Summary
Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.
Abstract
O peixe-zebra tem provado ser um sistema modelo valioso para explorar a função do músculo esquelético e para o estudo de doenças musculares humanas. Apesar das muitas vantagens oferecidas por análise in vivo de músculo esquelético, no peixe-zebra, visualizando o meio complexo e finamente estruturado proteína responsável pela função muscular, particularmente, em todo o embrião, pode ser problemático. Este impedimento resulta de o pequeno tamanho do músculo esquelético do peixe-zebra (60 mM) e o tamanho ainda menor do sarcómero. Aqui nós descrevemos e demonstrar um método simples e rápido para isolar miofibras esqueléticas a partir de embriões de peixes-zebra e larvas. Nós também incluímos protocolos que ilustram as técnicas de preparação de pós úteis para analisar a estrutura e função muscular. Especificamente, detalhar a localização imunocitoquímica posterior das proteínas do músculo esquelético e da análise qualitativa da liberação de cálcio estimulada através de imagem de cálcio de células vivas. No geral, este vídeoartigo fornece um método direto e eficaz para o isolamento e caracterização de fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra, uma técnica que proporciona um canal para estudos subsequentes miríade de estrutura e função musculares.
Introduction
O músculo esquelético é um tecido altamente especializado responsável por gerar as forças necessárias para a motilidade contráteis. A contração é iniciada através de um processo conhecido como excitação-contração (CE) acoplamento que converte os sinais elétricos para liberação de cálcio dos estoques intracelulares 1,2. Liberação de cálcio intracelular ativa o sarcômero para encurtar e gerar força. Os vários componentes específicos do maquinário molecular responsável por mediar a transmissão junção neuromuscular 3, acoplamento CE 4,5 e actina e miosina contrações dependentes 6 continuam a ser objecto de investigação em curso intenso. Além disso, as proteínas que estabilizam a membrana muscular durante 7,8 contracção e que medeiam a sinalização entre a fibra muscular e da matriz extracelular 7,9 foram identificados e estudados em grande detalhe.
As mutações em vários genes importantes para a estrutura de um músculofunção nd foram identificados como causas de doenças do músculo esquelético humano ( http://www.musclegenetable.org/ ). Estas doenças, classificadas amplamente como miopatias e distrofias musculares esqueléticas com base em características clínicas e histopatológicas, estão associadas com fraqueza muscular, deficiência ao longo da vida, e 10,11 mortalidade precoce. O peixe-zebra tem provado ser um sistema excelente para modelar e estudar as doenças do músculo esquelético humanos 8,12,13. Ele tem sido empregado para validar as novas mutações genéticas 8, definir novos aspectos da doença fisiopatologia 14,15, e identificar novas abordagens terapêuticas 15,16. A potência do peixe-zebra para o estudo da doença muscular humana refere-se a um grande número de descendentes, o rápido desenvolvimento da estrutura muscular e na função, a clareza óptica do embrião do peixe-zebra, e a facilidade da manipulação genética e farmacológica da zebra desenvolvimentopeixe 17.
Nós e outros 12,18,19 recentemente desenvolvida uma técnica simples para o isolamento rápido e eficiente de miofibras do peixe-zebra desenvolvimento. Esta metodologia permitiu o exame de miofibras em maior detalhe do que pode ser fornecida por análise de embrião inteiro. A técnica tem sido explorada para a caracterização da proteína de localização subcelular 20, bem como para a identificação de características histopatológicas importantes como parte de estudos de validação em modelos de doença recentemente desenvolvidos 21. Além disso, fibras musculares isolados podem ainda ser usado para geração de imagens ao vivo e para estudos eletrofisiológicos 22, técnicas que permitam o interrogatório dos aspectos-chave da função muscular. O protocolo específico para o isolamento de células musculares, junto com dois exemplos de experiências analíticas subseqüentes, é detalhado nas partes restantes deste manuscrito.
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Protocol
1. Preparação de poli-L-lisina revestido Lamelas (Tempo: 1 hora)
Lamelas de revestimento permite a rápida colonização myofiber e aderência. Isto pode ser realizado durante o passo de dissociação do isolamento de células musculares (passo 2 abaixo).
- Cortar e colocar Parafilm na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm (qualquer marca).
- Coloque deslizamentos de vidro da tampa do microscópio (12 mm de diâmetro) em Parafilm em um 60 milímetros de cultura de tecidos prato ou colocá-los individualmente em poços individuais de placas de 24 poços.
Nota 1: Estas pequenas lamelas redondas ajudam a concentrar myofiber números e reduzir o excesso de uso de anticorpos.
Nota 2: Outras lamelas tamanho vai funcionar, no entanto, os volumes de reagentes e embriões utilizados deverão ser ajustados em conformidade.
- Pipeta de 50-200 ul de solução de poli-L-lisina (0,01%) em cada tampa de vidro numa placa de Petri.
- Permitir as lamelas de sentar-se pelo menos um hour a 37 ° C. Incubações mais longas não vai influenciar negativamente os resultados.
- Remove-poli-L-lisina solução da tampa de vidro e lavar duas vezes com um mínimo de 100 l 1x PBS.
- Permitir lamelas secar.
- Lamelas está agora pronto para miofibras.
Nota 3: A fim de garantir a esterilidade, o revestimento pode ser feito de um capô e em lamelas autoclavados.
Nota 4: Mantenha a placa de Petri de 60 mm e Parafilm na parte inferior. Esta configuração será usada durante myofiber revestimento e imunomarcação (posteriores passos).
Alternativa 1: Em vez de lamelas de revestimento imediatamente antes da utilização, um estoque lamela revestida pode ser utilizado. Um prato de 60 milímetros de Petri contendo um mínimo de 2 ml de poli-L-lisina pode ser armazenado a 4 ° C contendo numerosas lamelas. Com esta alternativa começar no passo 1.5 para processar as lamelas de miofibras.
Alternativa 2: Também lamelas de casaco em poli-L-ornitina. To é mais trabalhosa, mas é útil para a cultura de longo prazo, porque lamelas revestidas com poli-L-ornitina pode ser tratado UV. Com o tratamento UV e técnica estéril cuidado myofibers ao vivo geralmente pode ser mantidas em cultura 4-7 dias.
2. A dissociação de embriões Zebrafish e chapeamento de fibras musculares (Tempo: 1 a 3 hr)
Nota: o protocolo padrão se aplica melhor a 3 dpf (dias após a fertilização) Embriões.
- Transferência de embriões de peixes-zebra em um tubo de centrífuga de 1,5 ml padrão e remover o máximo de água de peixe possível. Tipicamente, pode ser utilizada 10-20 embriões por tubo, embora menos. Usando mais do que 20-25 embriões muitas vezes resulta numa preparação de densidade excessiva.
- Retirar córions antes da dissociação, utilizando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, a remoção do cório químico é conseguido através de um tratamento de 10-15 min com Pronase. Normalmente, a remoção prévia do córion só é necessária quando a confirmação prévia de um mutÉ necessário fenótipo formiga ou morfologia, ou quando usar estágios em que os embriões são naturalmente chocado de seu córion.
- Adicionar 900 ul de CO 2 meios independentes para o tubo contendo os embriões.
- Adicionar 100 ul de colagenase tipo II, concentração final de 3,125 mg / ml (solução de colagenase a 31,25 mg / mL diluído em PBS 1x), para começar a dissociação. Colagenase IV também pode ser utilizado para a dissociação.
- Rode embriões num agitador orbital, e tritura-se a cada 30 min em temperatura ambiente usando um P1000 Pipetman para a trituração.
Nota 2: Acompanhar atentamente dissociação embrião; sobre ou sob a dissociação (especialmente over) são as razões mais comuns para a falha de protocolo. Os tempos para a digestão irá variar dependendo da intensidade de trituração, o número de embriões por tubo, e idade dos embriões. É também muitas vezes menos (em comparação com os tipos selvagens) para embriões de mutantes do músculo esquelético.
Nota3: tempo de digestão médio por idade embrião: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 hr, 3 dpf = 2 horas e 4 dpf = 2-2,5 horas.
- Pare de digestão quando há embriões inteiros são visíveis, mas pedaços sólidos ainda são visíveis - isto é essencial para prevenir overdigestion.
- Tubos de centrífuga com embriões dissociadas em 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos para as células de pelotas.
- Remover o sobrenadante de células peletizadas e lavar 2x com CO 2 a mídia independente.
- Adicionar fresco CO 2 mídia independente para ressuspender as células. 1 ml é normalmente usado para preparações de 10-20 embriões. O volume pode ser dimensionado com base no número de embriões.
- Usando uma pipeta P1000, passar a suspensão através de um filtro de embriões de 70 mM. Isso ajuda a remover os resíduos indesejáveis do prep.
Nota 4: suspensão de embriões pode ser filtrado uma segunda vez, através de um filtro de 40 um para remover mais restos não desejados. A partir de uma dupla filtração, a recuperação é approximdiatamente 800 mL de um volume inicial de 1 ml.
- Adicionar cerca de 50-100 ul de suspensão de células musculares para cada lamela revestida com poli-L-lisina.
Nota 5: Execute o passo 2.9 em placas de Petri com Parafilm no fundo, previamente preparado. O Parafilm mantém a suspensão de células musculares de correr as lamelas revestidas. Manter placas de Petri cobertas para evitar a evaporação.
- Permitir myofibers para resolver aproximadamente 1 hora para as lamelas revestidas à temperatura ambiente.
Nota 6: fibras musculares começam a se estabelecer dentro de 5-10 min. No entanto, para uma boa pega myofiber, recomenda-se um mínimo de 1 hora (1-2 h). Permitindo myofibers que se contentar com mais tempo não irá prejudicar a preparação. Para incubações mais longos (incluindo durante a noite), os antibióticos podem ser adicionados aos meios de comunicação. Com antibióticos e técnica estéril culturas vivas geralmente pode ser mantida por 1-2 dias.
- Vivo myofibers pode ser observado neste ponto. Miofibras a partir de embriões 2 dpf e mais tarde será visto como células alongadas e estriadas (Figura 1). Neste ponto, myofibers agora está pronto para análise ao vivo ou por imunomarcação.
Nota 7: O músculo esquelético a partir de 1 dpf embriões não placa fibras como alongados e claramente estriados. Em vez disso, grandes myoballs são visíveis. Além disso, durante a fase de granulação de pós de dissociação (passo 2.6), um dpf myoballs precisam de ser centrifugada durante um mínimo de 8 minutos a 5.000 xg, para atingir um sedimento. Para a análise de embriões, nesta fase, recomenda-se usar a linha transgénica que expressa EGFP especificamente no músculo esquelético 23. Isto irá permitir a identificação de células de origem muscular versus outras fontes.
3. Fluorescência imunocoloração de dissociadas Zebrafish miofibras (Tempo: cerca de 1 dia)
3.1. Imunomarcação
- Retire uma porçãomedia de fibras musculares aderidas à lamela revestido
- Fix células usando 4% de paraformaldeído ou metanol. Para PFA, retire ½ o volume de mídia e substituir com a mesma quantidade de PFA. Correção para 10 min à temperatura ambiente, em seguida, remova volume total, substitua por 50-100 mL de PFA, e corrigi por mais 10 min. Para a fixação de álcool, metanol arrefecido em gelo ou acetona pode ser aplicado a 4 ° C durante 10 minutos ou 5 minutos, respectivamente.
- Lavar miofibras, pelo menos, 3-5x com PBS 1x ou 1x PBS mais 0,1% de Tween. O volume médio de lavagem é 50-100 mL por lamela.
- Adicionar solução para miofibras (trabalhando estoque) de bloqueio e incubar 20-60 minutos em temperatura ambiente. A solução de bloqueio irá variar dependendo dos anticorpos primários e secundários. Os dois mais comuns usadas no laboratório são: (1) PBS 1x, 2 mg / ml de BSA, 1% de soro de ovelha, 0,25% de Triton X-100 final e (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) e 5% de soro de ovelha / cabra.
- Remova a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído em qualquer bsolução ou PBS bloqueio. Incubar miofibras durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de ambos os Parafilm ou embrulhe em Saran Wrap placa de Petri contendo as lamelas carregados de fibra muscular revestidas com anticorpos. Pequenos pedaços de toalha de papel humedecido pode ser adicionado para criar uma câmara humidificada.
- Remover o anticorpo primário e lava-se a partir de lamelas lamelas de 3-5x durante 5 minutos com PBS ou solução de bloqueio.
- Adicionar anticorpo secundário na concentração adequada diluída em 1x PBS ou solução de bloqueio durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
- Remover o anticorpo secundário e lava-miofibras 3-5x em PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
3.2. Lamelas de montagem
- Aplicar 1-2 gotas de reagente antifade a uma lâmina de microscópio.
- Cuidadosamente pick-up a lamela revestido e immunolabled usando uma pinça e lugar (myofibers para baixo) a lamela sobre o reagente antifade na lâmina de microscópio.
Nota 1: Atenção para a orientação do clamela oated é crítica.
- Coloque 1-2 Kimwipes sobre uma superfície sólida duro. Inverter rapidamente o slide com as lamelas revestidas descansando sobre o reagente antifade e colocá-lo (lamela para baixo) na Kimwipes.
- Aplicar uma leve pressão para os cantos da lâmina de microscópio para remover o excesso de Antifade e formar uma vedação estanque entre a lâmina e lamela
- Permitir a Antifade restante secar durante 5-10 min à temperatura ambiente, em seguida, as fibras musculares estão prontos para a imagem (Figuras 2A e B) ou armazenar a 4 ° C.
4. Vivo celular Imagem de cálcio Usando GCaMP3
Experiências de células vivas pode ser realizada em miofibras antes da fixação (passo seguintes 2.10). O protocolo seguinte descreve a imagem ao vivo em miofibras expressando GCaMP3 24, um indicador de cálcio geneticamente codificado, expressa pelo específica zebrafish actina-α promotor músculo esquelético (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica pode ser facilmente adaptado para utilizar corantes indicadores de cálcio tais como o Fura-2.
- Injetar embriões com pSKM: GCaMP3 construir na fase 1-2 celular
- Aos 3 dpf, coletar as larvas e preparam myofibers conforme descrito nas seções 1 e 2. Permitir miofibras-se aderir durante um período mínimo de 1 hora. Para esta técnica, que se preparam lamelas em pratos de 24 poços, é necessária.
- Remova cuidadosamente qualquer excesso de mídia, e adicionar 300 ml de CO 2 mídia independente fresco à temperatura ambiente.
- Observar células sob um microscópio invertido. GCaMP3 myofibers positivos deve ser visível sob fluorescência verde.
- Configure câmera para a gravação, se desejar.
- Prepare uma solução de cafeína 30 mM em CO 2 mídia independente. Para estimular as células, Pipeta suavemente 300 ml de solução de cafeína para o bem sob ampliação. Dentro 5-10 seg, GCaMP miofibras positivas deve responder a cafeína com um aumento rápido na fluorescência (Figura 3). Myofibers também podem contrair. De nota, a cafeína induz a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático das lojas 25. Outros agentes, tais como KCl 26 e ryanodine 4, pode ser usado para estudar liberação induzida de cálcio.
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Representative Results
Imunomarcação fluorescente de miofibras (Figura 2)
As imagens mostram o esperado padrão de marcação fluorescente de miofibras imunocoradas após o isolamento bem sucedido e revestimento. As fibras têm sido marcada ou com anti-receptor de rianodina (1:100) (figura 2A) ou anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B), anticorpos, e revelam imunocoloração da tríade e a banda Z respectivamente. Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluor 555 (1:500). Imagens capturadas usando microscopia confocal.
Libertação de cálcio induzida a partir de uma fibra muscular (Figura 3)
Painel série mostrando a liberação de cálcio a partir de um representante myofiber isolado tratado com cafeína. Em resumo, os embriões de peixe-zebra foram injectados no estádio de uma célula com o pSKM: GCaMP3 construto. Às 3 dpf, os embriões foram dissociadas e plaqueadas como descrito na protocol. Para a análise, GCaMP3 miofibras expressando foram seleccionados, como indicado pela presença de fluorescência verde na linha de base. Usando uma micropipeta para a administração da droga, a fibra seleccionada foi banhado numa solução de cafeína 30 mM para induzir libertação de cálcio. A gravação de vídeo foi iniciado antes da aplicação de cafeína e continuou até o pico de fluorescência foi alcançado. Esta figura demonstra a libertação de cálcio normal cafeína induzida, e a técnica pode ser utilizado para interrogar o dispositivo de acoplamento de excitação-contracção por meio de imagens em tempo real.
Figura 1. Timeline esquemática do Embrião dissociação. Painéis sucessivas (de cima para baixo) ilustram etapas individuais, tempo e equipamento necessário para a dissociação de embriões. A) A seleção de embriões para a dissociação. Barra de escala 500 mm. B) Imago de configuração dissociação. Os embriões são em meios de colagenase e enquanto está a ser rodado até que suficientemente dissociadas (Protocolo passo 2) C) de imagens de ambas as técnicas de plaqueamento de células musculares;. Lamelas redondas ou placas de 24 poços (Protocolo passos 1 e 4, respectivamente) D) Um campo luminoso. imagem de viver dissociado myofibers zebrafish semeadas em poli-L-lisina lamínulas revestidas. Setas denotam myofibers alongados de 48 hpf peixe-zebra. Barra de escala 30 mm.
Figura 2. Imunomarcação de fibras musculares individuais isoladas de 48 embriões de peixe-zebra hpf. A) miofibras marcado com anti-receptor de rianodina (RyR1), revelando um padrão de faixas ao longo da fibra de acordo com a localização à tríade / aparelho de acoplamento CE. B) miofibras marcado com anti-α -actinina, visualizin estrias g (vermelho) ao longo da fibra muscular para localizar o sarcômero e destacando as bandas Z. Em ambas as imagens, os núcleos são rotulados com DAPI, visto como ovais azuis. Inserções mostrar imagens de ampliação superiores da fibra muscular na grande imagem. A) e B) barra de escala 30 mm.
Figura 3. Representante induzida resposta liberação de cálcio a partir de uma única fibra muscular zebrafish isolado. Todos os painéis mostram um myofiber zebrafish pseudocolored expressar GCaMP3. O curso do tempo mostra o aumento de fluorescência GCaMP3 (cor vermelha) em resposta à aplicação de 30 mM de cafeína. A gravação começou antes da aplicação da cafeína (0 ms) e continuou a resposta de fluorescência máxima (992 ms). Barra de escala 30 mm.nk "> Clique aqui para ver maior figura.
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Discussion
Zebrafish são um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento muscular e função in vivo 25,27,28. Eles também têm emergido como um recurso valioso para a modelagem de doenças musculares humanos 14,15,20,29. Enquanto grandes avanços têm sido tomadas para promover o uso e aplicação de peixe-zebra para o estudo da função muscular e doença muscular, há uma necessidade crítica constante para desenvolver ferramentas que permitem análise mais aprofundada que complementa a genética, morfológica, comportamental e funcional vantagens zebrafish já oferecem 17. Temos, portanto, adaptada e desenvolvida uma técnica simples e robusto para a caracterização de fibras musculares a partir de embriões de peixes-zebra inteiras dissociados.
O uso de fibras musculares individuais é comum em estudos que utilizam o sistema de modelo murino. Em camundongos isso permitiu para investigações e análises que são impraticáveis ou impossíveis em animais inteiros, including localização subcelular de proteínas estuda 30, imagens de células vivas 31, e medições eletrofisiológicas 32. No peixe-zebra, técnicas de dissociação semelhantes foram previamente desenvolvido especificamente para identificar e examinar neurónios motores 33, bem como Rohon-Barba neurônios sensoriais 34, e essas técnicas permitiram uma análise detalhada destes subtipos de neurônios.
A ampla aplicabilidade de fibras musculares isoladas, combinado com as muitas vantagens únicas do peixe-zebra oferece como um modelo de vertebrados 17, são o que nos motivou a desenvolver uma técnica para isolar e caracterizar myofibers zebrafish embrionárias e larvais. Utilizamos myofibers isolados em estudos anteriores para determinar a localização subcelular de proteínas musculares 20,21, para estudar a localização de transgenes chimerically expressas 35 e definir parâmetros de células musculares específicos, incluindo especialmente tamanho
Grabner e colegas também usaram o sistema de células musculares de grande sucesso 19,22,36. Eles são o único grupo a relatar cultura prolongada de fibras isoladas. Além disso, eles foram capazes de utilizar as fibras para medir as propriedades electrofisiológicas do músculo. Especificamente, eles foram testados ao impacto da perda da subunidade beta do receptor de di-hidropiridina na libertação de cálcio e medido a capacidade de um conjunto de transgenes para resgatar defects nesta versão. Estes estudos iluminar alguns dos muito poderosas aplicações potenciais de fibras musculares isoladas.
Outro grupo de relatar o uso da preparação myofiber para estudar doença do músculo é Nixon et al. Que usaram fibras musculares para estudar o impacto da morfolino mediada caveolina 3 knockdown no desenvolvimento muscular e estrutura muscular 18. Estes autores não só analisou os parâmetros por microscopia de luz, mas também estudou as fibras usando microscopia eletrônica. O trabalho identifica ainda outra vantagem do sistema de células musculares isolado: a capacidade para estudar a ultraestrutura da fibra muscular em um ambiente isolado e controlado.
Estes estudos, juntamente com o nosso trabalho, aponte para o amplo potencial utilidade desta técnica. Outras aplicações estão determinados a serem desenvolvidas, tais como medição de picos rápidos de cálcio usando indicadores como Fura-2. Além disso, esta preparação oferece a oportunidade de observe atividade elétrica, como potenciais de ação através de corantes de tensão sensíveis (Di-4-ANEPPS) ou gravação eletrofisiológico direta. Parece claro que todas as técnicas atuais utilizadas em miofibras murino deve ser aplicável a myofibers peixe-zebra. Além disso, a capacidade de expressar os transgenes diferentes no desenvolvimento do peixe-zebra, bem como a disponibilidade de um grande e crescente número de peixes-zebra transgénicos que expressam várias proteínas marcadoras ( www.zfin.org ), adiciona uma camada adicional de complexidade e aplicabilidade para o sistema. Demonstramos esse fato com as fibras musculares em cultura de GCaMP3 zebrafish expressando, onde aproveitamos a capacidade de expressar GCaMP3 no músculo para estudo de imagem de cálcio induzida em tempo real em fibras isoladas (Figura 3).
Tal como acontece com a maioria das técnicas, há também algumas limitações claras para o sistema de células musculares isoladas. Estes problemas são, em adição ao suportedeficiências ard de estudar um tipo de célula in vitro, que funciona como um sincícios tridimensional in vivo e de realização de experimentos eletrofisiológicos com estímulos não fisiológicos. Usando a metodologia, não é capaz de obter uma preparação pura de miofibras. Este não é um problema para a imunocoloração ou por medidas eletrofisiológicas, mas isso não impede que certas abordagens experimentais. Por exemplo, ainda temos que determinar uma metodologia adequada para a identificação de uma população pura de miofibras para análise transcriptomic. Tentámos separação FACS de miofibras expressando GFP seguido de preparação de células musculares, mas este não resultou em uma cultura pura, com um número apropriado de miofibras de ARN ou análise de proteínas.
Outro desafio é a cultura de longo prazo de fibras musculares. Temos sido capazes de manter culturas por cerca de 24 horas, e Grabner e colegas relatam uma preparação que tem sido Suitasável por vários dias de experimentação 19. O desafio relacionado com este aspecto da técnica é evitar a contaminação, como estas culturas (tanto como preparações de células musculares de murino) são muitas vezes difíceis de manter estéril. Muito cuidado é necessário se é para tentar culturas prolongados. Também recomendamos o uso de antimicrobianos, incluindo antifúngicos.
Em todos os, que demonstram um método prático para o isolamento de miofibras de peixe-zebra, bem como esboço como realizar imunomarcação fluorescente e imagiologia em tempo real de cálcio sobre as preparações de fibras isoladas. Modificação contínua e desenvolvimento desta técnica vai oferecer um repertório cada vez maior de ferramentas para experimentar em tipos de células isoladas, específicas em peixes-zebra. Ao dissociar embriões de peixe-zebra em isolados myofibers individuais, podemos melhorar ainda mais a nossa compreensão do desenvolvimento muscular, função e doenças.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer) que contribuíram para o desenvolvimento da técnica e da produção do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Taubman, do Departamento de Pediatria da Universidade de Michigan, e em parte, de doações da Associação de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) e os Institutos Nacionais de Saúde (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
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