Summary
Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.
Abstract
De zebravis heeft zich bewezen als een waardevol model systeem voor het verkennen van de skeletspier functie en voor het bestuderen van menselijke spierziekten. Ondanks de vele voordelen van in vivo analyse van de skeletspier bij de zebravis, visualiseren het complex en fijn gestructureerde eiwitten milieu belast spierfunctie, vooral gehele embryo, kan problematisch zijn. Deze belemmering vloeit voort uit de geringe omvang van de zebravis skeletspieren (60 micrometer) en de nog kleinere omvang van de sarcomeer. Hier beschrijven we en demonstreren van een eenvoudige en snelle methode voor het isoleren van het skelet myovezels van zebravis embryo's en larven. We hebben ook protocollen die post voorbereiding technieken bruikbaar voor het analyseren van de spier structuur en functie te illustreren. Concreet, we detail de daaropvolgende immunocytochemische lokalisatie van de skeletspieren eiwitten en de kwalitatieve analyse van de gestimuleerde calcium vrijstelling via live cell imaging calcium. Over het algemeen, deze videoartikel geeft een ongecompliceerde en efficiënte methode voor het isoleren en karakteriseren van zebravis skelet myofibers, een techniek die een groot kanaal voor verdere studies spier structuur en functie verschaft.
Introduction
Skeletspier is een zeer gespecialiseerde weefsel verantwoordelijk zijn voor het genereren van de contractiele krachten die nodig zijn voor de beweeglijkheid. Contractie wordt geïnitieerd via een proces dat bekend staat als excitatie-contractie (EC) koppeling die elektrische signalen omzet naar calcium vrijlating uit intracellulaire opslagplaatsen 1,2. Intracellulair calcium vrijlating activeert de sarcomeer in te korten en het genereren van kracht. De vele specifieke onderdelen van de moleculaire machines die verantwoordelijk is voor het bemiddelen neuromusculaire verbinding transmissie 3, EG-koppeling 4,5, en actine-myosine afhankelijke contracties 6 blijven de lopende onderwerp van intensief onderzoek. Bovendien zijn eiwitten die de spier membraan stabiliseren tijdens contractie 7,8 en bemiddelde signalering tussen de myofiber en de extracellulaire matrix 7,9 geïdentificeerd en onderzocht in detail.
Mutaties in verschillende genen betrokken spierstructuur eennd functie zijn geïdentificeerd als oorzaken van menselijke skeletspier ziekten ( http://www.musclegenetable.org/ ). Deze ziekten, in grote lijnen ingedeeld als skelet myopathieën en spierdystrofieën gebaseerd op klinische en histopathologische kenmerken, worden geassocieerd met spierzwakte, levenslange handicap, en vroege sterfte 10,11. De zebravis heeft zich bewezen als een uitstekend systeem voor het modelleren en de studie van de menselijke skeletspier ziekten 8,12,13 zijn. Het is aangewend om nieuwe genmutaties 8 valideren, definiëren van nieuwe aspecten van de ziekte pathofysiologie 14,15, en nieuwe therapeutische benaderingen 15,16. De kracht van de zebravis voor het bestuderen van humane spierziekte betreft het groot aantal nakomelingen, de snelle ontwikkeling van spieren structuur en functie, de optische helderheid van het zebravis embryo, en het gemak van genetische en farmacologische manipulatie van de ontwikkeling zebravis 17.
Wij en anderen 12,18,19 hebben onlangs een eenvoudige techniek voor snelle en efficiënte isolatie van spiervezels van de zebravisembryo. Deze methode heeft het onderzoek van spiervezels mogelijk gedetailleerder dan kan worden verschaft door gehele embryo analyse. De techniek is benut voor het karakteriseren van eiwitten subcellulaire lokalisatie 20 en voor de belangrijke histopathologische kenmerken kader van valideringsonderzoeken nieuw ontwikkelde ziektemodellen 21. Bovendien kan geïsoleerde myovezels bovendien worden gebruikt voor live beeldvorming en voor elektrofysiologische studies 22, technieken die het mogelijk maken voor de ondervraging van de belangrijkste aspecten van de spierfunctie. De specifieke protocol voor myofiber isolatie, samen met twee voorbeelden van latere analytische experimenten, wordt gedetailleerd beschreven in de overige delen van dit manuscript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van poly-L-lysine gecoate dekglaasjes (: 1 uur)
Coating coverslips zorgt voor een snelle myofiber bezinking en adhesie. Dit kan worden uitgevoerd tijdens de dissociatie stap van de myofiber isolatie (stap 2).
- Knip en plaats Parafilm op de bodem van een 60 mm petrischaal (elk merk).
- Plaats microscoop afdekglas slips (12 mm diameter) op Parafilm in een 60 mm weefselkweek schotel en leg ze niet afzonderlijk in enkele putjes van 24-well platen.
Opmerking 1: Deze kleine ronde dekglaasjes helpen om myofiber nummers concentreren en overmatige gebruik antilichaam verminderen.
Noot 2: Andere grootte coverslips zal werken, maar zullen de volumes van reagentia en embryo's gebruikt moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
- Pipetteer 50-200 pl poly-L-lysine-oplossing (0,01%) op elke dekglas in de petrischaal.
- Laat de dekglaasjes te zitten ten minste een hour bij 37 ° C. Langere incubaties geen negatieve resultaten beïnvloeden.
- Verwijder poly-L-lysine oplossing uit de afdekglas en tweemaal wassen met een minimum van 100 pl 1x PBS.
- Laat dekglaasjes drogen.
- Dekglaasjes zijn nu klaar voor myovezels.
Noot 3: Om de steriliteit te waarborgen, kan coating worden gedaan in een kap en op geautoclaveerd dekglaasjes.
Noot 4: Houd de 60 mm petrischaal met Parafilm op de bodem. Deze opstelling wordt gebruikt tijdens myofiber plating en immunolabeling (latere stappen).
Alternatief 1: plaats bekleding dekglaasjes onmiddellijk voor gebruik, een gecoate dekglaasje beelden worden gebruikt. Een 60 mm petrischaal met ten minste 2 ml poly-L-lysine kan worden opgeslagen bij 4 ° C met tientallen dekglaasjes. Met deze alternatieve beginnen bij stap 1.5 tot de dekglaasjes myovezels verwerken.
Alternatief 2: We hebben ook jas dekglaasjes in poly-L-ornithine. Tzijn arbeidsintensiever, maar is nuttig voor langere tijd gekweekt omdat poly-L-ornithine beklede dekglaasjes UV behandeld kunnen worden. Met UV-behandeling en zorgvuldige steriele techniek levend myovezels typisch kan worden gehandhaafd in cultuur 4-7 dagen.
2. Dissociatie van zebravis embryo's en Plating van myofibers (Tijd: 1-3 uur)
Opmerking: het standaard protocol van toepassing is het beste om 3 dpf (dagen na de bevruchting) embryo's.
- Transfer zebravis embryo's in een standaard 1,5 ml centrifugebuis en verwijder zoveel overtollige vis water mogelijk. Meestal kan 10-20 embryo per buis, hoewel minder worden. Met meer dan 20-25 embryo vaak resulteert in een preparaat van overmatige dichtheid.
- Verwijder chorions voorafgaand aan dissociatie, handmatig met behulp van # 5 tang. Als alternatief wordt de chemische chorion verwijderen bereikt met een 10-15 min. behandeling Pronase. Typisch wordt de eerdere verwijdering van de chorion enkel nodig voor bevestiging van een mutmier fenotype of morfologie nodig is, of wanneer het gebruik van podia waar de embryo's zijn natuurlijk uitgebroed uit hun chorion.
- Voeg 900 ul van CO 2 onafhankelijke media om de buis met het embryo.
- Voeg 100 ul van collagenase type II, eindconcentratie 3,125 mg / ml (De collagenase oplossing 31.25 mg / ml verdund in 1 x PBS) dissociatie beginnen. Collagenase IV kan ook worden gebruikt voor de dissociatie.
- Draai embryo op een rondschudapparaat, en vermaal elke 30 minuten bij kamertemperatuur met een P1000 Pipetman voor trituratie.
Opmerking 2: monitor voorzichtig embryo dissociatie, over of onder dissociatie (vooral boven) zijn de meest voorkomende redenen voor het protocol mislukking. Tijden voor digestie is afhankelijk van de intensiteit van trituratie, aantal embryo's per buis en leeftijd embryo. Het is ook vaak minder (in vergelijking met het wild type) voor embryo's uit skeletspieren mutanten.
Noot3: Gemiddeld spijsvertering tijd per embryo leeftijd: 1 DPF = 1 uur, 2 DPF = 1,5 uur, 3 DPF = 2 uur en 4 DPF = 2-2,5 uur.
- Stop met de spijsvertering als er geen hele embryo's zichtbaar zijn, maar stevige stukken zijn nog zichtbaar - dit is essentieel om overdigestion voorkomen.
- Centrifugebuizen met gedissocieerde embryo op 0,8-2,3 xg gedurende 3-5 minuten tot pellet cellen.
- Verwijder supernatant uit afgedraaid cellen en was 2x met de CO 2-onafhankelijke media.
- Voeg verse CO 2 onafhankelijke media om cellen opnieuw in suspensie. 1 ml wordt meestal gebruikt voor preps van 10-20 embryo. Het volume kan worden geschaald op basis van embryo nummer.
- Met behulp van een P1000 pipet, passeren embryo suspensie door een 70 um filter. Dit helpt bij het verwijderen van ongewenste puin van de prep.
Noot 4: Embryo schorsing kan een tweede keer worden gefilterd door een 40 um filter om verder te verwijderen van ongewenste rommel. Van een dubbele filtratie, herstel is approximdellijk 800 ul van een beginvolume van 1 ml.
- Voeg ongeveer 50-100 pl myofiber suspensie elke poly-L-lysine gecoate dekglaasje.
Opmerking 5: Voer stap 2.9 in petrischalen met Parafilm onderaan, eerder bereide. De Parafilm houdt de myofiber schorsing van het lopen van de gecoate dekglaasjes. Houd petrischalen afgedekt om verdamping te voorkomen.
- Laat myovezels ongeveer 1 uur verzekerd dankzij de beklede dekglaasjes bij kamertemperatuur.
Noot 6: myovezels zal beginnen te regelen binnen 5-10 minuten. Voor goede hechting myofiber, minimaal 1 uur (1-2 uur) aanbevolen. Het toestaan myovezels te regelen voor langer is niet schadelijk voor de prep. Voor langere incubaties (inclusief nachts) kunnen antibiotica worden toegevoegd aan de media. Met antibiotica en steriele techniek levende culturen gewoonlijk kan worden gehandhaafd voor 1-2 dagen.
- Levende myofibers kan worden waargenomen op dit punt. Myovezels van embryo 2 dpf en later zal worden gezien als dwarsgestreepte en langwerpige cellen (Figuur 1). Op dit punt, myovezels zijn nu klaar voor live-analyse of immunokleuring.
Noot 7: Skeletal muscle vanaf 1 DPF embryo niet plaat als langgerekte en duidelijk gegroefde vezels. In plaats daarvan, grote myoballs zichtbaar. Bovendien, tijdens het pelleteren fase na dissociatie (stap 2.6), 1 dpf myoballs moeten bij 5000 xg gedurende ten minste 8 minuten worden gecentrifugeerd om een pellet te bereiken. Voor de analyse van de embryo in dit stadium, is het raadzaam om de transgene lijn EGFP specifiek in de skeletspier 23 te gebruiken. Dit zal identificatie van cellen van de spier oorsprong ten opzichte van andere bronnen mogelijk te maken.
3. Fluorescentie Immunokleuring van Dissociated zebravis myofibers (Tijd: ongeveer 1 dag)
3.1. Immunokleuring
- Verwijderen van een deel vanmedia uit myovezels gehandeld op de gecoate dekglaasje
- Fix cellen met 4% paraformaldehyd of methanol. Voor PFA, verwijder ½ het volume van de media en te vervangen door dezelfde hoeveelheid PFA. Oplossing voor 10 min bij RT, verwijder vervolgens het totale volume, te vervangen door 50-100 ul van PFA, en vast te stellen voor een extra 10 minuten. Voor alcohol fixatie ijskoude methanol of aceton kan worden toegepast bij 4 ° C gedurende 10 min of 5 min, respectievelijk.
- Was myovezels minstens 3-5x met 1x PBS of 1x PBS plus 0,1% Tween. Gemiddelde wasbeurt volume 50-100 ul per dekglaasje.
- Voeg het blokkeren oplossing voor myovezels (werkvoorraad) en incubeer 20-60 minuten bij kamertemperatuur. Blokkerende oplossing is afhankelijk van de primaire en secundaire antilichamen. De twee meest voorkomende in het lab (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, 1% schapen serum, 0,25% Triton X-100 final en (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) en 5% schapen / geiten serum.
- Verwijder het blokkeren oplossing en voeg primair antilichaam verdund in een van beide bvergrendeling oplossing of PBS. Incubeer myovezels overnacht bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u ofwel Parafilm of wikkel in plasticfolie de petrischaal met de-myofiber geladen coverslips gecoat met antilichamen. Kleine stukjes bevochtigde papieren handdoek kan worden toegevoegd aan een vochtige kamer creëren.
- Verwijder primair antilichaam uit dekglaasjes en was coverslips 3-5x 5 min. met PBS of blokkerende oplossing.
- Voeg secundair antilichaam op geschikte concentratie verdund in 1x PBS of blokkering oplossing voor 1-2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder secundair antilichaam en was myovezels 3-5x in PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
3.2. Montage coverslips
- Breng 1-2 druppels antifade reagens op een objectglaasje.
- Pick-up zorgvuldig de gecoate en immunolabled dekglaasje behulp van een tang en plaats (myovezels beneden) het dekglaasje op de antifade reagens op het objectglaasje.
Opmerking 1: Aandacht voor de oriëntatie van de coated dekglaasje is van cruciaal belang.
- Leg 1-2 Kimwipes op een harde stevige ondergrond. Snel keren de dia met de gecoate dekglaasjes rusten op de antifade reagens en plaats het (dekglaasje beneden) op de Kimwipes.
- Druk zachtjes op de hoeken van de microscoop dia om overtollig antifade te verwijderen en een goede afdichting tussen de glijbaan en dekglaasje
- Laat het antifade resterende drogen gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens de spiervezels zijn klaar te (fig. 2A en B) en bewaar bij 4 ° C.
4. Live-Cell Calcium Imaging Met behulp GCaMP3
Levende cellen experimenten kunnen worden uitgevoerd op myovezels voorafgaand aan fixatie (volgende stap 2.10). Het volgende protocol beschrijft live-imaging in myovezels uiten GCaMP3 24, een genetisch gecodeerd calcium indicator, door de skeletspier specifieke zebravis α-actine promoter (pSKM) 23 uitgedrukt. Als alternatief,deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast om calcium indicator kleurstoffen zoals Fura-2 gebruikt.
- Injecteren embryo's met pSKM: GCaMP3 bouwen in de 1-2 cel stadium
- Op 3 dpf, verzamel larven en myovezels bereiden zoals beschreven in de punten 1 en 2. Laat myovezels te houden gedurende ten minste 1 uur. Voor deze techniek bereidt dekglaasjes in 24-putjes vereist.
- Verwijder voorzichtig het overtollige media, en voeg 300 ul van verse CO 2 onafhankelijke media bij RT.
- Observeren cellen onder een omgekeerde microscoop. GCaMP3 positieve myovezels moet zichtbaar onder groene fluorescentie zijn.
- Stel camera voor het opnemen, indien gewenst.
- Bereid een 30 mM cafeïne-oplossing in de CO 2-onafhankelijke media. Om cellen te stimuleren, voorzichtig pipet 300 ul van cafeïne-oplossing in de put onder een vergrootglas. Binnen 5-10 sec, dient GCaMP positieve myovezels reageren cafeïne met een snelle toename in fluorescentie (figuur 3). Myofibers kunnen ook samentrekken. Van de nota, cafeïne induceert calcium vrijstelling uit het sarcoplasmatisch reticulum winkels 25. Andere middelen, zoals KCl 26 en ryanodine 4, kan worden gebruikt om induceerbare calciumafgifte bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescerende immunolabeling van myofibers (figuur 2)
Beelden die verwacht fluorescentielabelling patroon van myovezels immunostained na succesvolle isolatie en beplating. De spiervezels zijn gemerkt met ofwel anti-ryanodine receptor (1:100) (Figuur 2A) of anti-α-actinine (1:100) (Figuur 2B) antilichamen, respectievelijk onthullen immunokleuring van de triade en de Z-band. Secundaire antilichamen gebruikt waren Alexa Fluor 555 (1:500). Beelden die zijn vastgelegd met behulp van confocale microscopie.
Geïnduceerde calcium vrijlating uit een myofiber (figuur 3)
Serie paneel dat de vertegenwoordiger calcium vrijlating uit een geïsoleerde myofiber behandeld met cafeïne. In het kort werden zebravis embryo geïnjecteerd in de fase van een cel met de pSKM: GCaMP3 construct. Op 3 dpf, werden embryo gedissocieerd en uitgeplaat zoals beschreven in de protocol. Voor analyse werden GCaMP3 expressie myovezels geselecteerd, zoals blijkt uit de aanwezigheid van groene fluorescentie bij aanvang. Met behulp van een micropipet voor het toedienen van medicijnen, werd de gekozen vezel badend in een 30 mM cafeïne oplossing voor calciumafgifte induceren. Video-opname werd gestart voorafgaand aan cafeïne toepassing en voortgezet tot piek fluorescentie werd bereikt. Dit cijfer toont aan normale cafeïne geïnduceerde calcium release, en de techniek kan worden gebruikt om de excitatie-contractie koppeling apparaat via live imaging ondervragen.
Figuur 1. Schematische Tijdlijn van Embryo dissociatie. Opeenvolgende panelen (boven naar beneden) illustreren afzonderlijke stappen, timing, en apparatuur die nodig is voor het embryo dissociatie. A) Selectie van embryo's voor dissociatie. Schaalbalk 500 pm B.) Image van dissociatie setup. Embryo's zijn in de media en collagenase terwijl wordt gedraaid totdat voldoende los (Protocol stap 2) C) Afbeelding van beide myofiber plating technieken;. Ronde dekglaasjes of 24-well platen (Protocol stappen 1 en 4, respectievelijk) D) Een helder-veld. afbeelding van levende los zebravis myovezels uitgeplaat op poly-L lysine gecoate dekglaasjes. Pijlen duiden langwerpige myovezels vanaf 48 HPF zebravis. Schaalbalk 30 micrometer.
Figuur 2. Immunolabeling van individuele myofibers geïsoleerd van 48 HPF zebravis embryo's. A) myofiber gelabeld met anti-ryanodinereceptor (RYR1), het onthullen van een gestreept patroon langs de vezel in overeenstemming met de lokalisatie van de triade / EG koppeling apparaat. B) myofiber gelabeld met anti-α -actinine, visualizin g strepen (rood) langs de myofiber lokaliseren van de sarcomeer en het benadrukken van de Z-bands. In beide beelden, zijn kernen gelabeld met DAPI, gezien als blauwe ovalen. Inserts tonen hogere vergroting beelden van de myofiber in de grote afbeelding. A) en B) schaal bar 30 micrometer.
Figuur 3. Vertegenwoordiger geïnduceerde calciumafgifte reactie van een enkele geïsoleerde zebravis myofiber. Alle panelen tonen een pseudocolored zebravis myofiber uiten GCaMP3. Het tijdsverloop toont de toename van GCaMP3 fluorescentie (rode kleur) in reactie op toepassing van 30 mM cafeïne. Opname gestart voorafgaand aan cafeïne applicatie (0 msec) en bleef maximale fluorescentie respons (992 msec). Schaalbalk 30 micrometer.nk "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis zijn een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen spierontwikkeling en functie in vivo 25,27,28. Ze hebben ook naar voren gekomen als een waardevolle aanwinst voor het modelleren van de menselijke spierziekten 14,15,20,29. Terwijl grote stappen zijn genomen om het gebruik en de toepassing van de zebravis voor de studie van de spierfunctie en spierziekte te bevorderen, is er een constante kritieke behoefte aan tools die meer diepgaande analyse die de genetische, morfologische, gedragsmatige en functionele complimenten zal ontwikkelen voordelen zebravis bieden nu al 17. We hebben daarom aangepast en ontwikkelde een eenvoudige en robuuste techniek voor de karakterisering van zebravis myofibers van gedissocieerde hele embryo.
Het gebruik van individuele spiervezels is gemeengoed in studies met het muizen modelsysteem. Bij muizen is dit toegestaan voor onderzoeken en analyses die onpraktisch of onmogelijk in gehele dieren zijn, including subcellulaire eiwit lokalisatie studies 30, live cell imaging 31, en elektrofysiologische metingen 32. In de zebravis, zijn soortgelijke dissociatie technieken zijn eerder ontwikkeld om specifiek te identificeren en te onderzoeken neuronen 33 evenals Rohon-Beard sensorische neuronen 34, en deze technieken zijn gedetailleerde analyse van deze neuron subtypes ingeschakeld.
De brede toepasbaarheid van geïsoleerde myofibers, en zijn talrijke unieke voordelen de zebravis biedt als vertebrate modellen 17, zijn wat ons gemotiveerd om een techniek voor het isoleren en karakteriseren van embryonale en larvale zebravis myovezels ontwikkelen. We hebben geïsoleerde myovezels gebruikt in eerdere studies naar subcellulaire lokalisatie van spiereiwitten 20,21, naar lokalisatie van chimerically uitgedrukt transgenen 35 te bestuderen en specifieke myofiber parameters, waaronder vooral definiëren bepalen
Grabner en collega's hebben ook de myofiber systeem een groot succes 19,22,36. Zij zijn de enige groep om langdurig kweken van geïsoleerde vezels melden. Bovendien zijn ze in staat om de vezels te gebruiken om de elektrofysiologische eigenschappen van de spier meten. Specifiek, hebben zij het effect van het verlies van de beta-subeenheid van de receptor op dihydropyridine calcium afgifte getest en meten het vermogen van een reeks transgenen tot defe reddencts in deze versie. Deze studies verlichten enkele van de zeer krachtige mogelijke toepassingen van geïsoleerde myovezels.
Een andere groep gebruik te maken van de myofiber prep voor het bestuderen van spierziekte te melden is Nixon et al.. Die myovezels gebruikt om de impact van morfolino gemedieerde caveoline 3 vechtpartij op spierontwikkeling en bespiering 18 bestuderen. Deze auteurs niet alleen parameters onderzocht door lichtmicroscopie, maar studeerde ook de vezels met behulp van elektronenmicroscopie. Hun werk geeft nog een ander voordeel van het geïsoleerde myofiber systeem: het vermogen om de ultrastructuur van de myofiber bestuderen in een geïsoleerde en gecontroleerde omstandigheden.
Deze studies, samen met ons werk, zoeken naar mogelijke brede nut van deze techniek. Extra toepassingen zeker zullen worden ontwikkeld, zoals het meten van snelle calcium spikes de hand van indicatoren zoals Fura-2. Bovendien, deze voorbereiding biedt de mogelijkheid om Observe elektrische activiteit, zoals actiepotentialen via voltage gevoelige kleurstoffen (Di-4-ANEPPS) of directe elektrofysiologische opname. Het lijkt duidelijk dat alle huidige technieken die worden gebruikt op muizen myovezels toepassing op zebravis myofibers moeten zijn. Daarnaast is de mogelijkheid om verschillende transgenen tot expressie in de zebravisembryo, alsmede de beschikbaarheid van een grote en groeiende aantal transgene zebravis expressie verschillende markereiwitten ( www.zfin.org ), voegt een extra complexiteit en toepasbaarheid voor de systeem. We tonen dit feit met de myovezels gekweekt uit GCaMP3 uiten zebravis, waar we gebruik maken van de mogelijkheid om GCaMP3 uitdrukken in spier om geïnduceerde calcium beeldvorming studeren in real time in geïsoleerde vezels (Figuur 3).
Zoals met de meeste technieken, zijn er ook duidelijke beperkingen aan het geïsoleerde myofiber systeem. Deze kwesties zijn naast de standard tekortkomingen van het bestuderen van een celtype in vitro die als een driedimensionale syncytia in vivo en uitvoeren van elektrofysiologische experimenten met niet-fysiologische stimuli. Met onze methodiek, men niet in staat om een zuivere bereiding van myovezels vinden. Dit is geen probleem voor immunostaining of voor elektrofysiologische metingen, maar het doet uitsluit dat bepaalde experimentele benaderingen. Bijvoorbeeld, we moeten nog een geschikte methode bepalen voor het identificeren van een zuivere populatie van myofibers voor transcriptomic analyse. We hebben FACS sortering van GFP expressie myofibers gevolgd door myofiber bereiding geprobeerd, maar dit heeft niet geleid tot een reincultuur met een geschikt aantal spiervezels voor zowel RNA en eiwitanalyse.
Een andere uitdaging is de lange termijn kweken van myovezels. We zijn in staat om culturen te houden voor ongeveer 24 uur geweest, en Grabner en collega's melden een voorbereiding die suita is geweestBLE voor meerdere dagen van experimenten 19. De uitdaging met betrekking tot dit aspect van de techniek verhindert verontreiniging, aangezien deze kweken (net als muizen myofiber preps) vaak moeilijk steriel te houden. Grote zorg is nodig als men is om langdurige culturen proberen. Wij bevelen ook het gebruik van antimicrobiële stoffen, waaronder antischimmelmiddelen.
In totaal tonen we een praktische methode voor het isoleren van zebravis myofibers en samenvatten hoe fluorescerende immunokleuring en real-time imaging calcium voeren op de geïsoleerde vezelpreparaten. Voortdurende aanpassing en de ontwikkeling van deze techniek biedt een steeds groeiende repertoire van instrumenten om te experimenteren op specifieke, geïsoleerde celtypen in de zebravis. Door dissociëren zebravis embryo's in geïsoleerde individu myovezels, kunnen we verder te verbeteren ons begrip van spierontwikkeling, functie en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen de leden van de Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, en William Telfer) die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van de techniek en de productie van het manuscript bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Taubman Instituut, de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Michigan, en voor een deel uit subsidies van de Vereniging van de Spierdystrofie (JJD MDA186999) en de National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
