Summary
Данио рерио являются возникающие система для моделирования человека расстройств скелетных мышц. Мы описываем быстрый и эффективный способ, чтобы изолировать скелетные мышечные волокна мышц из эмбриональных и личинок рыбок данио. Этот метод дает высокую плотность подготовку миофибрилл, подходящую для изучения одной морфологии скелетные мышечные волокна, белок внутриклеточную локализацию и мышечной физиологии.
Abstract
Данио оказалась ценным модельной системой для изучения функции скелетных мышц и для изучения заболеваний человека мышц. Несмотря на многие преимущества, которые с помощью анализа в естественных скелетных мышц в данио, визуализации сложных и тонко структурированной белка, ответственного за среду мышечной функции, особенно в целых эмбрионов, может быть проблематичным. Это препятствие связано с небольшим размером данио скелетных мышцах (60 мкм) и даже меньшего размера саркомера. Здесь мы описывают и демонстрируют простой и быстрый способ выделени скелетные мышечные волокна из эмбрионов данио рерио и личинок. Мы также включают в себя протоколы, которые иллюстрируют сообщению методы подготовки полезные для анализа структуры и функции мышц. В частности, мы подробно последующее иммуноцитохимическая локализация скелетных белков мышечных и качественный анализ стимулированного высвобождения кальция через живого изображения клетки кальция. В целом, это видеостатья предусматривает прямой и эффективный метод для выделения и характеристики данио скелетных мышечных волокон, методики, которая обеспечивает канал для множества последующих исследований структуры и функции мышц.
Introduction
Скелетных мышц является узкоспециализированной ткани отвечает за генерацию сократительному силы, необходимые для подвижности. Сокращение инициируется посредством процесса, известного как возбуждение-сжатие (ЕС) связи, который преобразует электрические сигналы в высвобождения кальция из внутриклеточных депо 1,2. Внутриклеточного выброс кальция активирует саркомера, чтобы сократить и генерировать силу. Многие конкретные компоненты молекулярных машин, ответственного за посредничество передачу нервно-мышечного соединения 3, EC связь 4,5 и актин-миозиновых зависимые сокращений 6-прежнему являются постоянным предметом интенсивных исследований. Кроме того, белки, которые стабилизируют мышечную мембрану во время сжатия 7,8 и что передачу сигналов между мышечное волокно и внеклеточного матрикса 7,9 были выявлены и изучены в мельчайших подробностях.
Мутации в ряде генов, важных для мышечной структуры аФункция й были определены в качестве причин скелетных заболеваний мышц человека ( http://www.musclegenetable.org/ ). Эти заболевания, классифицированные в широком смысле как скелетных миопатиях и мышечной дистрофии, основанных на клинических и гистологических особенностей, которые связаны с мышечной слабостью, пожизненной инвалидности, и в начале 10,11 смертности. Данио оказалась выдающимся система для моделирования и изучения скелета заболеваний мышц человека 8,12,13. Это был использован для проверки новых генных мутаций 8, определить новые аспекты заболевания патофизиологии 14,15, а также определить новые терапевтические подходы 15,16. Власть рыбок данио для изучения болезни человека мышечной относится к большому числу потомков, быстрым развитием мышечной структуры и функции, оптической ясности эмбрионов рыбок данио, и легкость генетической и фармакологической манипуляции развивающихся зебрырыба 17.
Мы и другие 12,18,19 недавно разработали простую технику для быстрого и эффективного выделения мышечных волокон из развивающихся данио. Эта методология позволила рассмотрение мышечных волокон более подробно, чем может быть предоставлена всем анализа эмбриона. Методика была использована для характеристики белка внутриклеточной локализации 20, а также для идентификации важных гистологических характеристик, как часть исследований по валидации в недавно разработанных моделей заболеваний 21. Кроме того, отдельные мышечные волокна дополнительно могут быть использованы для живого изображения и электрофизиологических исследований 22, методик, которые позволяют опроса ключевых аспектов мышечной функции. Конкретный протокол для изоляции мышечное волокно, вместе с двумя примерами последующих аналитических экспериментов, подробно описана в остальных частях этой рукописи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение поли-L-лизин покрытием Покровные (Время: 1 час)
Лакокрасочные покровные позволяет быстро мышечное волокно расселения и адгезии. Это может быть выполнено при диссоциации шаге выделения миофибрилл (шаг 2 ниже).
- Вырезать и поместить парафильмом на дне 60 мм чашки Петри (любой марки).
- Наведите стеклянные промахи микроскоп крышки (диаметр 12 мм) на парафильмом в 60 мм блюдо культуры ткани или разместить их индивидуально в отдельных скважинах 24-луночных планшетах.
Примечание 1: Эти маленькие круглые покровные помогают сосредоточиться мышечное волокно цифры и уменьшить использование количества антител.
Примечание 2: Другие покровные размер будет работать, однако объемы реагентов и эмбрионов, используемых должны быть соответствующим образом скорректированы.
- Пипетка 50-200 мкл из поли-L-лизин растворе (0,01%) на каждом покровном стекле в чашке Петри.
- Разрешить покровные сидеть по крайней мере один хоур при 37 ° С Более длинные инкубации не будет негативно влиять на результаты.
- Удалить поли-L-лизин решение от покровного стекла и мыть дважды с минимумом 100 мкл 1x PBS.
- Разрешить покровные высохнуть.
- Покровные готовы к мышечных волокон.
Примечание 3: Для обеспечения стерильности, покрытие может быть сделано в капюшоне и на автоклавного покровные.
Примечание 4: Держите 60 мм чашки Петри с парафильмом на дне. Эта установка будет использоваться во время мышечное волокно обшивкой и иммунного (поздние стадии).
Вариант 1: Вместо покрытия покровные непосредственно перед использованием, с покрытием покровное запас может быть использован. Блюдо 60 мм Петри содержащие минимум 2 мл поли-L-лизина можно хранить при температуре 4 ° С, содержащей многочисленные покровные. Этот вариант начинаются от стадии 1.5 для обработки покровные для мышечных волокон.
Вариант 2: Мы также пальто покровные в поли-L-орнитин. Тего более трудоемок, но полезно для долгосрочного культивирования потому поли-L-орнитин покровные покрытием может быть УФ лечение. С УФ лечения и тщательного стерильных живые мышечные волокна, как правило, может поддерживаться в культуре от 4-7 дней.
2. Разобщенность эмбрионов рыбок данио и обшивки мышечных волокон (Time: от 1 до 3 ч)
Примечание: стандартный протокол применяется все возможное, чтобы 3 DPF (дней после оплодотворения) эмбрионов.
- Передача эмбрионов данио рерио в стандартный 1,5 мл центрифужную пробирку и удалить как можно больше избыток рыбы воды, сколько возможно. Как правило, 10-20 эмбрионов на пробирку, хотя и менее могут быть использованы. Использование более чем 20-25 эмбрионов часто приводит к чрезмерной подготовки плотности.
- Удалить хорионов до диссоциации, вручную с помощью # 5 щипцы. Кроме того, удаление химического хориона достигается при 10-15 минутах лечения проназа. Как правило, предыдущее удаление хориона нужен только, когда перед подтверждением на Мутмуравей фенотип или морфология требуется, или при использовании стадий, где эмбрионы естественно вылупился из их хориона.
- Добавить 900 мкл СО 2 независимых СМИ в пробирку, содержащую эмбрионов.
- Добавить 100 мкл коллагеназы типа II, конечная концентрация 3,125 мг / мл (со коллагеназы решение в 31.25 мг / мл разводят в 1x PBS), чтобы начать диссоциации. Коллагеназы IV также могут быть использованы для диссоциации.
- Поворот эмбрионов на орбитальном шейкере и растирают каждые 30 мин при комнатной температуре с использованием P1000 Pipetman для растирания.
Примечание 2: Тщательно контролировать эмбриона диссоциации; над или под диссоциации (особенно старше) являются наиболее распространенными причинами отказа протокола. Времена для переваривания будет варьироваться в зависимости от интенсивности растирание, количества зародышей на пробирку и возраста эмбрионов. Это также часто менее (по сравнению с дикого типа) для эмбрионов из скелетных мутантов мышц.
Примечание3: Среднее время пищеварения за эмбрионов возраста: 1 DPF = 1 час, 2 денье = 1,5 ч, 3 денье = 2 часа и 4 DPF = 2-2,5 часа.
- Остановить пищеварение, когда не видны целые эмбрионы, но твердые кусочки еще видны - это очень важно для предотвращения избытком.
- Пробирки центрифужные с диссоциированных эмбрионов на 0.8-2.3 мкг в течение 3-5 мин для осаждения клеток.
- Удалить супернатант из гранулированных клеток и мыть 2 раза с СО 2 независимых СМИ.
- Добавить свежий CO 2 независимых средств массовой информации, чтобы ресуспендирования клеток. 1 мл обычно используется для Preps 10-20 эмбрионов. Объем можно масштабировать в зависимости от количества эмбрионов.
- Использование P1000 пипетки, пройти эмбриона суспензии через 70 мкм фильтр. Это помогает удалить нежелательные мусора из преп.
Примечание 4: Embryo подвеска могут быть отфильтрованы во второй раз через 40 мкм фильтр для дополнительного удаления нежелательного мусора. С двойной фильтрации, восстановления approximленно 800 мкл из исходного объема 1 мл.
- Добавить приблизительно 50-100 мкл суспензии миофибрилл в каждом покровном стекле с покрытием поли-L-лизина.
Примечание 5: Выполните шаг 2,9 в чашках Петри с Parafilm на дне, подготовлены заранее. Парафильмом держит мышечное волокно отстранение от убегал покровные покрытием. Держите чашки Петри, покрытые для предотвращения испарения.
- Разрешить мышечные волокна урегулировать примерно 1 час на покровные покрытием при комнатной температуре.
Примечание 6: мышечных волокон начнет оседать в пределах 5-10 мин. Тем не менее, для правильного прикладывания мышечное волокно, не менее 1 ч (1-2 ч) рекомендуется. Разрешение мышечные волокна довольствоваться уже не повредит преп. Для более длинных инкубации (в том числе на ночь), антибиотики могут быть добавлены к средствам массовой информации. С антибиотиками и стерильных живые культуры, как правило, может поддерживаться в течение 1-2 дней.
- Онлайн мyofibers можно наблюдать в этой точке. Мышечных волокон из эмбрионов 2 DPF и позже будет рассматриваться как поперечно-полосатых и вытянутых клеток (рис. 1). В этот момент мышечные волокна теперь готовы для анализа живой или иммунного.
Примечание 7: скелетных мышц с 1 DPF эмбрионов не пластины, как удлиненные и четко поперечно-полосатых волокон. Вместо больших myoballs могут. Кроме того, в период после диссоциации гранулирование фазы (шаг 2,6), 1 денье myoballs должны быть центрифугировали в течение как минимум 8 мин при 5000 х г для достижения гранул. Для анализа эмбрионов на этой стадии, рекомендуется использовать трансгенную линию, выражающую EGFP в частности, в скелетных мышцах 23. Это позволит идентифицировать клетки мышц от происхождения по сравнению с другими источниками.
3. Флуоресценции Иммуноокрашивание диссоциированных рыбок данио мышечных волокон (Время: примерно за 1 день)
3.1. Иммуномечение
- Удалить частьмедиафайлы от мышечных волокон придерживались покровного стекла с покрытием
- Исправить клеток с использованием 4% параформальдегида или метанол. Для PFA, удалить ½ объема средств массовой информации и заменить тем же количеством PFA. Fix в течение 10 мин при комнатной температуре, затем снимите общий объем, заменить 50-100 мкл PFA, и исправить в течение дополнительных 10 мин. Для фиксации спирт, лед холодным метанолом или ацетоном может быть применен при 4 ° С в течение 10 мин или 5 мин, соответственно.
- Вымойте мышечные волокна не менее 3-5x с 1x PBS или 1x PBS плюс 0,1% Твин. Средний объем стирки 50-100 мкл на покровное.
- Добавить блокирования решение мышечных волокон (рабочий запас) и инкубировать 20-60 мин при комнатной температуре. Блокирующего раствора будет зависеть от первичных и вторичных антител. Два наиболее распространенных использованы в лаборатории: (1) 1X PBS, 2 мг / мл BSA, 1% овец сыворотки, 0,25% Triton X-100 окончательным и (2) 0,2% Тритон Х-100, 2 мг / мл (0,2 % БСА) и 5% овечьей / козьей сывороткой.
- Удалить блокировании решения и добавить первичного антитела, разбавленного в любом бзамок решение или PBS. Выдержите мышечные волокна в течение ночи при 4 ° С. Убедитесь, что обе парафильмом или заверните в Саран обернуть чашку Петри, содержащую мышечное волокно загружены покровные, покрытые антителами. Небольшие кусочки смоченной бумажной салфеткой могут быть добавлены для создания влажной камере.
- Удалить первичного антитела от покровных и мыть покровные 3-5x в течение 5 мин с PBS или блокирующий раствор.
- Добавить вторичного антитела в соответствующей концентрации, разведенного в 1x PBS или блокирующим раствором в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
- Удалить вторичного антитела и мыть мышечных волокон 3-5x в PBS в течение 5 мин каждого при комнатной температуре.
3.2. Монтажные покровные
- Нанесите 1-2 капли antifade реагентом для предметное стекло микроскопа.
- Тщательно пикап с покрытием и immunolabled покровное с помощью щипцов и место (мышечные волокна вниз) покровное на antifade реагента на предметное стекло.
Примечание 1: Внимание к ориентации Coated покровное имеет решающее значение.
- Положите 1-2 Kimwipes на жестком твердой поверхности. Быстро переверните слайд с покрытых покровные опираясь на antifade реагента и поместить его (покровное вниз) на Kimwipes.
- Применить светового давления углах стекло микроскопа, чтобы удалить лишнюю antifade и образуют герметичное уплотнение между горкой и покровного стекла
- Позволить antifade остальные высохнуть в течение 5-10 мин при комнатной температуре, затем мышечные волокна готовы к изображению (фиг. 2A и B) или хранить при 4 ° С.
4. Живых изображений сотовый Кальций Использование GCaMP3
Эксперименты живая клетка может быть выполнена на мышечных волокон до фиксации (следующий шаг 2,10). Следующий протокол описывает живого изображения в мышечных волокон, экспрессирующих GCaMP3 24, генетически закодированного индикатор кальция, выраженную скелетных мышц конкретного данио α-актин промотора (pSKM) 23. Кроме того,Эта методика может быть легко адаптирован для использования индикатора кальция красители, такие как фура-2.
- Введите эмбрионов с pSKM: GCaMP3 построить на стадии 1-2 клеток
- В 3 денье, собирать личинки и подготовить мышечные волокна, как описано в разделах 1 и 2. Разрешить мышечные волокна придерживаться в течение не менее 1 часа. Для реализации этой технологии, подготовка покровные в блюдах с 24 лунками требуется.
- Тщательно удалите остатки средств массовой информации, и добавить 300 мкл свежей СО 2 независимых СМИ при комнатной температуре.
- Заметим, клетки под инвертированным микроскопом. GCaMP3 положительные мышечные волокна должны быть видны под зеленой флуоресценции.
- Настройка камеры для записи, если это необходимо.
- Подготовьте 30 мм кофеина решение в СО 2 независимых СМИ. Чтобы стимулировать клетки, мягко пипетки 300 мкл кофеина раствора в скважину при увеличении. В 5-10 сек, GCaMP положительные мышечные волокна должны реагировать на кофеин с быстрым увеличением флуоресценции (рис. 3). MyofibERS может также сокращаться. Следует отметить, что кофеин вызывает высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума магазинах 25. Другие агенты, такие как KCl и 26 рианодиновых 4, может быть использован для изучения индуцируемую высвобождение кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Люминесцентная иммуномечение мышечных волокон (рис. 2)
Изображения, показывающие ожидаемое флуоресцентных меток шаблон из мышечных волокон иммуноокрашиванию после успешного изоляции и обшивки. В мышечные волокна были помечены либо анти-рианодинового рецептора (1:100) (рис. 2А) или анти-α-актинина (1:100) (рис. 2В) антитела, и выявить иммуноокрашивания триады и Z-Band соответственно. Вторичные антитела были использованы Alexa Fluor 555 (1:500). Изображения получены с помощью конфокальной микроскопии.
Индуцированные выброс кальция из мышечное волокно (рис. 3)
Панель серии показывая представительство высвобождение кальция из изолированной мышечное волокно обработанной с кофеином. Короче говоря, эмбрионы рыбок данио вводили на стадии одного клеток с pSKM: GCaMP3 конструкция. В 3 денье, эмбрионы подвергали диссоциации и высевали, как описано в прotocol. Для анализа были отобраны GCaMP3 экспрессирующие мышечные волокна, как указано в присутствии зеленой флуоресценции на исходном уровне. Использование микропипетки для введения препарата, выбранный волокна купалась в растворе 30 мМ кофеина, чтобы вызвать высвобождение кальция. Запись видео было начато до кофеина применения и продолжалось до пика флуоресценции не было достигнуто. Эта фигура демонстрирует нормальную кофеина индуцированный высвобождение кальция, а также метод может быть использован для опроса соединительный аппарат возбуждение-сжатие через живого изображения.
Рисунок 1. Принципиальная Хронология эмбрионов диссоциации. Последовательные панели (сверху вниз) иллюстрируют отдельные шаги, сроки и оборудование, необходимое для эмбриона диссоциации.) Выбор эмбрионов для диссоциации. Шкала бар 500 мкм. Б) ЯМаг установки диссоциации. Эмбрионы находятся в СМИ и коллагеназы, вращаясь, пока достаточно не диссоциируют (шаг Протокол 2) С) Изображение обоих методов мышечное волокно гальванических;. Круглые покровные или 24-луночные планшеты (Протокол шаги 1 и 4, соответственно) D) светлого поля. Образ живут в отрыве данио мышечные волокна высевали на поли-L покровные лизина покрытием. Стрелки обозначают удлиненные мышечные волокна от 48 HPF рыбок данио. Шкала бар 30 мкм.
Рисунок 2. Иммунного отдельных мышечных волокон, выделенных из 48 эмбрионов после оплодотворения данио.) Мышечное волокно помечены с анти-рианодинового рецептора (RYR1), открывая полосатую картину вдоль волокна в соответствии с локализацией на триада / муфта аппарат ЕС. B) мышечное волокно помечены с анти-α -актинина, visualizin г страты (красный) вдоль мышечное волокно локализующего к саркомера и выдвигая на первый план Z полосы. В обоих изображений, ядра помечены DAPI, рассматривается как голубых овалов. Вставки показывают большее увеличение образы мышечное волокно в большом изображении. А) и б) масштабной линейки 30 мкм.
Рисунок 3. Представитель индуцированной ответ высвобождение кальция из одной изолированной данио мышечное волокно. Все панели показывают псевдоцветной данио мышечное волокно, выразив GCaMP3. Временной ход показывает увеличение GCaMP3 флуоресценции (красный цвет) в ответ на приложение 30 мМ кофеина. Запись началась до кофеина приложения (0 мс) и продолжал максимальной реакции флуоресценции (992 мс). Шкала бар 30 мкм.НК "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данио рерио являются мощным позвоночных модельной системой для изучения развития мышц и функцию в естественных условиях 25,27,28. Они также появились в качестве ценного актива для моделирования заболевания мышц человека 14,15,20,29. В то время как большие успехи были приняты для продвижения использования и применения рыбок данио для изучения функции мышц и мышечных заболеваний, существует постоянная острая необходимость в разработке инструментов, которые позволят более глубоко анализа, что комплименты генетический, морфологические, поведенческие и функциональный Преимущества данио уже предлагают 17. Поэтому мы адаптировали и разработали простой и надежный метод для характеризации данио мышечных волокон из диссоциированных целых эмбрионов.
Использование отдельных мышечных волокон является обычным делом в исследованиях с использованием мышиного модельную систему. У мышей это позволило для исследований и анализов, которые нецелесообразно или невозможно в целых животных, вклюлокализация субклеточная белок динь изучает 30 живых изображений сотовый 31 и электрофизиологические измерения 32. У рыбок данио, подобные методы диссоциации были ранее разработаны специально для определения и изучения motorneurons 33, а также Rohon-Борода сенсорных нейронов 34, и эти методы позволили подробный анализ этих нейронных подтипов.
Широкая применимость отдельных мышечных волокон, в сочетании с множеством уникальных преимуществ данио предлагает как позвоночных модели 17, это то, что побудило нас разработать методику выделения и характеризующие эмбриональных и личинок данио мышечные волокна. Мы использовали отдельные мышечные волокна в предыдущих исследованиях, чтобы определить, внутриклеточную локализацию мышечных белков 20,21, для изучения локализации chimerically выраженных трансгенов 35 и определить конкретные параметры мышечное волокно в том числе особенно размера
Грабнер и коллеги также использовали систему мышечное волокно к большому успеху 19,22,36. Они являются единственной группой, чтобы сообщить длительное культивирование изолированных волокон. Кроме того, они были в состоянии использовать волокна для измерения электрофизиологических свойств мышцы. В частности, они испытывали воздействие потери бета-субъединицы рецептора дигидропиридина на высвобождение кальция и измерили способность набора трансгенов, чтобы спасти Defeк.т.н. в этом выпуске. Эти исследования освещают некоторые из очень мощных потенциальных применений изолированных мышечных волокон.
Другая группа сообщить использование мышечное волокно преп для изучения болезни мышц является Никсон и др.., Которые используются мышечные волокна, чтобы изучить воздействие морфолиногруппой опосредованной кавеолин 3 нокдауна на развитие мышц и мышечной структуры 18. Эти авторы не только рассмотрены параметры с помощью световой микроскопии, но и изучал волокон с использованием электронной микроскопии. Их работа определяет еще одно преимущество в изолированной системе мышечное волокно: способность учиться ультраструктуры в мышечное волокно в изолированной и контролируемых условиях.
Эти исследования, наряду с нашей работы, указывают на потенциальную широкой полезности этой техники. Дополнительные приложения наверняка будут разработаны, например, измерять быстрые шипы кальция с помощью показателей, как Фура-2. Кроме того, этот препарат дает возможность наблюве электрическую активность, например, потенциалов действия через напряжения чувствительных красителей (Ди-4-ANEPPS) или прямого электрофизиологические записи. Кажется очевидным, что все современные методы, используемые на мышиных мышечных волокон должны быть применимы к данио мышечных волокон. Кроме того, способность выражать различные трансгены в развивающихся данио, а также наличие большого и растущего числа трансгенных данио, выражающей различные маркерные белки ( www.zfin.org ), добавляет дополнительный уровень сложности и применимости к Система. Мы демонстрируем этот факт с мышечных волокон культивируемых из GCaMP3 выражающей рыбок данио, где мы воспользоваться возможностью, чтобы выразить GCaMP3 в мышцах учиться индуцированный визуализации кальция в реальном времени в изолированных волокон (рис. 3).
Как и в большинстве методов, есть также некоторые четкие ограничения на изолированной системы мышечное волокно. Эти вопросы находятся в дополнение к стендуARD недостатки изучения тип клеток в пробирке, который функционирует как трехмерную синцитиев в естественных условиях и выполнять электрофизиологические эксперименты с nonphysiologic раздражители. Использование нашу методологию, один не в состоянии получить чистый препарат мышечных волокон. Это не является проблемой для иммунным окрашиванием или для электрофизиологических измерений, но это не исключает некоторые экспериментальные подходы. Например, нам еще предстоит определить подходящий методологии определения чистую популяцию мышечных волокон для транскриптомных анализа. Мы попытались FACS сортировки GFP, выражающих мышечных волокон с последующим подготовки мышечное волокно, но это не привело к чистой культуры с подходящим количеством мышечных волокон для любой РНК или анализа белка.
Еще одной проблемой является долгосрочное культивирование мышечных волокон. Мы были в состоянии держать культур примерно 24 ч и Грабнер и коллеги сообщают препарат, который был ОсакаBLE для нескольких дней экспериментов 19. Проблема, связанная с этим аспектом методики предотвращения загрязнения, как эти культуры (подобно мышиных миофибрилл Preps) часто трудно поддерживать стерильными. Большое внимание необходимо, если мы хотим попытаться длительные культуры. Мы также рекомендуем применение противомикробных препаратов, включая противогрибковые препараты.
В целом, мы демонстрируем практический метод для изоляции данио мышечных волокон, а также сообщить, каким образом выполнять флуоресцентного иммунного и визуализации в реальном времени кальция на изолированных препаратов волокна. Продолжая модификация и развитие этой техники будет предлагать постоянно расширяющийся репертуар инструментов, чтобы экспериментировать на конкретных, изолированных типов клеток у рыбок данио. По диссоциации данио эмбрионов в изолированных отдельных мышечных волокон, мы можем способствовать дальнейшему укреплению нашего понимания развития мышц, функции и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликтующие интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Даулинг (Аарон Reifler, Трент Во, Анжела Busta, и Уильям TELFER), которые способствовали развитию техники и производства рукописи. Эта работа финансировалась по Таубман института, кафедры педиатрии в Университете Мичигана, и частично из грантов от мышечной дистрофии ассоциации (JJD MDA186999) и Национальных Институтов Здоровья (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
