Summary
דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.
Abstract
דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מודל יקרת ערך לחקר תפקוד שרירי שלד ולחקר מחלות שריר אנושיים. למרות יתרונות רבים המוצעים על ידי ניתוח vivo של שרירי שלד בדג הזברה, לדמיין את סביבת החלבון המורכבת והמחוטב האחראי על תפקוד שרירים, במיוחד בכל עוברים, יכול להיות בעייתי. הפרעה זו נובעת מגודלו הקטן של שרירים שלד דג הזברה (60 מיקרומטר) ואת הגודל קטן עוד יותר של sarcomere. כאן אנו מתארים ולהדגים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד myofibers שלד מעוברים וזחלי דג הזברה. אנו גם פרוטוקולים הממחישים טכניקות הכנת הודעה שימושיות לניתוח מבנה שרירים ובתפקוד. באופן ספציפי, אנחנו פירוט הלוקליזציה הבאה immunocytochemical של חלבוני שריר שלד והניתוח איכותני של שחרור סידן מגורה באמצעות הדמיה סידן תא חי. בסך הכל, בסרטון וידאו זהמאמר מספק שיטה ישר קדימה ויעילה לבידוד והאפיון של myofibers שלד דג הזברה, טכניקה המספקת צינור ללימודים שלאחר מכן מספר עצום של מבנה שריר ותפקוד.
Introduction
שריר שלד הוא רקמה מאוד מיוחדת אחראית ליצירת כוחות ההתכווצות הכרחיים לתנועתיות. התכווצות היא יזם באמצעות תהליך המכונה צימוד עירור והתכווצות (EC) שממיר את אותות חשמליים לשחרור סידן מחנויות תאית 1,2. שחרור סידן תוך תאי מפעיל את sarcomere לקצר וליצור כוח. הרכיבים ספציפיים הרבים של המכונות מולקולריות האחראים לתיווך צומת neuromuscular שידור 3, צימוד EC 4,5, והתכווצויות תלויות יקטין שרירן 6 ימשיכו להיות הנושא המתמשך של מחקר אינטנסיבי. בנוסף, חלבונים שמייצבים את קרום השריר במהלך 7,8 ההתכווצות לתווך שאיתות בין myofiber והמטריצה תאית 7,9 זוהו ונחקרו בפירוט רב.
מוטציות במספר גנים חשובים למבנה שרירפונקצית nd זוהה כגורמים למחלות שריר שלד אנושיים (http://www.musclegenetable.org/). מחלות אלו, מסווגים רחב כmyopathies שלד וניוון שרירים המבוססים על מאפיינים קליניים וhistopathologic, קשורות לחולשת שרירים, נכות לכל החיים, ו10,11 תמותה המוקדם. דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מצטיינת לדוגמנות ולומד מחלות שריר שלד אנושיות 8,12,13. זה כבר מועסק כדי לאמת את המוטציות גנטיות חדשות 8, מגדיר את ההיבטים חדשים של הפתופיזיולוגיה המחלה 14,15, ולזהות גישות טיפוליות חדשות 15,16. כוחו של דג הזברה לחקר מחלת שריר אדם מתייחס למספר רב של צאצאים, ההתפתחות המהירה של מבנה שריר ותפקוד, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה, ואת הקלות של מניפולציה גנטית ותרופתית של הזברה מתפתחתדגים 17.
אנו ואחרים 12,18,19 לאחרונה פיתחנו טכניקה פשוטה לבידוד המהיר ויעיל של myofibers מדג הזברה מתפתחת. מתודולוגיה זו אפשרה הבחינה של myofibers בפירוט רב יותר מאשר יכול להיות מסופק על ידי ניתוח עובר שלם. הטכניקה נוצלה לאפיון של לוקליזציה subcellular חלבון 20 כמו גם לזיהוי מאפייני histopathologic חשובים כחלק ממחקרי אימות במודלים של מחלה חדשה שפותחו 21. יתר על כן, myofibers המבודד יכול בנוסף לשמש הדמיה חיות וללימודי אלקטרו 22, טכניקות שתאפשרנה החקירה של היבטים מרכזיים של תפקוד שרירים. הפרוטוקול הספציפי לבידוד myofiber, יחד עם שתי דוגמאות של ניסויים האנליטי שלאחר מכן, הוא מפורט בחלקים הנותרים של כתב היד הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coverslips הכנת פולי-L-ליזין מצופה (זמן: 1 שעות)
coverslips הציפוי מאפשר ליישוב myofiber מהיר והידבקות. זה עשוי להתבצע במהלך שלב הניתוק של בידוד myofiber (שלב 2 להלן).
- לגזור ולמקם Parafilm על החלק התחתון של צלחת פטרי 60 מ"מ (מותג כלשהו).
- הניחו תלושי לכסות מיקרוסקופ זכוכית (בקוטר מ"מ 12) על Parafilm בצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ או למקם אותם באופן אישי בבארות בודדות של 24 גם צלחות.
הערה 1: coverslips העגול הקטן אלה מסייעים להתרכז מספרי myofiber ולצמצם את השימוש בנוגדנים עודף.
הערה 2: coverslips גודל אחר יעבוד, עם זאת, הכמויות של חומרים כימיים ועוברים המשמשים צריכים להיות בהתאם.
- פיפטה 50-200 μl של פתרון poly-L-ליזין (0.01%) על כל מכסה זכוכית בצלחת פטרי.
- לאפשר את coverslips לשבת לפחות אחד הוur ב 37 ° C. incubations יותר לא להשפיע לרעה על תוצאות.
- הסר-L-ליזין פולי פתרון ממכסה הזכוכית ולשטוף פעמיים עם מינימום של 100 PBS μl 1x.
- לאפשר coverslips לייבוש.
- Coverslips מוכן לmyofibers עכשיו.
הערה 3: כדי להבטיח סטריליות, ציפוי יכול להיעשות במכסת מנוע ועל coverslips autoclaved.
הערה 4: שמור על צלחת פטרי 60 מ"מ עם Parafilm בתחתית. התקנה זו תשמש במהלך ציפוי myofiber וimmunolabeling (מאוחר יותר צעדים).
1 אלטרנטיבי: במקום coverslips הציפוי מייד לפני השימוש, ניתן להשתמש בם מניית coverslip מצופה. צלחת 60 מ"מ פטרי המכילה מינימום של 2 מיליליטר פולי-L-ליזין יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס המכילה coverslips רב. עם חלופה זו מתחילה בצעד 1.5 לעבד את coverslips לmyofibers.
חלופה 2: אנחנו גם coverslips מעיל בפולי-L-ornithine. Tשלו הוא יותר עבודה אינטנסיבית, אבל הוא שימושי עבור culturing לטווח ארוך יותר, כי coverslips מצופה פולי-L-ornithine יכול להיות UV שטופל. עם טיפול UV וטכניקה סטרילית זהירה בדרך כלל יכול להישמר myofibers החי בתרבות מן 4-7 ימים.
2. דיסוציאציה של עוברי דג הזברה וציפוי של myofibers (זמן: 1 עד 3 שעות)
הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי הטוב ביותר חל עד 3 DPF (לאחר ימי הפריה) עוברים.
- העבר את עוברי דג הזברה לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטנדרטי ולהסיר כמה שיותר מים דגים עודפים ככל האפשר. בדרך כלל, ניתן להשתמש בם 10-20 עובר לכל צינור, אם כי פחות. באמצעות יותר מ 20-25 עוברים לעתים קרובות תוצאות בהכנה של צפיפות יתר.
- הסר chorions לפני הניתוק, באופן ידני באמצעות # 5 מלקחיים. לחלופין, ההסרה סיסית כימי מושגת עם טיפול Pronase 10-15 דקות. בדרך כלל, ההסרה הקודמת של סיסית נחוצה רק כאשר אישור מראש של mutפנוטיפ או מורפולוגיה נמלה נדרש, או בעת שימוש בשלבים שבו עוברים הם בקעו באופן טבעי מהסיסי שלהם.
- הוספת 900 μl של CO 2 תקשורת עצמאית לצינור המכיל את העוברים.
- הוספה של collagenase הסוג השני 100 μl, ריכוז 3.125 מ"ג / מיליליטר סופי (פתרון collagenase המלאי ב31.25 מ"ג / מיליליטר מדולל ב 1x PBS) להתחיל דיסוציאציה. גם Collagenase IV יכול לשמש לדיסוציאציה.
- סובב עוברים על שייקר מסלולית, וtriturate כל 30 דקות ב RT באמצעות Pipetman P1000 לטחינה הדקה.
הערה 2: לפקח על ניתוק עובר בזהירות; מעל או מתחת לניתוק (בעיקר יותר) הן הסיבות הנפוצות ביותר לכישלון פרוטוקול. פעמים לעיכול משתנות בהתאם לעוצמת טחינה דקה, מספר עוברים לכל צינור, וגיל העוברים. כמו כן, לעתים קרובות פחות (בהשוואה לסוגים פראיים) לעוברים ממוטציות שרירי שלד.
פתק3: זמן עיכול הממוצע לגיל עובר: DPF 1 = 1 שעות, 2 DPF = 1.5 שעות, 3 DPF = 2 שעות, וDPF 4 = 2-2.5 שעה.
- תפסיק עיכול כאשר לא כל עוברים גלויים, עדיין חתיכות מוצקות עדיין גלויות - זה חיוני כדי למנוע overdigestion.
- צנטריפוגה צינורות עם עוברים ניתק ב0.8-2.3 XG במשך 3-5 דקות לתאי גלולה.
- הסר supernatant מתאי pelleted ולשטוף 2x עם CO 2 תקשורת עצמאית.
- הוספת CO הטרי 2 תקשורת עצמאית לresuspend תאים. 1 מיליליטר משמש בדרך כלל לpreps של 10-20 עוברים. הנפח וניתן לשנותם מבוסס על מספר עוברים.
- בעזרת פיפטה P1000, עובר השעיה עובר דרך מסנן 70 מיקרומטר. זה מסייע להסיר פסולת לא רצויה מההכנה.
הערה 4: השעיה עובר יכולה להיות מסוננת בפעם שנייה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת לא רצויה נוסף. מסינון כפול, התאוששות היא approximately 800 μl מנפח התחלתי של 1 מיליליטר.
- להוסיף כ 50-100 μl של ההשעיה myofiber לכל coverslip מצופה פולי-L-ליזין.
הערה 5: ביצוע שלב 2.9 בצלחות פטרי עם Parafilm על הקרקעית, שהוכן קודם לכן. Parafilm שומר ההשעיה myofiber את ההפעלה מcoverslips המצופה. שמור על צלחות פטרי מכוסות כדי למנוע אידוי.
- לאפשר myofibers ליישב כ 1 שעות על coverslips המצופה בטמפרטורת חדר.
הערה 6: myofibers יתחיל להתיישב בתוך 5-10 דקות. עם זאת, עבור קובץ מצורף myofiber טוב, מינימום של 1 שעות (1-2 hr) מומלץ. מאפשר myofibers להסתפק עוד לא יפגע בהכנה. לincubations יותר (כולל בלילה), ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת. עם אנטיביוטיקה וטכניקה סטרילית בדרך כלל יכולות להישמר תרבויות חיות עבור 1-2 ימים.
- מ 'בשידור חיyofibers ניתן לצפות בשלב זה. Myofibers מעוברים 2 DPF ומאוחר יותר יהיה לראות כתאים מפוספסים ומוארכים (איור 1). בשלב זה, myofibers מוכן לניתוח בשידור חי או לimmunolabeling עכשיו.
באור 7: שריר שלד מ1 DPF עוברים אינו צלחת סיבים מוארכים וכברור מפוספסים. במקום זאת, myoballs הגדול גלוי. בנוסף, במהלך לאחר ניתוק שלב pelleting (שלב 2.6), 1 DPF myoballs צריך להיות centrifuged למינימום של 8 דקות בXG 5,000 להשיג גלולה. לניתוח של עוברים בשלב זה, מומלץ להשתמש בקו המהונדס להביע EGFP במיוחד בשרירי שלד 23. זה יאפשר זיהוי של תאים ממקור שריר לעומת מקורות אחרים.
3. הקרינה Immunostaining של myofibers דג הזברה הניתק (זמן: כ יום 1)
3.1. Immunolabeling
- הסר את חלק שלתקשורת מmyofibers דבק coverslip המצופה
- תקן את התאים באמצעות paraformaldehyde 4% או מתנול. לPFA, להסיר ½ נפח התקשורת ולהחליף עם אותה הכמות של PFA. תקן עבור 10 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר נפח כולל, להחליף עם 50-100 μl של PFA, ולתקן עבור נוספת 10 דקות. לקיבעון אלכוהול, מתנול קר כקרח או אצטון יכול להיות מיושם על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או 5 דקות, בהתאמה.
- שטוף myofibers לפחות 3-5x עם 1x PBS או 1x PBS בתוספת Tween .0.1%. ממוצע לשטוף נפח 50-100 μl לכל coverslip.
- הוספת חסימת פתרון לmyofibers (עובד מלאי) ודגירה 20-60 דקות בטמפרטורת חדר. פתרון חסימה משתנות בהתאם לנוגדנים הראשוניים ומשניים. שני הנפוצים ביותר בשימוש במעבדה הם (1) 1x PBS, 2 מ"ג / מיליליטר BSA, 1% בסרום כבשים, 0.25% טריטון סופיים X-100 ו (2) X-100, 2 מ"ג / מיליליטר טריטון 0.2% (0.2 % BSA) ו -5% בסרום כבשים / עז.
- הסר את חסימת פתרון ולהוסיף נוגדנים עיקריים מדוללים או בנעילת פתרון או PBS. דגירה myofibers הלילה בשעה 4 ° C. הקפד גם Parafilm או לעטוף בניילון נצמד את צלחת פטרי המכילה coverslips טעון myofiber מצופה בנוגדן. חתיכות קטנות של מגבת נייר טבולה ניתן להוסיף ליצירת תא humidified.
- הסר את הנוגדן ראשוני מcoverslips ולשטוף coverslips 3-5x למשך 5 דקות עם PBS או פתרון חסימה.
- הוספת נוגדנים משני בריכוז מתאים בדילול מלא ב1x PBS או פתרון חסימה ל1-2 שעות ב RT.
- הסר את הנוגדנים משני ולשטוף myofibers 3-5x בPBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
3.2. coverslips הרכבה
- החל 1-2 טיפות של מגיב antifade לשקופית מיקרוסקופ.
- איסוף בזהירות את coverslip המצופה וimmunolabled באמצעות מלקחיים ומקום (myofibers למטה) coverslip על מגיב antifade בשקופית מיקרוסקופ.
הערה 1: שימו לב לכיוון של גcoverslip oated הוא קריטי.
- הנח 1-2 Kimwipes על משטח מוצק קשה. במהירות להפוך את השקופיות עם coverslips המצופה נח על מגיב antifade ולמקם אותו (coverslip למטה) על Kimwipes.
- החל לחץ אור לפינות של שקופית מיקרוסקופ כדי להסיר antifade העודף וליצור חותם חזק בין השקופיות וcoverslip
- לאפשר לantifade שנותר לו להתייבש במשך 5-10 דקות ב RT, אז myofibers מוכן לתמונה (2A דמויות ו-B) או בחנות ב 4 ° C.
4. סידן הדמיה של תא חי באמצעות GCaMP3
ניתן לבצע ניסויי תא חיים בmyofibers לפני הקיבוע (בעקבות צעד 2.10). הפרוטוקול הבא מתאר הדמיה לחיות בmyofibers להביע 24 GCaMP3, מחוון סידן מקודדים גנטי, המתבטא על ידי האמרגן שרירי שלד הספציפי דג הזברה α-אקטין (pSKM) 23. לחלופין,בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש צבעי מחוון סידן כגון פורע-2.
- הזרק עובר עם pSKM: GCaMP3 לבנות בשלב 1-2 התאים
- ב3 DPF, לאסוף זחלים ולהכין myofibers כמפורט בסעיפים 1 ו -2. לאפשר myofibers לדבוק למינימום של 1 שעה. לטכניקה זו, coverslips מכין במנות 24 גם נדרש.
- מוציא בזהירות את כל תקשורת עודפת, ולהוסיף 300 μl של תקשורת העצמאית הטרי CO 2 ב RT.
- שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. myofibers החיובי GCaMP3 צריך להיות גלוי תחת הקרינה ירוקה.
- הגדר את המצלמה להקלטה, אם תרצה בכך.
- הכן פתרון קפאין 30 מ"מ בCO 2 תקשורת עצמאית. כדי לעורר את התאים, בעדינות פיפטה 300 μl של פתרון קפאין לתוך הבאר בהגדלה. בתוך 5-10 שניות, myofibers החיובי GCaMP צריך להגיב לקפאין עם גידול מהיר בקרינה (איור 3). MyofibERS עשוי גם להתכווץ. ראוי לציין, קפאין גורם לשחרור סידן מחנויות reticulum sarcoplasmic 25. סוכנים אחרים, כגון KCl 26 וryanodine 4, יכולים לשמש כדי לחקור שחרור סידן מתנהלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
immunolabeling ניאון של myofibers (איור 2)
תמונות מראים דפוס ניאון תיוג צפוי מmyofibers immunostained לאחר בידוד וציפוי מוצלחים. Myofibers סומן בתווית עם או קולט אנטי ryanodine (1:100) (איור 2 א) או אנטי-α-actinin (1:100) (איור 2) נוגדנים, ולחשוף immunostaining של השלישייה וZ-להקת בהתאמה. נוגדנים משני השתמשו היו אלקסה פלואוריד 555 (1:500). תמונות שנתפסו באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
שחרור סידן הנגרם מmyofiber (איור 3)
סדרת לוח מראה את שחרור סידן הנציג מmyofiber מבודד שטופלו בקפאין. בקיצור, עוברי דג הזברה הוזרקו בשלב תא אחד עם pSKM: מבנה GCaMP3. ב3 DPF, עוברים היו ניתקו ומצופים כאמור ביחסי הציבורotocol. לצורך הניתוח, myofibers להביע GCaMP3 נבחרו, כפי שצוין על ידי הנוכחות של הקרינה ירוקה בתחילת המחקר. באמצעות micropipette למתן תרופה, הסיבים שנבחרו היו שטוף בפתרון קפאין 30 מ"מ כדי לגרום לשחרור סידן. הקלטת וידאו החלה לפני יישום קפאין והמשיכה עד שהגיעה לשיא הקרינה. נתון זה מדגים שחרור סידן קפאין מושרה נורמלי, ואת הטכניקה יכולה לשמש כדי לחקור את מנגנון צימוד עירור והתכווצות באמצעות הדמיה לחיות.
איור 1. בחירת ציר זמן סכמטי של דיסוציאציה עובר. פנלים רצופים (מלמעלה למטה) להמחיש צעדים בודדים, תזמון, וציוד דרוש לניתוק עובר.) של עוברים לדיסוציאציה. אני בר סולם 500 מיקרומטר. ב ')קוסם של התקנת דיסוציאציה. הם עוברים בתקשורת וcollagenase בעת היותו מסובב עד שניתק מספיק תמונה (שלב פרוטוקול 2) C) של שתי טכניקות ציפוי myofiber;. Coverslips העגול או 24 גם צלחות (פרוטוקול השלבים 1 ו -4, בהתאמה) D) שדה בהיר. תמונה של חיה ניתקה myofibers דג הזברה מצופה על פולי-L ליזין coverslips מצופה. חיצים מציינים myofibers מוארך מ48 דג הזברה hpf. בר סולם 30 מיקרומטר.
איור 2. Immunolabeling של myofibers הבודד מבודד מ48 עוברי דג הזברה hpf.) Myofiber שכותרתו עם קולט אנטי ryanodine (RyR1), חושף דפוס התאגדו לאורך הסיבים בקנה אחד עם לוקליזציה לשלישייה / מנגנון צימוד EC. B) Myofiber שכותרתו עם אנטי α -Actinin, visualizin פסים גרם (אדום) לאורך myofiber הלוקליזציה לsarcomere ומדגיש את להקות Z. בשתי התמונות, גרעינים מסומנים עם DAPI, נתפסו כאליפסות כחולות. מוסיף להראות תמונות בהגדלה גבוהות יותר של myofiber בתמונה הגדולה.) ו-B) סרגל קנה המידה 30 מיקרומטר.
איור 3. נציג מושרה תגובת שחרור סידן מmyofiber דג הזברה בודדת אחד. כל הפנלים להראות myofiber דג הזברה pseudocolored להביע GCaMP3. כמובן הזמן מראה את הגידול של הקרינה GCaMP3 (צבע אדום) בתגובה לבקשה של קפאין 30 מ"מ. ההקלטה התחילה לפני יישום קפאין (0 אלפיות שני) והמשיכה לתגובה מקסימלית הקרינה (992 אלפיות שנייה). בר סולם 30 מיקרומטר.nk "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דג הזברה הוא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח שרירים ובתפקוד ב25,27,28 vivo. גם הם צמחו כנכס בעל ערך לדוגמנות מחלות שריר אנושי 14,15,20,29. אמנם ננקטו צעדים גדולים כדי לקדם את השימוש ויישום של דג הזברה לחקר תפקוד שרירים ומחלות שריר, יש צורך קריטי מתמיד כדי לפתח כלים שיאפשר יותר בניתוח מעמיק שמחמאות הגנטיות, מורפולוגיים, התנהגותיים ותפקודיים דג הזברה יתרונות כבר מציע 17. לכן יש לנו להתאים ופיתחו טכניקה פשוטה וחזקה לאפיון של myofibers דג הזברה מכל עוברים ניתקו.
השימוש בmyofibers האדם הוא דבר שבשגרה בלימודים באמצעות מערכת המודל העכברית. בעכברים זה אפשר לחקירות וניתוחים שאינם מעשיים או בלתי אפשריים בכל בעלי חיים, incluלוקליזציה חלבון subcellular דינג לומדת 30, הדמיה תא חי ביום 31, ומדידות אלקטרו 32. בדג הזברה, טכניקות דיסוציאציה דומות כבר פותחו בעבר לזהות באופן ספציפי ולבחון motorneurons 33 כמו גם עצב סנסורי Rohon-בירד 34, וטכניקות אלה אפשרו ניתוח מפורט של תת נוירון אלה.
תחולתה הרחבה של myofibers המבודד, בשילוב עם יתרונות ייחודיים רבים דג הזברה מציע כמודל חוליות 17, הן מה שהניע אותנו לפתח טכניקה לבידוד ואפיון myofibers דג הזברה עוברית וזחל. יש לנו מנוצלים myofibers המבודד במחקרים קודמים כדי לקבוע לוקליזציה subcellular של חלבוני שריר 20,21, ללמוד לוקליזציה של transgenes הביע אורח פלא ל35 ולהגדיר פרמטרים myofiber ספציפיים כוללים בעיקר גודל
Grabner ועמיתיו השתמשו גם במערכת myofiber להצלחה גדולה 19,22,36. הם הקבוצה היחידה לדווח culturing הממושך של סיבים מבודדים. בנוסף, הם היו יכולים להשתמש בסיבים כדי למדוד את מאפייני אלקטרו של השריר. באופן ספציפי, הם בחנו את ההשפעה של הירידה של למקטע בטא של הקולטן dihydropyridine על שחרור סידן ומדדו את היכולת של קבוצה של transgenes להציל defeCTS במהדורה זו. מחקרים אלה מאירים כמה מהיישומים הפוטנציאליים הרבים העוצמה של myofibers המבודד.
קבוצה נוספת כדי לדווח על שימוש בהכנת myofiber לחקר מחלת שריר היא ניקסון et al. שהשתמש myofibers ללמוד את ההשפעה של morpholino תיווך מציאה caveolin 3 על התפתחות שרירים ומבנה שריר 18. מחברים אלה נבחנים לא רק פרמטרים על ידי מיקרוסקופ אור, אבל גם למדו את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. עבודתם מזהה עוד יתרון של מערכת myofiber המבודדת: היכולת ללמוד ultrastructure של myofiber בסביבה מבודדת ומבוקרת.
מחקרים אלה, יחד עם העבודה, הצבע על הכלי הרחב היקף הפוטנציאלי של טכניקה זו שלנו. יישומים נוספים הם מסוימים להיות מפותחים, כגון מדידת קוצים סידן מהירים תוך שימוש באינדיקטורים כמו פורע-2. בנוסף, תכשיר זה מציע הזדמנות obserיש פעילות חשמלית, כגון פוטנציאל פעולה באמצעות צבעי מתח רגישים (Di-4-ANEPPS) או הקלטת אלקטרו ישירה. נראה ברור שכל הטכניקות הנוכחיות נעשה שימוש בmyofibers עכברי צריכה להיות ישימות myofibers דג הזברה. בנוסף, היכולת לבטא transgenes שונה בדג הזברה מתפתחת, כמו גם את הזמינות של מספר הולך וגדל של דג הזברה מהונדס מבטא חלבוני סמן שונים (www.zfin.org), מוסיפה שכבה נוספת של מורכבות ותחולה מערכת. אנו מדגימים את העובדה הזו עם myofibers התרבית מן דג הזברה להביע GCaMP3, שבו אנו מנצלים את היכולת לבטא GCaMP3 בשריר ללמוד הדמיה סידן נגרמת בזמן אמת בסיבים מבודדים (איור 3).
כמו ברוב הטכניקות, יש גם כמה מגבלות ברורות למערכת myofiber המבודדת. נושאים אלה הם בנוסף לדוכןחסרונות ארד של לימוד מסוג תאים במבחנה שמתפקד כsyncytia שלושה ממדי in vivo ושל ביצוע ניסויי אלקטרו עם גירויי nonphysiologic. שימוש במתודולוגיה שלנו, אחד הוא לא מסוגל להשיג הכנה טהורה של myofibers. זה לא בעיה עבור immunostaining או למדידות אלקטרו, אבל זה ימנע גישות ניסיוניות מסוימות. לדוגמא, יש לנו עדיין כדי לקבוע מתודולוגיה מתאימה לזיהוי אוכלוסייה טהורה של myofibers לניתוח transcriptomic. יש לנו ניסיון FACS מיון של myofibers להביע GFP ואחרי הכנת myofiber, אבל זה לא הביא תרבות טהורה עם מספר מתאים של myofibers או RNA או ניתוח חלבונים.
אתגר נוסף הוא culturing לטווח הארוך של myofibers. אנחנו כבר מסוגלים לשמור על תרבויות כ 24 שעות, וGrabner ועמיתיו מדווח הכנה כי כבר suitable לימים רבים של ניסויים 19. האתגר הקשורים להיבט זה של הטכניקה הוא מניעת זיהום, כפי שתרבויות אלה (כמו preps myofiber העכברי) הן לעתים קרובות קשות כדי לשמור על סטרילי. יש צורך בזהירות רבה אם אחד הוא לנסות תרבויות ממושכות. כמו כן, אנו ממליצים על השימוש בantimicrobials כולל antifungals.
בסך הכל, אנחנו מדגימים את שיטה מעשית לבידודה של myofibers דג הזברה, כמו גם קווי המתאר כיצד לבצע immunolabeling ניאון והדמיה סידן בזמן אמת על הכנות סיבים המבודדות. שינוי ופיתוח מתמשכים של טכניקה זו יציע רפרטואר המתרחב של כלים להתנסות בסוגים ספציפיים, מבודדים תא בדג זברה. על ידי מתנער עוברי דג הזברה לmyofibers פרט בודד, אנחנו יכולים לשפר עוד יותר את ההבנה של פיתוח שרירים, תפקוד ומחלות שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברים במעבדה דאולינג (אהרון Reifler, טרנט וו, אנג'לה באסטה, וויליאם טלפר) שתרמו לפיתוח של הטכניקה ולייצור של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מכון טאובמן, המחלקה לרפואת הילדים באוניברסיטת מישיגן, ובחלק ממענקים מניוון השרירים האגודה (JJD MDA186999) והמכונים הלאומיים לבריאות (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
