Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.
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Articolo metodologico
Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema valido modello per esplorare la funzione del muscolo scheletrico e per lo studio delle malattie muscolari umane. Nonostante i numerosi vantaggi offerti da analisi in vivo del muscolo scheletrico nel zebrafish, visualizzando l'ambiente proteina complesso e finemente strutturato responsabile per la funzione muscolare, soprattutto in embrioni interi, può essere problematico. Questo ostacolo deriva dalla piccola dimensione del muscolo scheletrico zebrafish (60 micron) e le dimensioni ancora più piccolo del sarcomero. Qui descriviamo e dimostrare un metodo semplice e rapido per isolare miofibre scheletriche da embrioni di zebrafish e larve. Abbiamo anche i protocolli che illustrano le tecniche di preparazione post utili per analizzare la struttura e la funzione muscolare. In particolare, abbiamo dettaglio la successiva localizzazione immunocitochimica delle proteine dei muscoli scheletrici e l'analisi qualitativa del rilascio del calcio stimolato via live Calcio Imaging cellulare. Nel complesso, questo videoarticolo fornisce un metodo straight-forward ed efficace per l'isolamento e la caratterizzazione di miofibre scheletriche zebrafish, una tecnica che prevede un condotto per la miriade di successivi studi di struttura e funzione muscolare.
Introduzione
Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente specializzato responsabile della generazione delle forze necessarie motilità contrattili. La contrazione è iniziata attraverso un processo noto come eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento che converte i segnali elettrici di rilascio di calcio dai depositi intracellulari 1,2. Rilascio di calcio intracellulare attiva il sarcomero di accorciare e generare forza. I numerosi componenti specifici della macchina molecolare responsabile mediare la trasmissione neuromuscolare svincolo 3, accoppiamento EC 4,5, e actina-miosina contrazioni dipendenti 6 continuano ad essere oggetto c....
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Protocollo
1. Preparazione del Poli-L-lisina Rivestito Coprivetrini (Tempo: 1 ora)
Lamelle di rivestimento consente una rapida decantazione myofiber e l'adesione. Ciò può essere eseguita durante la fase di dissociazione dell'isolamento miofibre (passo 2).
- Tagliare e posizionare Parafilm sul fondo di un piatto 60 millimetri Petri (di qualsiasi marca).
- Posizionare scivola vetro di copertura microscopio (diametro 12 mm) su parafilm in un piatto di coltura tissutale a 60 mm o posizionare singolarmente in singoli pozzetti di piastre da 24 pozzetti.
Nota 1: Questi piccoli coprioggetto rotondi....
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Risultati
Immunomarcatura fluorescente di miofibre (Figura 2)
Immagini che mostrano atteso modello di marcatura fluorescente da myofibers immunostained dopo l'isolamento di successo e placcatura. Le miofibre sono stati etichettati sia con anti-recettore ryanodine (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticorpi, e rivelare rispettivamente immunocolorazione della triade e la Z-band. Anticorpi secondari utilizzati erano A.......
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Discussione
Zebrafish sono un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo muscolare e la funzione in vivo 25,27,28. Essi hanno anche emerso come un bene prezioso per la modellazione di malattie muscolari umane 14,15,20,29. Mentre i grandi passi avanti sono stati compiuti per promuovere l'uso e l'applicazione di zebrafish per lo studio della funzione muscolare e delle malattie del muscolo, vi è una necessità critica costante per sviluppare strumenti che consentano più approfondi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer), che hanno contribuito allo sviluppo della tecnica e alla produzione del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Taubman, il Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Michigan, e in parte da sovvenzioni dal Distrofia Muscolare (JJD MDA186999) e il National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di coltura a 24 pozzetti | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Terreno indipendente | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenasi di tipo II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenasi di tipo IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| Microscopia elettronica | % Paraformaldeide | 157-8 | |
| Metanolo | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Siero di pecora | Sigma | S3772 | |
| Siero di capra | Sigma | G9023 | |
| Vetrini coprioggetti | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P4707 | |
| Pronasi | Sigma | P5147 | |
| 40 μ m Filtro | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μ m Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Reagente antidissolvenza Prolong Gold | Invitrogen | P36931 | |
| Anticorpo anti-alfa;-actinina | Sigma | A5044 | |
| Anticorpo anti-RYR | Abcam | 34C | |
| Alexa Anticorpo Fluor | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| Piastra di Petri da 60 mm | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poli-L-Ornitina | Sigma | P4957 | |
| Vetrino per microscopio | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeina | Sigma | C0750 |
Riferimenti
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
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Ristampe e permessi
