione 7,8 e che mediano la segnalazione tra il myofiber e la matrice extracellulare 7,9 sono stati identificati e studiati nei minimi dettagli.
Mutazioni in un certo numero di geni importanti per una struttura muscolarefunzione nd sono stati identificati come causa di malattie del muscolo scheletrici umani ( http://www.musclegenetable.org/ ). Queste malattie, classificati in linea di massima come miopatie scheletriche e distrofie muscolari basati su caratteristiche cliniche e istopatologiche, sono associati a debolezza muscolare, invalidità permanente e 10,11 mortalità precoce. Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema eccezionale per la modellazione e lo studio delle malattie del muscolo scheletrici umani 8,12,13. E 'stato impiegato per validare nuove mutazioni del gene 8, definire nuovi aspetti della malattia fisiopatologia 14,15, e identificare nuovi approcci terapeutici 15,16. La potenza della zebrafish per studio delle malattie muscolo umano riferisce al maggior numero di figli, il rapido sviluppo della struttura muscolare e funzione, la chiarezza ottica dell'embrione zebrafish, e la facilità di manipolazione genetica e farmacologica della zebra sviluppopesce 17.
Noi e altri 12,18,19 recentemente sviluppato una tecnica semplice per l'isolamento rapido ed efficiente miofibre dal zebrafish sviluppo. Questo metodo ha permesso l'esame di miofibre in maggior dettaglio che può essere fornita da intera analisi embrione. La tecnica è stata sfruttata per la caratterizzazione della proteina localizzazione subcellulare 20 nonché per l'identificazione di importanti caratteristiche istopatologiche come parte di studi di validazione in modelli di malattia di nuova concezione 21. Inoltre, miofibre isolate possono inoltre essere utilizzati per l'imaging dal vivo e per gli studi elettrofisiologici 22, tecniche che consentono l'interrogatorio di aspetti fondamentali della funzione muscolare. Il protocollo specifico per l'isolamento miofibre, insieme a due esempi di esperimenti successivi analitiche, è dettagliata nelle parti rimanenti di questo manoscritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish sono un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo muscolare e la funzione in vivo 25,27,28. Essi hanno anche emerso come un bene prezioso per la modellazione di malattie muscolari umane 14,15,20,29. Mentre i grandi passi avanti sono stati compiuti per promuovere l'uso e l'applicazione di zebrafish per lo studio della funzione muscolare e delle malattie del muscolo, vi è una necessità critica costante per sviluppare strumenti che consentano più approfo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer), che hanno contribuito allo sviluppo della tecnica e alla produzione del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Taubman, il Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Michigan, e in parte da sovvenzioni dal Distrofia Muscolare (JJD MDA186999) e il National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
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