Summary
Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.
Abstract
Zebra balığı iskelet kası fonksiyonunu keşfetmek için ve insan kas hastalıklarının araştırılmasında değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle bütün embriyolar, kas fonksiyonu için sorumlu karmaşık ve ince yapılı protein ortam görselleştirme, Zebra balığı iskelet kasının in vivo analizi tarafından sunulan birçok avantajlara rağmen, sorunlu olabilir. Bu engel Zebrafish iskelet kası (60 mikron) ve sarkomerinde daha küçük boyutu küçük boyutu kaynaklanmaktadır. Burada tarif ve zebra balığı embriyolar ve larva iskelet myofibers izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz de kas yapısını ve fonksiyonunu analiz için yararlıdır sonrası hazırlama tekniklerini göstermek protokollerini içerir. Özellikle, biz detay iskelet kas proteinlerinin sonraki immünositokimyasal yerelleştirme ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme yoluyla uyarılan kalsiyum sürümü kalitatif analizi. Genel olarak, bu videozebra balığı madde iskelet myofibers izolasyonu ve karakterizasyonu, kas yapısı ve fonksiyonu, sayısız sonraki çalışmalar için bir oluk sağlayan bir teknik için, doğrudan ve etkili bir yöntem sağlar.
Introduction
İskelet kası motilite için gerekli kasılma kuvvetleri üreten sorumlu son derece özel bir dokudur. Daralma içi mağazalardan 1,2 kalsiyum serbest elektrik sinyalleri dönüştüren eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı olarak bilinen bir süreç yoluyla başlatılır. Hücre içi kalsiyum bırakma kuvvetinin kısaltmak ve oluşturmak için sarkomerinde geçirir. Nöromüsküler kavşak iletimi 3, AK kaplin 4,5 ve aktin-miyozin bağımlı kasılmalar 6 aracılık sorumlu moleküler makinelerin çok özel bileşenler yoğun araştırma devam eden konu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, daralma 7,8 ve miyofiberde oluşan ve hücre-dışı matris 7,9 arasında sinyal olduğu mediate sırasında kas membranı stabilize proteini, tespit edilmiştir ve ayrıntılı olarak incelenmiştir.
Kas yapısı a için önemli olan bir dizi genlerde mutasyonlarnd fonksiyonu (insan iskelet kası hastalıklarının nedeni olarak tanımlanmıştır http://www.musclegenetable.org/ ). Klinik ve histopatolojik özelliklere dayanarak iskelet miyopatilerde ve kas distrofilerinde gibi genel olarak sınıflandırılabilir Bu hastalıklar, kas güçsüzlüğü, yaşam boyu sakatlık ve erken mortalite 10,11 ile ilişkilidir. Zebra balığı insan iskelet kası hastalıkları 8,12,13 modelleme ve eğitim için olağanüstü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Bu, yeni gen mutasyonları 8 doğrulamak hastalığın patofizyolojisi 14,15 yeni yönlerini tanımlamak ve yeni tedavi yaklaşımları 15,16 tanımlamak için istihdam edilmiştir. Insan kas hastalığı incelemek için Zebra balığı gücü yavrular, kas yapısı ve fonksiyonu, Zebra balığı embriyo optik netlik ve gelişmekte olan zebra genetik ve farmakolojik manipülasyon kolaylığı hızlı gelişme çok sayıda ilgilidirbalık 17.
Biz ve diğerleri 12,18,19 son zamanlarda gelişen zebrafish myofibers hızlı ve verimli izolasyonu için basit bir teknik geliştirdik. Bu yöntem, tüm embriyo analiz edilmesi için daha fazla ayrıntılı olarak myofibers incelenmesini sağladı. Bu teknik, yeni geliştirilmiş hastalık modellerinde 21 doğrulama çalışmalarının bir kısmı olarak önemli histopatolojik özelliklerinin tanımlanması için protein alt hücresel lokalizasyonu 20 hem de karakterizasyonu için istifade edilmiştir. Ayrıca, izole myofibers ayrıca canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik çalışmalar 22, kas fonksiyonlarının temel yönleri sorgulama için izin teknikleri kullanılabilir. Sonraki analitik deneyler iki örnekleriyle birlikte miyofiberde oluşan izolasyon için özel bir protokol, bu yazının geri kalan bölümlerinde ayrıntılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Poli-L-Lizin hazırlanması kaplı kapak (Süre: 1 saat)
Kaplama lamelleri hızlı miyofiberde oluşan çökmesi ve yapışma sağlar. Bu miyofiberde oluşan izolasyonu (Adım 2) 'in ayrışma aşaması esnasında gerçekleştirilebilir.
- Kesme ve bir 60 mm Petri kabı (herhangi bir marka) altındaki Parafilm yerleştirin.
- Bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde Parafilm mikroskop kapak camı fişleri (12 mm çapında) yerleştirilir ya da 24 oyuklu plakalar, tekli oyuklar içerisinde tek tek yerleştirin.
Not 1: Bu küçük yuvarlak lamelleri miyofiberde oluşan sayılar konsantre ve aşırı antikor kullanımını azaltmaya yardımcı olur.
Not 2: Diğer boyutu lamelleri çalışacaktır ancak, kullanılan reaktif ve embriyoların hacimleri buna göre ayarlanması gerekir.
- Pipet Petri kabındaki her bir kapak camı ile ilgili poli-L-lizin çözeltisi (% 0.01) 50-200 ul.
- Lamelleri en az bir ho oturmak için izin37 ° C'de ur Uzun inkubasyon olumsuz sonuçlarını etkilemeyecektir.
- Kapak cam, poli-L-lisin çözüm çıkarın ve 100 ul 1 x PBS, en az iki kez yıkayın.
- Lamelleri kurumasını bekleyin.
- Lameller şimdi myofibers için hazırız.
Not 3: sterilite sağlamak için, kaplama, bir başlık ve otoklav lamelleri yapılabilir.
Not 4: alt Parafilm ile 60 mm Petri kabı tutun. Bu kurulum miyofiberde oluşan kaplama ve immunolabeling (daha sonra adım) sırasında kullanılan olacaktır.
Alternatif 1: Bunun yerine, kullanımdan hemen önce kaplama lamelleri, kaplanmış bir lamel stok kullanılabilir. 2 ml poli-L-lizin ihtiva eden en az bir 60 mm Petri kabı, çok sayıda lamelleri içeren 4 ° C'de saklanabilir. Bu alternatif ile myofibers için lamelleri işlem aşamasında 1,5 başlar.
Alternatif 2: Ayrıca, poli-L-omitin kat lamelleri. Tonun daha yoğun emek olmakla birlikte, poli-L-ornitin kaplı lamelleri UV muamele edilmiş olabilir, çünkü daha uzun süreli kültür için yararlıdır. UV tedavisi ve dikkatli steril tekniği ile canlı myofibers genellikle 4-7 gün kültür içinde muhafaza edilebilir.
2. Myofibers Zebra balığı Embriyolar ve Kaplama (: 1 ila 3 saat Süresi) Ayrışma
Not: standart protokol 3 dpf'e (gün sonrası fertilizasyon) embriyolar için en iyi geçerlidir.
- Standart bir 1.5 ml santrifüj tüpüne zebra balığı embriyo transferi ve mümkün olduğu kadar fazla balık suyu çıkarmak. Tipik olarak, daha az olsa da tüp başına 10-20 embriyo, kullanılabilir. Birden fazla 20-25 embriyo kullanılması genellikle aşırı bir yoğunluk hazırlanması ile sonuçlanır.
- Elle 5 forseps # kullanarak, önce disosiyasyonundan chorions çıkarın. Seçenek olarak ise, kimyasal koryon kaldırma 10-15 dakika Pronaz tedavisi ile elde edilir. Tipik olarak, koryon önceki kaldırma sadece gerektiğinde bir mut önceden onaykarınca fenotip veya morfoloji gereklidir, ya da aşamaları kullanırken embriyolar doğal koryon yumurtadan nerede.
- Embriyoları içeren tüp CO 2 bağımsız medya 900 ul ekleyin.
- 100 kollajenaz tip II ul, nihai konsantrasyonu 3.125 mg / ml ayrışmasını başlatmak için (31.25 mg / 1x PBS içinde seyreltilmiş ml Stock at kolajenaz solüsyon) eklenir. Kollajenaz IV, aynı zamanda ayrılması için de kullanılabilir.
- Orbital bir karıştırıcı üzerinde embriyolar döndürün ve toz haline getirme için bir P1000 Pipetman kullanılarak oda sıcaklığında 30 dakika çiğnemek.
Not 2: Dikkatle embriyo ayrışmayı izlemek; (özellikle over) üzerinden veya ayrışma altında protokol başarısızlığın en yaygın nedenleri vardır. Sindirim için Times toz haline getirme, tüp başına embriyo sayısı ve embriyo yaşı yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. Ayrıca kas iskelet mutantlardan embriyolar için (doğal tür ile karşılaştırıldığında), genellikle daha azdır.
Not3: embriyo yaş Ortalama sindirim süresi: = 1 saat 1 dpf, 2 dpf'e = 1.5 saat, 3 dpf'e = 2 hr ve = 2-2.5 saat 4 dpflik.
- Hayır bütün embriyolar görünür, ama sağlam parçaları hala görünür olduğunda sindirim Dur - Bu Overdigestion önlemek için şarttır.
- Pelet hücrelere 3-5 dakika boyunca 0,8-2,3 xg'de ayrışmış embriyolar ile santrifüj tüpleri.
- Peletleşmiş hücrelerden süpernatant kaldırmak ve CO 2 bağımsız medya ile 2x yıkayın.
- Hücrelerin tekrar süspansiyon taze CO 2 bağımsız medya ekleyebilirsiniz. 1 ml tipik haliyle, 10-20 embriyo preparatlarıyla için kullanılır. Hacmi embriyo sayısına göre ölçeklenebilir.
- P1000 bir pipet kullanarak, 70 um'lik bir filtreden embriyo süspansiyon geçmektedir. Bu hazırlık istenmeyen enkaz kaldırmak yardımcı olur.
Not 4: Embriyo Süspansiyon istenmeyen birikintileri temizlemek için bir 40 um'lik bir filtreden bir kez daha filtre edilebilir. Bir çift filtrasyon, kurtarma approxim olduğunu1 ml 'lik bir başlangıç hacminden rilmesi 800 ul.
- Her bir poli-L-lizin kaplı lamel miyofiberde oluşan süspansiyonu yaklaşık 50-100 ul ekleyin.
Not 5: alt Parafilm ile Petri tabaklarında adım 2.9 yapın, önceden hazırlanmış. Parafilm kaplı lamelleri akıp miyofiberde oluşan süspansiyon tutar. Buharlaşmasını önlemek için kapalı Petri yemekleri tutun.
- Myofibers oda sıcaklığında kaplanan kapak slipleri üzerine, yaklaşık 1 saat yerleşmeye izin verin.
Not 6: myofibers 5-10 dakika içinde yerleşmeye başlayacak. Ancak, iyi miyofiberde oluşan bağlanması için, 1 saat (1-2 saat) bir minimum tavsiye edilir. Myofibers uzun yerleşmek için izin hazırlık zarar vermez. (Gece boyunca dahil) daha uzun inkubasyon için, antibiyotikler ortama ilave edilebilir. Antibiyotik ve steril tekniği ile canlı kültürler genellikle 1-2 gün süreyle muhafaza edilebilir.
- Canlı myofibers bu noktada görülmektedir. Embriyolar 2 dpf den myofibers ve daha sonra çizgili ve uzunlamasına hücreleri (Şekil 1) olarak görülecektir. Bu noktada, myofibers şimdi canlı analiz veya immunolabeling için hazırız.
Not 7: embriyolardan dpf'e 1'den İskelet kası gibi uzun ve açıkça çizgili lifleri plaka değil. Bunun yerine, büyük myoballs görebilir. Buna ek olarak, peletleme sonrası faz ayrışması sırasında myoballs bir pelet elde etmek için 5000 x g'de 8 dakika boyunca santrifüje tabi az olması gerekir 1 dpf (2.6 adım). Bu aşamada embriyolar analizi için, bu özellikle iskelet kası 23 EGFP ifade eden transgenik hat kullanmak tavsiye edilir. Bu, diğer kaynaklardan karşı kas kökenli hücrelerin tanımlanmasına izin verir.
3. Disosiye Zebra balığı myofibers floresan İmmünoboyama (Saat: yaklaşık 1 gün)
3.1. Immunolabeling
- Bir kısmını çıkarmakkaplanmış lamel yapışık myofibers medya
- % 4 paraformaldehit ya da metanol kullanılarak, hücreler. PFA için, medya hacmi ½ kaldırmak ve PFA aynı miktarda değiştirin. , Tüm hacim kaldırmak, daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca saptamak PFA 50-100 ul ile değiştirin ve ek bir 10 dakika boyunca düzeltin. Alkol tespiti, buzla soğutulmuş metanol ya da aseton için, sırasıyla, 10 dakika ya da 5 dakika boyunca 4 ° C 'de uygulanabilir.
- Myofibers en az 1 adet 1 x PBS ya da PBS ile 3-5x artı% 0.1 TWEEN yıkayın. Ortalama yıkama hacmi lamel ortalama 50-100 ul.
- Myofibers solüsyonu (stokları çalışma) bloke edin ve oda sıcaklığında 20-60 dakika kuluçkalayın. Bloke edici çözelti, birincil ve ikincil antikorlar bağlı olarak değişecektir. Laboratuarda kullanılan en yaygın iki (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA,% 1 serum koyun,% 0.25 Triton X-100, kesin ve (2)% 0.2 Triton X-100, 2 mg / ml (0.2 olan % BSA) ve% 5 koyun / keçi serumu.
- Çözümü engelleme çıkarın ve b ya seyreltilmiş primer antikor ekleyinçözeltisi ya da PBS kilitleme. 4 ° C de bir gece inkübe myofibers Parafilm ya emin olun veya antikor ile kaplanmış miyofiberde oluşan yüklü lamelleri içeren Petri şal saran sarın. Nemli bir kağıt havlu küçük parçalar nemlendirilmiş odası oluşturmak için ilave edilebilir.
- Lamelleri primer antikor çıkarın ve 5 dakika PBS ile veya engelleme çözümü için lamelleri 3-5x yıkayın.
- 1x PBS ya da oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun konsantrasyonda ikincil antikor ekleyin.
- İkinci antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS içinde myofibers 3-5x yıkayın.
3.2. Montaj lamelleri
- Bir mikroskop lamı antifade ayıracı 1-2 damla uygulayın.
- Dikkatle pick-up kaplamalı ve immunolabled lamel mikroskop lamı üzerine antifade reaktif üzerinde lamel (myofibers aşağı) forseps ve yer kullanarak.
C yönüne Dikkat: Not 1oated lamel kritiktir.
- Sert ve katı bir yüzeye 1-2 Kimwipes yatıyordu. Çabuk antifade reaktif üzerinde oturan kaplı lamelleri ile slayt ters ve Kimwipes (aşağı lamel) yerleştirin.
- Aşırı antifade kaldırmak ve slayt ve lamel arasında sıkı bir mühür formu mikroskop lamı köşelerine hafif bir basınç uygulayın
- , Oda sıcaklığında 5-10 dakika için kurumaya kalan antifade ardından myofibers 4 ° C 'de (Şekil 2A ve B) veya imajı hazır izin ver
4. GCaMP3 kullanarak canlı hücre Kalsiyum Görüntüleme
Canlı hücre deneyleri (adım 2.10 aşağıdaki gibi) önceden tespit etmek myofibers yapılabilir. Aşağıdaki protokol GCaMP3 24, iskelet kası, belirli zebra balığı α-aktin promoteri (pSKM) 23 ile ifade edilen bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, ifade myofibers canlı görüntüleme açıklar. Seçenek olarak,Bu teknik hali hazırda bu tür Fura-2 kalsiyum göstergesi boyalar kullanmak için adapte edilebilir.
- PSKM ile embriyolar enjekte: GCaMP3 1-2 hücreli aşamada inşa
- 3 dpf, larvaları toplamak ve bölümler 1 ve 2 de tarif edildiği gibi myofibers hazırlar. Myofibers 1 saat arasında, en az yapışmaya izin verin. Bu teknik için, 24 oyuklu tabaklarda lamelleri hazırlanması gereklidir.
- Dikkatle fazla ortamı çıkartın ve oda sıcaklığında taze CO 2 bağımsız medya 300 ul ekleyin.
- Bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. GCaMP3 olumlu myofibers yeşil floresan altında görünür olmalıdır.
- Istenirse, kayıt için kamerayı ayarlayın.
- CO 2 bağımsız medya 30 mM kafein çözeltisi hazırlayın. Hücreleri uyarmak için, yavaşça büyütme altında kuyuya kafein çözeltisi 300 ul pipet. 5-10 sn içinde, GCaMP olumlu myofibers floresan hızlı bir artış (Şekil 3) ile kafein yanıt vermelidir. Myofibers da sözleşme olabilir. Notun, kafein sarkoplazmik retikulum mağazalardan 25 kalsiyum salınımını uyarır. Bu tür KCl 26 ve riyanodin 4 gibi diğer maddeler, uyarılabilir kalsiyum serbest incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myofibers floresan immün (Şekil 2)
Myofibers beklenen floresan etiketleme modelini gösteren resimler başarılı izole edilmesi ve sonra kaplama immunohistokimyasal. Myofibers anti-riyanodin reseptörü (1:100) (Şekil 2A) ya da anti-α-aktinin (1:100) (Şekil 2B) ya da antikorları ile etiketlenmiş ve sırasıyla üçlü ve Z-bandın immün ortaya edilmiştir. Kullanılan ikincil antikorlar, Alexa Fluor 555 (1:500) idi. Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak çekilen.
Bir miyofiberde oluşan indüklenen kalsiyum sürümü (Şekil 3)
Kafein ile tedavi izole miyofiberde oluşan gelen temsilci kalsiyum salgılanmasını gösteren panel serisi. Kısaca, zebra balığı embriyolar pSKM olan bir hücre aşamasında enjekte edilmiştir: GCaMP3 yapısı. Pr tarif edildiği gibi 3 dpf olarak, embriyolar ve ayrışmış kaplanmıştırotocol. Başlangıçta yeşil floresan varlığı ile belirtildiği gibi analiz için, GCaMP3 ifade myofibers seçilmiştir. , Ilaç uygulaması için bir mikropipet kullanılarak, seçilen fiber kalsiyum salınımını uyarmak için bir 30 mM kafein çözeltisi ile yıkanır. Video kayıt önce kafein uygulama başlamış ve en yüksek flüoresans değeri elde edilene kadar devam edilir. Bu rakam, normal kafein uyarılan kalsiyum salınımını gösterir ve canlı görüntüleme tekniği ile uyanlma-kasılma birleştirme cihazı sorgulamak için kullanılabilir.
Şekil 1. Ayrışma için embriyo embriyo ayrışması için gerekli Embriyo Ayrışma şematik Timeline. Ardışık panelleri (yukarıdan aşağıya) bireysel adımları göstermek, zamanlama ve ekipmanlar. A) Seçim. Ölçek çubuğu 500 mikron. B) Iayrışma kurulum büyücü. .. Yuvarlak lamelleri veya 24-kuyu plakaları (Protokol D) parlak bir alan), sırasıyla, 1 ve 4 numaralı adımları; yeterince hem miyofiberde oluşan kaplama teknikleri (Protokol adım 2) C) Resmi ayrışmış kadar dönerken Embriyolar medya ve kollajenaz vardır Canlı görüntü poli-L Lizin kaplı lamelleri kaplama Zebra balığı myofibers ayrışmış. Oklar 48 hpf zebrafish uzatılmış myofibers göstermektedir. Ölçek çubuğu 30 mikron.
Şekil 2. 48 hpf Zebra balığı embriyolarının izole bireysel myofibers bir immün. A) miyofiberde oluşan anti-riyanodin reseptörü (RyR1) ile etiketlenmiş, üçlü / EC birleştirme aparatı. B) lokalizasyonu ile uyumlu fiber boyunca bir bantlı model ortaya miyofiberde oluşan anti-α ile etiketlenmiş -aktinin, visualizin sarkomerinde için lokalize ve Z bantları vurgulayarak miyofiberde oluşan boyunca g çizikleri (kırmızı). Her iki görüntüde de, çekirdekler, DAPI ile etiketlenmiş mavi oval olarak görülüyor. Uçlar büyük görüntü. A) ve B) ölçek çubuğu 30 mikron içinde miyofiberde oluşan yüksek büyütme görüntüleri göstermek.
Şekil 3,. Temsili tek bir izole Zebrafish miyofiberde oluşan kalsiyum serbest tepki kaynaklı. Tüm paneller GCaMP3 ifade eden bir yalancı Zebra balığı miyofiberde oluşan göstermektedir. Zaman süreci 30 mM kafeinin uygulanmasına karşılık olarak GCaMP3 floresan (kırmızı renk) bir artış göstermektedir. Kayıt öncesinde kafein uygulama (0 msn) başlamış ve maksimum floresan tepkisi (992 msn) devam etti. Ölçek çubuğu 30 mikron.nk "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı vivo 25,27,28 kas gelişimi ve işlevi çalışmak için güçlü bir omurgalı model sistem. Onlar da insan kas hastalıkları 14,15,20,29 modelleme için değerli bir varlık olarak ortaya çıkmıştır. Büyük atılımlar kas fonksiyonu ve kas hastalığı çalışma için zebrafish uygulanmasını ve kullanımını geliştirmek için alınmış olsa da, davranışsal ve fonksiyonel genetik, morfolojik, övgü daha derinlemesine analiz sağlayacak araçları geliştirmek için sürekli kritik bir ihtiyaç vardır avantajları Zebrafish zaten 17 sunuyoruz. Bu nedenle, uyarlanabilir ve ayrışmış bütün embriyolardan zebrabalıkları myofibers karakterizasyonu için basit ve sağlam bir teknik geliştirdik.
Bireysel myofibers kullanılması murin modeli sistemini kullanarak çalışmalarda olağandır. Farelerde bütün bu hayvanlarda imsansız olan soruşturma ve analizler için izin verdi including subsellüler protein yerelleştirme 30, canlı hücre görüntüleme, 31 ve elektrofizyolojik ölçümler 32 inceler. Zebra balığı, benzer ayrışma teknikleri, daha önce özellikle tespit ve nörotoksinlerini 33 gibi Rohon Sakal duyusal nöronlar 34 incelemek için geliştirilmiştir ve bu teknikler bu nöron alt tiplerinin ayrıntılı analizini sağlamıştır.
Zebra balığı bir omurgalı modeli 17 olarak sunduğu pek çok benzersiz avantajlar ile birlikte izole myofibers geniş uygulanabilirliği, bize embriyonik ve larva zebra balığı myofibers izole ve karakterize etmek için bir teknik geliştirmek için motive nelerdir. Biz chimerically ifade Transgenlerin 35 lokalizasyonu incelemek ve özellikle boyutu dahil olmak üzere belirli miyofiberde oluşan parametreleri tanımlamak için kas proteinlerinin 20,21 hücre içi lokalizasyonu belirlemek için önceki çalışmalarda izole myofibers kullanılan var
Grabner ve arkadaşları da büyük başarı 19,22,36 için miyofiberde oluşan sistemi kullandık. Onlar izole liflerin uzun kültürlemenin rapor tek grup vardır. Buna ek olarak, kas elektrofizyolojik özellikleri ölçmek için lifleri kullanmak mümkün olmuştur. Özellikle, kalsiyum yayın dihidropiridin reseptörünün beta alt-biriminin kaybı etkisini test edilmiş ve defe kurtarmak için transgenlerin bir dizi yeteneği ölçtükBu sürümde cts. Bu çalışmalar izole myofibers çok güçlü potansiyel uygulamaların bazılarını aydınlatmak.
Kas hastalığı eğitimi için miyofiberde oluşan hazırlık kullanımı bildirmek için bir diğer grup kas gelişimi ve kas yapısı 18 morfolinodur aracılı caveolin 3 Nakavt etkisini incelemek için myofibers kullanılan Nixon ve ark. Olduğunu. Bu yazarlar, ışık mikroskopisi ile incelendi parametreler, aynı zamanda elektron mikroskobu kullanılarak incelenmiştir liflerin değil. Bir izole edilmiş ve kontrollü bir ortamda miyofiberde oluşan bir ultra yapısını incelemek için yeteneği: Çalışmaları izole miyofiberde oluşan sistemin bir başka avantajı tanımlar.
Bu çalışmalar, bu tekniğin potansiyel geniş programı bizim işimiz, nokta ile birlikte. Ek uygulamalar gibi Fura-2 gibi göstergeleri kullanarak hızlı kalsiyum sivri ölçüm olarak, geliştirilecek kesin. Ayrıca, bu hazırlık obser için fırsat sunuyorBu tür gerilim duyarlı boyalar (Di-4-ANEPPS) veya doğrudan elektrofizyolojik kayıt yoluyla aksiyon potansiyelleri olarak elektriksel aktivite, ettik. Bu kemirgen myofibers üzerinde kullanılan tüm güncel teknikler Zebrafish myofibers için geçerli olması gerektiği açıkça görülmektedir. Buna ek olarak, geliştirme Zebrafish farklı transgenleri ifade, hem de (çeşitli işaretleyici proteinleri eksprese eden transjenik zebrabalıkları bir büyük ve giderek artan sayıda durumu yeteneği www.zfin.org ), karmaşıklık ve uygulanabilirlik ek bir katman ekler sistemi. Biz (Şekil 3) izole lifleri gerçek zamanlı olarak uyarılan kalsiyum görüntüleme çalışma kas GCaMP3 ifade yeteneği yararlanmak GCaMP3 ifade zebrabalıkları, kültüre myofibers ile bu gerçeği göstermektedir.
En teknikleri ile olduğu gibi, izole edilmiş miyofiberde oluşan sistemine bir açık kısıtlamalar da bulunmaktadır. Bu sorunlar standına ek olarakin vitro bir hücre tipi okuyan ard eksiklikler bu in vivo koşullarında, bir üç boyutlu sinsitiyum olarak ve fizyolojik olmayan uyarıcılarla elektrofizyolojik deneyler işlevleri. Bizim metodoloji kullanarak, bir myofibers saf bir preparat elde etmek mümkün değildir. Bu immün veya elektrofizyolojik ölçümler için bir sorun değil, ama bazı deneysel yaklaşımlar engel yoktur. Örneğin, transkriptomik analizi için myofibers saf bir nüfus belirlenmesi için uygun bir yöntem belirlemek için henüz. Biz miyofiberde oluşan hazırlanmasını takiben GFP ifade myofibers FACS sıralama çalıştılar, ancak bu RNA ya da protein ya da analiz için myofibers uygun bir sayı ile bir saf kültürde farkı bulunmamaktadır.
Başka bir sorun myofibers uzun vadeli kültür olduğunu. Biz yaklaşık 24 saat boyunca kültürleri tutmak mümkün olmuştur ve Grabner ve arkadaşları suita olmuştur rapor hazırlamadeney 19 birden fazla gün için erişilebilir. (Çok kemirgen miyofiberde oluşan preps gibi) bu kültürler genellikle steril tutmak zor gibi tekniğin bu yönüne ilişkin sorun, kirlenmesini engelliyor. Biri uzun süreli kültürleri girişimi ise büyük dikkat gerekir. Biz de dahil olmak üzere antifungallere Antimikrobiyallerin kullanılmasını tavsiye ederiz.
Bütün olarak, zebra balığı myofibers izolasyonundan hem de izole edilmiş fiber mamulün floresan immün ve gerçek zamanlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme taslak için pratik bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu tekniğin devam modifikasyon ve geliştirme zebrabalıkları spesifik izole hücre tipleri üzerinde deney araçları giderek genişleyen repertuarı sunacak. Izole bireysel myofibers içine Zebrafish embriyolar ayırmasıyla, biz daha fazla kas gelişimi, fonksiyonu ve hastalık anlayışımızı artırabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çatışan çıkarları beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar tekniğinin gelişimine ve yazının üretimine katkıda Dowling laboratuar üyeleri (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, ve William Telfer) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Taubman Enstitüsü, Michigan Üniversitesi Pediatri Bölümü ve Müsküler Distrofi Derneği (JJD MDA186999) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (JJD 1K08AR054835) hibe kısmen tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
