Summary
Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.
Abstract
Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema valido modello per esplorare la funzione del muscolo scheletrico e per lo studio delle malattie muscolari umane. Nonostante i numerosi vantaggi offerti da analisi in vivo del muscolo scheletrico nel zebrafish, visualizzando l'ambiente proteina complesso e finemente strutturato responsabile per la funzione muscolare, soprattutto in embrioni interi, può essere problematico. Questo ostacolo deriva dalla piccola dimensione del muscolo scheletrico zebrafish (60 micron) e le dimensioni ancora più piccolo del sarcomero. Qui descriviamo e dimostrare un metodo semplice e rapido per isolare miofibre scheletriche da embrioni di zebrafish e larve. Abbiamo anche i protocolli che illustrano le tecniche di preparazione post utili per analizzare la struttura e la funzione muscolare. In particolare, abbiamo dettaglio la successiva localizzazione immunocitochimica delle proteine dei muscoli scheletrici e l'analisi qualitativa del rilascio del calcio stimolato via live Calcio Imaging cellulare. Nel complesso, questo videoarticolo fornisce un metodo straight-forward ed efficace per l'isolamento e la caratterizzazione di miofibre scheletriche zebrafish, una tecnica che prevede un condotto per la miriade di successivi studi di struttura e funzione muscolare.
Introduction
Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente specializzato responsabile della generazione delle forze necessarie motilità contrattili. La contrazione è iniziata attraverso un processo noto come eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento che converte i segnali elettrici di rilascio di calcio dai depositi intracellulari 1,2. Rilascio di calcio intracellulare attiva il sarcomero di accorciare e generare forza. I numerosi componenti specifici della macchina molecolare responsabile mediare la trasmissione neuromuscolare svincolo 3, accoppiamento EC 4,5, e actina-miosina contrazioni dipendenti 6 continuano ad essere oggetto continuo di intensa ricerca. Inoltre, le proteine che stabilizzano la membrana del muscolo durante la contrazione 7,8 e che mediano la segnalazione tra il myofiber e la matrice extracellulare 7,9 sono stati identificati e studiati nei minimi dettagli.
Mutazioni in un certo numero di geni importanti per una struttura muscolarefunzione nd sono stati identificati come causa di malattie del muscolo scheletrici umani ( http://www.musclegenetable.org/ ). Queste malattie, classificati in linea di massima come miopatie scheletriche e distrofie muscolari basati su caratteristiche cliniche e istopatologiche, sono associati a debolezza muscolare, invalidità permanente e 10,11 mortalità precoce. Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema eccezionale per la modellazione e lo studio delle malattie del muscolo scheletrici umani 8,12,13. E 'stato impiegato per validare nuove mutazioni del gene 8, definire nuovi aspetti della malattia fisiopatologia 14,15, e identificare nuovi approcci terapeutici 15,16. La potenza della zebrafish per studio delle malattie muscolo umano riferisce al maggior numero di figli, il rapido sviluppo della struttura muscolare e funzione, la chiarezza ottica dell'embrione zebrafish, e la facilità di manipolazione genetica e farmacologica della zebra sviluppopesce 17.
Noi e altri 12,18,19 recentemente sviluppato una tecnica semplice per l'isolamento rapido ed efficiente miofibre dal zebrafish sviluppo. Questo metodo ha permesso l'esame di miofibre in maggior dettaglio che può essere fornita da intera analisi embrione. La tecnica è stata sfruttata per la caratterizzazione della proteina localizzazione subcellulare 20 nonché per l'identificazione di importanti caratteristiche istopatologiche come parte di studi di validazione in modelli di malattia di nuova concezione 21. Inoltre, miofibre isolate possono inoltre essere utilizzati per l'imaging dal vivo e per gli studi elettrofisiologici 22, tecniche che consentono l'interrogatorio di aspetti fondamentali della funzione muscolare. Il protocollo specifico per l'isolamento miofibre, insieme a due esempi di esperimenti successivi analitiche, è dettagliata nelle parti rimanenti di questo manoscritto.
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Protocol
1. Preparazione del Poli-L-lisina Rivestito Coprivetrini (Tempo: 1 ora)
Lamelle di rivestimento consente una rapida decantazione myofiber e l'adesione. Ciò può essere eseguita durante la fase di dissociazione dell'isolamento miofibre (passo 2).
- Tagliare e posizionare Parafilm sul fondo di un piatto 60 millimetri Petri (di qualsiasi marca).
- Posizionare scivola vetro di copertura microscopio (diametro 12 mm) su parafilm in un piatto di coltura tissutale a 60 mm o posizionare singolarmente in singoli pozzetti di piastre da 24 pozzetti.
Nota 1: Questi piccoli coprioggetto rotondi aiutano a concentrarsi myofiber numeri e ridurre l'utilizzo di anticorpi in eccesso.
Nota 2: Altri vetrini di dimensioni lavoreranno, tuttavia, i volumi di reagenti e di embrioni utilizzati dovranno essere adeguati di conseguenza.
- Pipettare 50-200 microlitri di soluzione di poli-L-lisina (0,01%) su ciascun vetrino coprioggetto nella capsula di Petri.
- Lasciare i coprioggetti di sedersi almeno una hour a 37 ° C. Incubazione più lungo non influenzeranno negativamente i risultati.
- Rimuovere poli-L-lisina soluzione dal vetro di copertura e lavare due volte con un minimo di 100 microlitri di PBS 1x.
- Lasciare coprioggetto asciugare.
- Coprivetrini sono ora pronti per miofibre.
Nota 3: Al fine di garantire la sterilità, il rivestimento può essere fatto in un cappuccio e su vetrini in autoclave.
Nota 4: Mantenere il piatto 60 millimetri Petri con Parafilm sul fondo. Questa configurazione verrà utilizzato durante myofiber placcatura e immunomarcatura (fasi successive).
Alternativa 1: invece di lamelle di rivestimento immediatamente prima dell'uso, un vetrino rivestito magazzino può essere utilizzato. Un piatto 60 millimetri Petri contenente un minimo di 2 ml di poli-L-lisina può essere conservato a 4 ° C con numerosi coprioggetto. Con questa alternativa iniziare dal punto 1.5 per elaborare le lamelle per miofibre.
Alternativa 2: Abbiamo anche coprioggetto cappotto in poli-L-ornitina. Til suo è più alta intensità di manodopera, ma è utile per la coltura a lungo termine perché vetrini rivestiti di poli-L-ornitina può essere trattato UV. Con il trattamento UV e attenta tecnica sterile myofibers vivi in genere può essere mantenute in coltura 4-7 giorni.
2. Dissociazione di embrioni di zebrafish e placcatura di miofibre (Tempo: da 1 a 3 ore)
Nota: il protocollo norma si applica meglio al 3 dpf (giorni dopo la fecondazione) gli embrioni.
- Trasferire embrioni di zebrafish in un 1,5 ml provetta standard ed eliminare quanta più acqua i pesci in eccesso il più possibile. Tipicamente, possono essere utilizzati 10-20 embrioni per provetta, anche se meno. Utilizzando più di 20-25 embrioni traduce spesso in una preparazione di densità eccessiva.
- Rimuovere chorions prima di dissociazione, manualmente utilizzando # 5 pinze. In alternativa, la rimozione corion chimica si ottiene con 10-15 minuti di trattamento Pronase. Tipicamente, la rimozione precedente del corion è necessaria solo quando prima conferma di un mutè necessario fenotipo formica o morfologia, o quando si utilizza fasi in cui gli embrioni sono naturalmente tratteggiata da loro corion.
- Aggiungere 900 ml di CO 2 media indipendenti per il tubo contenente gli embrioni.
- Aggiungere 100 ml di collagenasi di tipo II, finali concentrazione 3,125 mg / ml (soluzione della collagenasi a 31,25 mg / ml diluito in 1x PBS) per iniziare dissociazione. Collagenasi IV può essere utilizzato anche per la dissociazione.
- Ruotare embrioni in un agitatore orbitale, e triturare ogni 30 min a temperatura ambiente usando una P1000 Pipetman per la triturazione.
Nota 2: monitorare attentamente embrione dissociazione, sopra o sotto di dissociazione (soprattutto over) sono le ragioni più comuni per il fallimento del protocollo. I tempi per la digestione variano a seconda dell'intensità di triturazione, il numero di embrioni per provetta, e l'età degli embrioni. E 'anche spesso meno (rispetto ai tipi selvatici) per embrioni da mutanti muscolari scheletriche.
Appunto3: tempo medio di digestione per età dell'embrione: 1 dpf = 1 ora, 2 dpf = 1,5 ore, 3 dpf = 2 ore e 4 dpf = 2-2,5 ore.
- Smettere di digestione quando non interi embrioni sono visibili, ma pezzi solidi sono ancora visibili - questo è essenziale per prevenire overdigestion.
- Provette da centrifuga con embrioni dissociate a 0,8-2,3 g per 3-5 minuti per le cellule pellet.
- Rimuovere il surnatante dalle cellule pellet e lavare 2x con CO 2 media indipendenti.
- Aggiungere CO fresco 2 media indipendenti per risospendere le cellule. 1 ml è tipicamente utilizzata per preparazioni di 10-20 embrioni. Il volume può essere scalata basata sul numero embrione.
- Usando una pipetta P1000, passare sospensione embrione attraverso un filtro da 70 micron. Questo aiuta a rimuovere i residui indesiderati dalla preparazione.
Nota 4: sospensione embrione può essere filtrato una seconda volta attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere ulteriori residui indesiderati. Da una doppia filtrazione, il recupero è approximdiatamente 800 microlitri da un volume iniziale di 1 ml.
- Aggiungere circa 50-100 microlitri di sospensione miofibre ad ogni coprioggetto rivestiti con poli-L-lisina.
Nota 5: Eseguire il passaggio 2.9 in piastre di Petri con Parafilm sul fondo, precedentemente preparato. Il Parafilm mantiene la sospensione myofiber di scappare coprioggetto rivestiti. Tenere piastre di Petri coperti per evitare l'evaporazione.
- Consentire myofibers di stabilirsi a circa 1 ora sui vetrini rivestiti a temperatura ambiente.
Nota 6: myofibers inizieranno a comporre entro 5-10 min. Tuttavia, per buon attacco myofiber, si raccomanda un minimo di 1 ora (1-2 ore). Permettere myofibers di stabilirsi a lungo non danneggia la prep. Per incubazioni più lunghi (notti comprese), antibiotici possono essere aggiunti ai media. Con antibiotici e tecnica sterile fermenti vivi in genere può essere mantenuta per 1-2 giorni.
- Live myofibers può osservare a questo punto. Miofibre da embrioni 2 dpf e successivamente sarà visto come cellule striate e allungate (Figura 1). A questo punto, miofibre sono ora pronti per l'analisi diretta o per immunomarcatura.
Nota 7: muscolo scheletrico dal 1 dpf embrioni non piastra fibre come allungate e chiaramente striati. Invece, grandi myoballs sono visibili. Inoltre, durante la fase di post dissociazione pellet (punto 2.6), 1 dpf myoballs devono essere centrifugati per un minimo di 8 min a 5000 xg per ottenere un pellet. Per l'analisi degli embrioni in questa fase, si consiglia di utilizzare la linea transgenica che esprime EGFP specificamente nel muscolo scheletrico 23. Ciò consentirà identificazione di cellule di origine muscolare contro altre fonti.
3. Fluorescenza Immunostaining di dissociati Zebrafish miofibre (Durata: circa 1 giorno)
3.1. Immunomarcatura
- Rimuovere una porzione disupporti da myofibers aderito al vetrino rivestito
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% o metanolo. Per PFA, rimuovere ½ il volume del supporto e sostituire con la stessa quantità di PFA. Fix per 10 min a RT, quindi rimuovere volume totale, sostituirlo con 50-100 ml di PFA, e fissare per altri 10 min. Per la fissazione alcool, ghiaccio metanolo freddo o acetone può essere applicato a 4 ° C per 10 min o 5 min, rispettivamente.
- Lavare myofibers almeno 3-5x con PBS 1x o 1x PBS più 0,1% di Tween. Il volume medio di lavaggio è 50-100 microlitri per coprioggetto.
- Aggiungere soluzione bloccante a myofibers (Stock di lavoro) e incubare 20-60 minuti a temperatura ambiente. Soluzione bloccante varierà a seconda delle condizioni anticorpi primari e secondari. I due più comuni utilizzate in laboratorio sono (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, siero di pecora 1%, 0,25% Triton X-100 e finale (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) e siero di pecora / capra 5%.
- Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere anticorpo primario diluito in due bsoluzione o PBS bloccaggio. Incubare myofibers notte a 4 ° C. Assicurati di entrambi Parafilm o avvolgere nella pellicola trasparente scatola di Petri contenente i coprioggetti myofiber-caricato rivestite con anticorpi. Piccoli pezzi di carta assorbente inumidito possono essere aggiunti per creare una camera umidificata.
- Rimuovere l'anticorpo primario da coprioggetto e lavare coprioggetto 3-5x per 5 minuti con PBS o la soluzione di blocco.
- Aggiungi anticorpo secondario a concentrazione adeguata diluito in 1x PBS o soluzione di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere anticorpo secondario e lavare myofibers 3-5x in PBS per 5 minuti ciascuno a RT.
3.2. Lamelle di montaggio
- Applicare 1-2 gocce di reagente antifade ad un vetrino da microscopio.
- Pick-up con attenzione il vetrino rivestito e immunolabled con pinze e luogo (myofibers giù) il vetrino sul reagente antifade sul vetrino del microscopio.
Nota 1: L'attenzione per l'orientamento del cvetrino oated è critica.
- Lay 1-2 Kimwipes su una superficie solida dura. Invertire rapidamente la slitta con i vetrini rivestiti riposo sul reagente antifade e posizionarlo (coprioggetto in diminuzione) in Kimwipes.
- Applicare una leggera pressione agli angoli del vetrino da microscopio per rimuovere l'eccesso antifade e formare una perfetta tenuta tra il vetrino e coprioggetto
- Consentire la antifade restante asciugare per 5-10 minuti a temperatura ambiente, poi le miofibre sono pronti ad immagine (Figure 2A e B) o conservare a 4 ° C.
4. Cellulare dal vivo Imaging di calcio Utilizzo GCaMP3
Esperimenti sulle cellule in diretta possono essere eseguite su myofibers prima fissaggio (seguito passo 2.10). Il protocollo che segue descrive l'imaging dal vivo in miofibre esprimono GCaMP3 24, un indicatore di calcio geneticamente codificato, espressa dal muscolo scheletrico specifico zebrafish α-actina promotore (pSKM) 23. Alternativamente,questa tecnica può essere facilmente adattato per usare pigmenti indicatori del calcio, come Fura-2.
- Iniettare embrioni con pSKM: GCaMP3 costruire nella fase di 1-2 cellule
- A 3 dpf, raccogliere le larve e preparare myofibers come descritto nelle sezioni 1 e 2. Consentire myofibers di aderire per un minimo di 1 ora. Per questa tecnica, vetrini preparano in piatti da 24 pozzetti è necessaria.
- Rimuovere con cura i supporti in eccesso, e aggiungere 300 ml di fresca CO 2 media indipendenti a RT.
- Osservare le cellule sotto un microscopio invertito. GCaMP3 myofibers positivi devono essere visibili sotto fluorescenza verde.
- Installazione della fotocamera per la registrazione, se lo si desidera.
- Preparare una soluzione di caffeina 30 mm di CO 2 media indipendenti. Per stimolare le cellule, pipettare delicatamente 300 ml di soluzione di caffeina nel pozzo sotto ingrandimento. Da 5-10 sec, GCaMP miofibre positivi dovrebbero rispondere agli caffeina con un rapido aumento della fluorescenza (Figura 3). MyofibERS può anche contrarre. Da segnalare, la caffeina induce rilascio di calcio dai depositi del reticolo sarcoplasmatico 25. Altri agenti, come ad esempio KCl 26 e ryanodine 4, possono essere utilizzati per studiare il rilascio di calcio inducibile.
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Representative Results
Immunomarcatura fluorescente di miofibre (Figura 2)
Immagini che mostrano atteso modello di marcatura fluorescente da myofibers immunostained dopo l'isolamento di successo e placcatura. Le miofibre sono stati etichettati sia con anti-recettore ryanodine (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticorpi, e rivelare rispettivamente immunocolorazione della triade e la Z-band. Anticorpi secondari utilizzati erano Alexa Fluor 555 (1:500). Immagini catturate usando la microscopia confocale.
Rilascio di calcio indotto da un myofiber (Figura 3)
Serie di pannelli che mostra il rilascio rappresentante del calcio da un myofiber isolato trattato con caffeina. In breve, embrioni di zebrafish sono stati iniettati in fase di una cella con il pSKM: GCaMP3 costrutto. A 3 dpf, gli embrioni sono stati dissociati e placcati come descritto nel protocol. Per l'analisi, sono stati selezionati GCaMP3 miofibre esprimono, come indicato dalla presenza di fluorescenza verde al basale. Usando una micropipetta per la somministrazione del farmaco, la fibra selezionata è stata immersa in una soluzione di caffeina 30 mM per indurre il rilascio di calcio. La registrazione video è stato avviato prima dell'applicazione caffeina e continuò fino al raggiungimento picco di fluorescenza. La figura dimostra normale caffeina indotta rilascio del calcio, e la tecnica può essere usata per interrogare l'apparato accoppiamento eccitazione-contrazione tramite imaging dal vivo.
Figura 1. Timeline Schema di embrioni dissociazione. Pannelli successivi (dall'alto in basso) illustrare le singole fasi, i tempi, e le attrezzature necessarie per dell'embrione dissociazione. A) La selezione di embrioni per dissociazione. Barra della scala di 500 micron. B) Imago della messa a punto dissociazione. Gli embrioni sono in media e collagenasi mentre viene ruotato fino sufficientemente dissociato (step protocollo 2) C) Immagine di entrambe le tecniche di placcatura myofiber;. Vetrini tondi o piastre da 24 pozzetti (Protocollo punti 1 e 4, rispettivamente) D) Un brillante campo. immagine di vivere dissociato myofibers zebrafish placcato in poli-L vetrini rivestiti Lisina. Le frecce indicano myofibers allungati da 48 HPF zebrafish. Scale bar 30 micron.
Figura 2. Immunomarcatura delle singole miofibre isolate da embrioni di 48 HPF zebrafish. A) myofiber marcato con anti-recettore rianodina (RyR1), rivelando un pattern a bande lungo la fibra coerenti con la localizzazione alla triade / apparato accoppiamento EC. B) myofiber marcato con anti-α -actinina, visualizin g striature (rosso) lungo la myofiber localizzazione di sarcomero e mettendo in evidenza le bande Z. In entrambe le immagini, i nuclei sono etichettati con DAPI, visti come ovali blu. Inserti mostrano immagini di ingrandimento più elevati della myofiber nella grande immagine. A) e B) barra della scala 30 micron.
Figura 3. Rappresentante indotto calcio risposta liberazione da un singolo isolato myofiber zebrafish. Tutti i pannelli mostrano una myofiber zebrafish pseudocolored esprimere GCaMP3. L'andamento temporale mostra l'aumento di GCaMP3 fluorescenza (colore rosso) in risposta alla domanda di caffeina 30 mM. Registrazione iniziato prima dell'applicazione caffeina (0 msec) e ha continuato a risposta fluorescenza massima (992 msec). Scale bar 30 micron.nk «> Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Zebrafish sono un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo muscolare e la funzione in vivo 25,27,28. Essi hanno anche emerso come un bene prezioso per la modellazione di malattie muscolari umane 14,15,20,29. Mentre i grandi passi avanti sono stati compiuti per promuovere l'uso e l'applicazione di zebrafish per lo studio della funzione muscolare e delle malattie del muscolo, vi è una necessità critica costante per sviluppare strumenti che consentano più approfondita analisi che complimenta la genetica, morfologica, comportamentale e funzionale vantaggi zebrafish offrono già 17. Abbiamo quindi adattato e sviluppato una tecnica semplice e affidabile per la caratterizzazione delle miofibre zebrafish da embrioni interi dissociate.
L'uso di singole miofibre è comune negli studi che utilizzano il sistema modello murino. Nei topi questo ha permesso per le indagini e le analisi che sono impraticabili o impossibile in animali interi, inclusioneding localizzazione subcellulare di proteine studia 30, imaging cellulare dal vivo il 31, e le misurazioni elettrofisiologiche 32. In zebrafish, le tecniche di dissociazione simili sono stati precedentemente sviluppato per identificare specificamente ed esaminare motoneuroni 33 così come ROHON-Beard neuroni sensoriali 34, e queste tecniche hanno permesso un'analisi dettagliata di questi sottotipi neuronali.
L'ampia applicabilità di miofibre isolate, in combinazione con i molti vantaggi unici zebrafish propone come un modello vertebrato 17, sono ciò che motivati di sviluppare una tecnica per isolare e caratterizzare myofibers zebrafish embrionali e larvali. Abbiamo utilizzato miofibre isolate in precedenti studi per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine muscolari 20,21, per studiare la localizzazione dei transgeni chimerically espressi 35 e per definire i parametri specifici myofiber tra cui in particolare le dimensioni
Grabner e colleghi hanno usato anche il sistema myofiber grande successo 19,22,36. Sono l'unico gruppo a riferire coltura prolungata di fibre isolate. Inoltre, sono stati in grado di utilizzare le fibre per misurare le proprietà elettrofisiologiche del muscolo. In particolare, essi hanno testato gli effetti della perdita della subunità beta del recettore diidropiridinico sul rilascio del calcio e misurata la capacità di un insieme di transgeni per salvare fécts in questa versione. Questi studi illuminano alcuni dei potenziali molto potenti applicazioni di miofibre isolate.
Un altro gruppo per segnalare l'uso del prep myofiber per studiare le malattie muscolo è Nixon et al. Che ha usato myofibers per studiare l'impatto di morfolino mediata caveolina 3 atterramento sullo sviluppo muscolare e la struttura muscolare 18. Questi autori hanno esaminato non solo i parametri al microscopio ottico, ma anche studiato le fibre mediante microscopia elettronica. Il loro lavoro individua ancora un altro vantaggio del sistema miofibre isolate: la capacità di studiare l'ultrastruttura della miofibre in un ambiente isolato e controllato.
Questi studi, insieme con il nostro lavoro, il punto al potenziale ampia utilità di questa tecnica. Ulteriori applicazioni sono certi di essere sviluppati, come la misurazione picchi di calcio rapidi utilizzando indicatori come il Fura-2. Inoltre, questa preparazione offre la possibilità di osserve attività elettrica, come potenziali d'azione tramite coloranti tensione sensibili (Di-4-ANEPPS) o la registrazione elettrofisiologica diretta. Sembra chiaro che tutte le tecniche attualmente utilizzate sul myofibers murini dovrebbero essere applicabili a myofibers zebrafish. Inoltre, la capacità di esprimere diversi transgeni in zebrafish sviluppo, così come la disponibilità di un grande e crescente numero di zebrafish transgenici che esprimono varie proteine marker ( www.zfin.org ), aggiunge un ulteriore livello di complessità e applicabilità al sistema. Dimostriamo questo fatto con le fibre muscolari coltivate da GCaMP3 zebrafish esprime, dove approfittiamo della capacità di esprimere GCaMP3 nel muscolo per studiare l'imaging di calcio indotto in tempo reale in fibre isolate (Figura 3).
Come con la maggior parte delle tecniche, ci sono anche alcuni evidenti limitazioni al sistema miofibre isolate. Questi problemi sono in aggiunta al supportocarenze ARD di studiare un tipo di cellula in vitro che funziona come un sincizi tridimensionale in vivo e di eseguire esperimenti elettrofisiologici con stimoli non fisiologici. Utilizzando la nostra metodologia, non si è in grado di ottenere una preparazione pura di miofibre. Questo non è un problema per immunocolorazione o per misure elettrofisiologiche, ma non preclude alcuni approcci sperimentali. Ad esempio, dobbiamo ancora stabilire una metodologia adeguata per identificare una popolazione pura di miofibre per l'analisi trascrittomica. Abbiamo tentato FACS cernita di GFP myofibers esprimono seguita da preparazione myofiber, ma questo non ha portato a una coltura pura con un numero adeguato di miofibre di RNA o analisi delle proteine.
Un'altra sfida è la coltura a lungo termine di miofibre. Siamo stati in grado di mantenere le culture per circa 24 ore, e Grabner e colleghi segnalare una preparazione che è stata SuitaBLE per più giorni di sperimentazione 19. La sfida relative a questo aspetto della tecnica impedisce la contaminazione, come queste culture (molto simile Preps miofibre murini) sono spesso difficili da mantenere sterile. Grande cura è necessaria se si vuole tentare culture prolungati. Si consiglia anche l'uso di antimicrobici compresi antimicotici.
In tutto, si dimostra un metodo pratico per l'isolamento di miofibre zebrafish nonché contorno come eseguire immunomarcatura fluorescente e calcium imaging in tempo reale sui preparativi fibre isolate. Continuando la modifica e lo sviluppo di questa tecnica offrirà un repertorio in continua espansione di strumenti per sperimentare su specifici tipi di cellule isolate in zebrafish. Dissociandosi embrioni di zebrafish in isolate singole fibre muscolari, siamo in grado di rafforzare ulteriormente la nostra comprensione dello sviluppo muscolare, la funzione e la malattia.
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Disclosures
Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer), che hanno contribuito allo sviluppo della tecnica e alla produzione del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Taubman, il Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Michigan, e in parte da sovvenzioni dal Distrofia Muscolare (JJD MDA186999) e il National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
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