Summary
斑马鱼是用于模拟骨骼肌的人类疾病的一个新兴的系统。我们描述了一个快速，高效的方法从胚胎和幼虫的斑马鱼隔离骨骼肌肌纤维。这种方法产生了高密度的肌纤维制备适合的单骨骼肌纤维形态的研究中，蛋白质的亚细胞定位，以及肌肉生理学。
Abstract
斑马鱼已被证明是一个有价值的模型系统研究骨骼肌功能和研究人类肌肉疾病。尽管通过体内分析骨骼肌在斑马鱼提供的，可视化的复杂和精细结构的蛋白质环境负责的肌肉功能，尤其是在整个胚胎中的诸多优点，可能会产生问题。这个障碍源于斑马鱼的骨骼肌（60微米）和肌节的甚至更小尺寸的小尺寸。在这里，我们描述和演示从斑马鱼胚胎和幼虫分离骨骼肌纤维的简单和快速的方法。我们还包括了协议，说明后期制备技术用于分析的肌肉结构和功能非常有用。具体来说，骨骼肌蛋白质我们详细介绍了随后的免疫细胞化学定位，并通过活细胞钙成像刺激钙释放的定性分析。总体来说，这款视频本文提供了斑马鱼的骨骼肌纤维的分离和表征，一种技术，它提供了一种导管，用于肌肉结构和功能的无数的后续研究的直向前和有效的方法。
Introduction
骨骼肌是负责生成所必需的蠕动收缩力高度专业化的组织。收缩是通过称为兴奋-收缩（欧共体）耦合，转换电信号从细胞内贮存1,2钙释放的过程开始。细胞内钙释放激活的肌节缩短和产生力量。负责调解神经肌肉接头处传递3，EC耦合4,5，和肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩6的分子机器的许多具体的组件继续深入研究的持续主题。此外，在收缩7,8和介导的肌纤维和细胞外基质7,9之间的信令稳定肌细胞膜蛋白已经确定，并研究了很详细。
在许多基因的肌肉结构的重要突变ND功能已被确定为人体骨骼肌肉疾病的原因（ http://www.musclegenetable.org/ ）。这些疾病，大致分类为基础的临床和病理特征骨骼肌肌病和肌营养不良症，都与肌肉无力，终身残疾，早期死亡率10,11相关联。斑马鱼已被证明是用于建模和研究人类骨骼肌肉疾病8,12,13一个优秀的系统。它已被用来验证新的基因突变8，确定疾病的病理生理学14,15的新内容，并找出新的治疗方法15,16。斑马鱼研究人类肌肉疾病的功率涉及大量的后代，肌肉结构和功能，斑马鱼胚胎的光学透明度，并且易于显影斑纹的遗传药理学和操纵的快速发展的鱼17。
我们和其他人12,18,19最近开发出一种简单的技术为肌纤维来自发展中国家斑马鱼的快速，高效的隔离。这种方法使肌纤维的考试比可以通过全胚胎分析提供更多细节。该技术已被开发用于蛋白质亚细胞定位20以及表征为重要病理特征为在新开发的疾病模型21的验证研究的一部分的识别。此外，孤立的肌纤维还可以用于实时成像和电生理研究22，技术，允许对肌肉功能的关键方面的审讯。的特定协议为肌纤维隔离，随着后续的分析实验的两个例子，在该原稿的其余部分详细说明。
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Protocol
1。聚-L-赖氨酸的制备涂层盖玻片（时间：1小时）
涂层盖玻片允许快速肌纤维的沉降和附着。这可能在肌纤维隔离（下面的步骤2）的解离步骤中进行。
- 切割和封口膜放置在60毫米培养皿（任何品牌）的底部。
- 放置显微镜盖玻璃卡瓦（12毫米直径）上的Parafilm在60mm组织培养皿或单独放置在单个井的24孔板中。
注1：这些小圆形盖玻片有助于集中肌纤维数量和减少多余抗体的使用。
注2：其他大小的盖玻片也行，不过，使用的试剂和胚胎的体积将需要进行相应的调整。
- 移液器50-200微升的聚-L-赖氨酸上的每个玻璃盖在培养皿溶液（0.01％）。
- 让盖玻片坐至少一个浩乌尔在37°C再孵育不会产生负面影响的结果。
- 从玻璃盖除去聚-L-赖氨酸溶液中，用最少的100μl的1×PBS中洗两次。
- 允许盖玻片干燥。
- 盖玻片现在已经准备好为肌纤维。
注3：为了确保无菌，涂层可以在发动机罩和高压灭菌的盖玻片进行。
注4：保持底部60毫米培养皿用封口膜。这种设置将肌纤维电镀和免疫标记（后面的步骤）期间使用。
选择1：相反涂层盖玻片在使用前立即的，涂覆的盖玻片库存都可以使用。可以存储在包含众多盖玻片4℃含有至少2毫升聚L-赖氨酸60毫米培养皿。用这种替代从步骤1.5处理盖玻片肌纤维。
方案2：我们也聚-L-鸟氨酸大衣盖玻片。 Ŧ他是劳动密集型的，而且是用于较长期培养有用的，因为多聚-L-鸟氨酸涂布的盖玻片上可以是紫外线处理。用紫外线治疗和精心无菌技术活肌纤维通常可以维持在培养4-7天。
2。斑马鱼胚胎和电镀肌纤维（1至3小时的时间）的解离
注：标准协议适用最好3旦（天受精后）胚胎。
- 转移斑马鱼胚胎成一个标准的1.5 ml离心管中，去除尽可能多的多余的鱼水之成为可能。通常情况下，每管10-20胚，虽然少都可以使用。使用超过20-25胚胎通常导致过度的制备密度。
- 删除之前解离绒毛膜，手动使用＃5镊子。另外，化学绒毛膜去除与一个10-15分钟链霉蛋白酶处理来实现。通常情况下，以前的去除绒毛膜只需要当MUT事先确认蚂蚁的表型或形态是必需的，或者使用阶段时，其中胚胎是自然地从他们的绒毛膜孵化。
- 加入900微升的CO 2的独立媒体，以含有胚胎的试管。
- 加入100μl胶原酶II型，终浓度3.125毫克/毫升，开始解离（31.25毫克/毫升稀释在1×PBS中免胶原酶溶液）。 Ⅳ型胶原酶也可用于分离。
- 旋转在轨道摇床胚胎，并使用P1000的Pipetman的研磨磨碎，每30分钟，在室温。
注2：仔细监测胚胎分离;过高或过低解离（尤其是以上）是协议失败的最常见原因。次消化将取决于研磨，每管胚胎数，和胚胎的年龄的强度而变化。它也往往较少（相比于野生型），用于从骨骼肌突变体胚胎。
注3：每胚龄平均消化时间：1 DPF = 1小时，2 DPF = 1.5小时，3 DPF = 2小时，4 DPF = 2-2.5小时。
- 终止消化时，没有整个胚胎是可见的，但坚固件仍清晰可见- 这是必不可少的，以防止过 量。
- 离心管中，以离解的胚胎在0.8〜xg离心3-5分钟以沉淀细胞。
- 从沉淀的细胞除去上清液，用CO 2独立媒体洗2倍。
- 加入新鲜的CO 2独立媒体重悬细胞。 1毫升通常用于10-20胚胎的棉片。的体积可以根据胚胎数进行缩放。
- 使用P1000的移液管，通过一个70微米的过滤器通过胚胎停牌。这有助于从预习中删除不需要的杂物。
注4：胚胎悬浮液进行过滤，第二次通过一个40微米的过滤器，以进一步去除不必要的杂物。从双重过滤，回收是逼近的ately 800微升从1毫升的起始体积。
- 加约50-100微升肌纤维悬浮液的各聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。
注5：用封口膜底部执行在培养皿中的步骤2.9，先前准备的。该封口膜保持运行脱涂盖玻片的肌纤维悬浮液。保持覆盖，以防止水分蒸发的培养皿中。
- 允许肌纤维沉降约1小时到涂覆的盖玻片在室温下。
注6：肌纤维将开始在5-10分钟解决。然而，良好的肌纤维附着，最低1小时（1-2小时）的建议。使肌纤维定居更长不会伤害准备。对于较长的孵育（包括过夜），抗生素可以被添加到该介质。用抗生素和无菌技术的活培养物通常可以维持1-2天。
- 现场米yofibers可以在这一点上被观察到。从胚胎2旦肌纤维和以后将被看作是横纹肌和伸长的细胞（ 图1）。此时，肌纤维现在已经准备好现场分析或免疫标记。
注7：从1骨骼肌DPF胚胎不板作为拉长，并明确横纹肌纤维。相反，大myoballs是可见的。此外，丸粒化阶段后的解离过程中（步骤2.6），1旦myoballs要被离心的最低的8分钟，在5000×g离心来实现沉淀。胚胎在此阶段的分析，它是推荐使用表达EGFP特异性骨骼肌23的转基因株系。这将允许鉴定细胞的肌肉起源与其他来源。
3。游离斑马鱼肌纤维的荧光免疫染色（时间：约1天）
3.1。免疫标记
- 除去的部分从肌纤维粘附到涂覆的盖玻片媒体
- 用4％多聚甲醛或甲醇固定细胞。对于PFA，取出半的媒体音量，更换有PFA的量相同。修正了在室温下10分钟，然后取出总量，取代50-100微升的PFA，并编定一个额外的10分钟。对于酒精固定，冰冷甲醇或丙酮可以在4℃，分别施加10分钟或5分钟。
- 洗肌纤维至少3到5倍用1×PBS或1x PBS加0.1％吐温。一般洗涤量为每盖玻片50-100微升。
- 加入封闭液，以肌纤维（股份合作），并孵育20-60分钟，在室温下。封闭液将根据第一和第二抗体而异。两种最常见的在实验室中使用的是（1）的1×PBS，2毫克/毫升牛血清白蛋白，1％绵羊血清，0.25％的Triton X-100的最终和（2）0.2％的Triton X-100，2毫克/毫升（0.2 ％BSA）和5％绵羊/山羊血清。
- 除去封闭液，加入稀释为B一抗锁定的解决方案或PBS。过夜孵育肌纤维在4℃下请务必要么封口膜或包裹在保鲜膜含有涂有抗体的肌纤维装盖玻片的培养皿中。可以添加小件浸湿纸巾来创建一个加湿室。
- 从盖玻片除去第一抗体和洗涤盖玻片3 - 5×5分钟，用PBS或阻断溶液。
- 加入二抗，适当的浓度稀释在1×PBS或1-2小时在室温封闭液。
- 去除二级抗体并在PBS中，每次5分钟，在室温洗肌纤维3〜5倍。
3.2。安装盖玻片
- 适用于1-2滴抗淬灭剂对载玻片。
- 使用镊子和地点（肌纤维向下）盖玻片上的载玻片的抗淬灭剂仔细回升的涂层和immunolabled盖玻片。
注1：注意到c的方向oated盖玻片是至关重要的。
- 躺在1-2的Kimwipes在坚硬的固体表面。快速反转与涂盖玻片搁在抗淬灭剂的幻灯片，并将其放置（盖玻片下）上的Kimwipes。
- 轻轻按压在显微镜幻灯片的角落，以除去多余的抗淬灭，并形成滑动和盖玻片之间的密封
- 允许残留干燥在室温5-10分钟的抗淬灭，然后将肌纤维准备图像（ 图2A和B），或储存于4℃。
4。活细胞钙成像使用GCaMP3
活细胞的实验可以在肌纤维前固定（以下步骤2.10）来进行。以下协议描述了肌纤维表达GCaMP3 24，一种基因编码的钙指示剂，由骨骼肌特异性的斑马鱼α-肌动蛋白启动子（pSKM）23表达的实时成像。另外，这种技术可以很容易地适合于使用钙指示剂染料如Fura-2的。
- 注射胚胎pSKM：GCaMP3构建在1-2细胞期
- 在3 DPF，收集幼虫和在第1和2中所述准备肌纤维。使肌纤维附着了至少1小时的。对于该技术中，在24孔培养皿中制备盖玻片是必需的。
- 小心地取出多余的介质，并加入300微升新鲜的CO 2的独立媒体在室温。
- 观察在倒置显微镜下的细胞。 GCaMP3阳性肌纤维应根据绿色荧光可见。
- 设置相机用于记录，如果需要的话。
- 准备中的CO 2独立媒体30毫米咖啡因的解决方案。为刺激细胞，轻轻吸取300微升的咖啡因溶液倒入井中下放大倍率。在5-10秒，GCaMP阳性肌纤维应该响应与咖啡因（ 图3），在荧光的快速增长。 MyofibERS也可能收缩。值得注意的是，咖啡因诱导的肌浆网卖场25钙释放。其它试剂，如氯化钾26和兰尼4，可用于研究诱导的钙释放。
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Representative Results
肌纤维的荧光免疫染色（ 图2）
从显示预期的肌纤维荧光标记图形图像成功分离和电镀后免疫染色。在肌纤维已被标记为与抗兰尼碱受体（1:100）（ 图2A）或抗α-辅肌动蛋白（1:100）（ 图2B）的抗体，并分别揭示三联及Z带的免疫染色。用二抗的Alexa Fluor 555（1:500）。图像利用共聚焦显微镜拍摄的。
从肌纤维诱发的钙释放（ 图3）
面板系列从显示咖啡因处理一个孤立的肌纤维的代表钙释放。简言之，斑马鱼胚胎注射在一个小区阶段与pSKM：GCaMP3构造。在3 DPF，由于胚胎在公关描述的解离和镀otocol。为了便于分析，GCaMP3表达的肌纤维被选中，通过绿色荧光的在基线存在所示。使用微量药物给药，所选的光纤沐浴在30毫米咖啡因溶液中以诱导钙释放。视频录制开始前对咖啡因的应用，一直持续到荧光峰值达到。该图演示了正常的咖啡因诱导的钙释放，该技术可以用来审问通过实时成像的兴奋收缩偶联设备。
图1。胚胎分解示意图时间轴。连续面板（从上到下）说明各个步骤，时间安排和需要的胚胎分离设备A）选择胚胎的离解。比例尺500微米B）我法师解离设置的。胚胎是在媒体和胶原酶同时转动，直到充分分解这两种肌纤维电镀技术（协议第2步），C）的图像;。圆盖玻片或24孔板（协议步骤1和4，分别）D）明场。现场的图像分解镀上聚L赖氨酸包被的盖玻片斑马鱼肌纤维。箭头表示拉长肌纤维从48 HPF斑马鱼。比例尺为30μm。
图2。从48 HPF斑马鱼胚胎中分离出单个肌纤维的免疫标记A）肌纤维用抗兰尼碱受体（RYR1），露出一个带状图案沿纤维与本土化的黑社会/ EC连接装置B）一致的肌纤维标记抗α -辅肌动蛋白，visualizin克条纹（红色）沿肌纤维定位于肌节，并强调在Z带。在这两个图像，细胞核用DAPI标记，看作是蓝色的椭圆形。插入显示肌纤维的高放大倍数的图像在大图像A）和B）比例尺30微米。
图3。代表致从一个单一的孤立的斑马鱼肌纤维钙释放响应。所有的面板显示一个伪彩色斑马鱼肌纤维表达GCaMP3。的时间过程显示GCaMP3荧光（红色）的响应于应用程序的30mM的咖啡因的增加。录制开始前对咖啡因的应用（0毫秒），并持续到最大荧光反应（992毫秒）。比例尺为30μm。NK“>点击这里查看大图。
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Discussion
斑马鱼是研究体内 25,27,28肌肉发育和功能的有力脊椎动物模型系统。他们也成为一笔宝贵的财富用于模拟人类肌肉疾病14,15,20,29。虽然大踏步已采取提前斑马鱼的肌肉功能和肌肉疾病的研究的使用和应用，有一个恒定的迫切需要开发工具，让更多的深入分析，赞美的遗传，形态，行为和功能优点斑马鱼已经提供17。因此，我们已经适应，并开发了一个简单和强大的技术从整体分离斑马鱼胚胎的肌纤维的特性。
使用单个肌纤维是司空见惯使用的小鼠模型系统研究。在小鼠中这允许调查和分析是在整体动物不切实际或不可能的，包裹体鼎亚细胞蛋白定位研究30，活细胞成像31，和电测量32。在斑马鱼中，类似的解离技术此前已开发出专门识别和检查运动神经元33以及Rohon -比尔德感觉神经元34，并且这些技术都使这些神经元亚型的详细分析。
孤立的肌纤维的广泛适用性，结合了许多独特的优势，提供了斑马鱼作为一种脊椎动物模型17，是什么促使我们开发用于分离和鉴定胚胎和幼虫斑马鱼肌纤维的技术。我们已经利用孤立的肌纤维在以往的研究，以确定肌肉蛋白20,21的亚细胞定位，研究的chimerically表达的转基因35的定位和定义特定的肌纤维参数，包括特别尺寸
格拉布纳和他的同事也有使用肌纤维系统取得了巨大成功19,22,36。他们是唯一的组汇报分离纤维的长期培养。此外，他们已能够使用纤维来测量肌肉的电生理特性。具体地说，他们已经测试了二氢吡啶受体的β亚基的损失的钙释放的影响，并测定了一组转基因的拯救防卫厅的能力仙本新闻稿中。这些研究阐明了一些孤立的肌纤维的功能非常强大的应用潜力。
另一组报告使用的肌纤维制备的研究肌肉疾病是尼克松等人谁使用的肌纤维，研究了吗啉介导的3小窝击倒在肌肉发育和肌肉结构18的影响。这些作者不仅考察参数通过光镜，而且还研究了用电子显微镜的纤维。他们的工作确定了孤立的肌纤维系统的另一个优点：研究肌纤维的超微结构在隔离和控制设置的能力。
这些研究，连同我们的工作中，指向该技术的潜在的广泛实用性。其他应用程序一定会得到发展，如测量快速钙尖峰使用指标一样的Fura-2。此外，该制剂提供了机会，安装前后已经电活动，如通过电压敏感染料（二-4-ANEPPS）或直接电生理记录动作电位。它似乎很清楚，对小鼠的肌纤维用于目前所有的技术应该适用于斑马鱼肌纤维。此外，为表达不同转基因的斑马鱼开发，以及大和越来越多的转基因斑马鱼的不同表达标记蛋白（可用性的能力www.zfin.org ），增加了复杂性和适用性的附加 层的制度。我们证明了这个事实与培养的肌纤维从GCaMP3表达斑马鱼，在这里我们把所要表达的GCaMP3肌肉，研究诱导的钙成像实时隔离纤维（ 图3）的能力优势。
与大多数的技术，也有一些明显的限制，所述分离的肌纤维系统。这些问题是除了立场在体外研究的细胞类型的ARD的缺点，其功能如同进行电生理实验与非生理性刺激体内三维合胞体和。用我们的方法，一种是不能得到的肌纤维的纯制剂。这是不适合的免疫染色或用于电生理学测量中的问题，但它并排除某些实验方法。举例来说，我们还没有确定一个合适的方法确定肌纤维的纯人口转录组分析。我们试图表达GFP的肌纤维后跟肌纤维的制备FACS分选，但是这并没有导致的纯培养物与肌纤维为RNA或蛋白质分析的合适的数量。
另一个挑战是肌纤维的长期培养。我们一直能够保持培养约24小时，格拉布纳和同事报告的准备一个已经吹田市竹叶提取用于实验的19多天。有关该技术的此方面的挑战是防止污染，因为这些培养物（很像鼠肌纤维棉片）通常难以保持无菌。伟大的护理是必要的，如果一个是试图延长文化。我们也建议使用抗菌药物，包括抗真菌剂。
总之，我们证明斑马鱼肌纤维的分离，以及轮廓如何在孤立的纤维制品进行荧光免疫标记和实时钙成像的实用方法。这种技术的持续改进和发展将提供工具来尝试在斑马鱼特定的，孤立的细胞类型不断扩大剧目。通过分离斑马鱼胚胎成孤立的个体的肌纤维，我们可以进一步增强我们的肌肉的发育，功能和疾病的认识。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢道林实验室的成员（亚伦Reifler，特伦特沃，安吉拉布斯塔，和威廉特尔弗）促成了技术的发展和生产的手稿。这项工作是由该研究所陶布曼，小儿科的部门在密歇根大学，并在部分从肌肉萎缩症协会（JJD MDA186999）和美国国立卫生研究院（JJD 1K08AR054835）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
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