해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석
Summary
제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.
Abstract
제브라 피쉬는 골격 근육의 기능을 탐험과 인간의 근육 질환 연구를위한 귀중한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 특히 전체 배아, 근육 기능을 책임 복잡한 미세 구조화 단백질 환경을 시각화, 제브라 피쉬에서 골격근의 생체 내 분석에 의해 제공되는 많은 장점에도 불구하고, 문제가 될 수있다. 이 장애는 제브라 피쉬의 골격 근육 (60 μM) 및 근절의 더 작은 크기의 작은 크기에서 유래한다. 여기에 우리가 설명하고 제브라 피쉬 배아 및 유충에서 골격 근섬유를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 근육의 구조와 기능 분석을위한 유용한 게시물에 준비 기술을 설명 프로토콜 (가) 있습니다. 특히, 우리는 세부 골격 근육 단백질의 후속 면역 세포 화학 현지화 및 라이브 세포 칼슘 이미징을 통해 자극 칼슘 방출의 정성 분석. 전반적으로,이 영상기사는 제브라 피쉬의 골격 근섬유의 분리 및 특성, 근육의 구조와 기능의 수많은 후속 연구를위한 도관을 제공하는 기술에 대한 똑 바른 앞으로하고 효율적인 방법을 제공한다.
Introduction
골격근은 운동성 필요한 수축력 생성을 담당 고도로 전문화 된 조직이다. 수축은 세포 내 저장 1,2에서 칼슘 방출을 전기 신호로 변환 여기 수축 (EC) 커플 링으로 알려진 과정을 통해 시작됩니다. 세포 내 칼슘 릴리스는 힘을 단축하고 생성 할 수 근절을 활성화합니다. 신경 근육 접합부 전송 3, EC 커플 링 4,5, 그리고 말라 – 마이 오신 따라 수축 6 중재를 담당하는 분자 기계의 많은 특정 구성 요소는 강렬한 연구의 지속적인 대상이 될 것을 계속한다. 또한, 수축 7,8과 근섬유와 세포 외 기질 (extracellular matrix) 7,9 사이의 시그널링 중간체 동안 근육 세포막을 안정화 단백질은 확인 된 훌륭한 세부 사항에서 공부했다.
근육 구조에 중요한 유전자의 개수의 돌연변이차 기능 (인간의 골격 근육 질환의 원인으로 확인 된 http://www.musclegenetable.org/ ). 임상 및 병리 조직 학적 특징에 따라 골격 근육 병증 및 근육 이영양증으로 크게 분류 이러한 질환, 근육 약화, 평생 장애, 조기 사망의 10, 11과 연결되어 있습니다. 제브라 피쉬는 사람의 골격 근육 질환 8,12,13 모델링과 공부를위한 뛰어난 시스템으로 입증되었습니다. 그것은, 새로운 유전자 변이 8 확인 질병 병태 생리 (14, 15)의 새로운 측면을 정의하고, 새로운 치료 방법 (15, 16)를 식별하기 위해 사용되어왔다. 인간의 근육 질환 연구를위한 제브라 피쉬의 힘은 자손, 근육의 구조와 기능, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도 및 개발 얼룩말의 유전 적 및 약리학 적 조작의 용이성의 급속한 발전의 큰 숫자에 관한물고기 17.
우리와 다른 12,18,19 최근 개발 제브라 피쉬에서 근섬유의 신속하고 효율적인 분리를위한 간단한 기술을 개발했습니다. 이 방법론은 전체 배아 분석에 의해 제공 될 수있는 것보다 더 상세히 근섬유의 시험을 가능하게했다. 이 기술은 새로 개발 된 질병 모델 21의 검증 연구의 일환으로 중요한 병리 조직 학적 특성의 식별을위한 단백질의 세포 내 현지화 (20) 등의 특성에 악용하고있다. 또한, 고립 된 근섬유가 추가 라이브 이미징 및 전기 생리학 연구 22, 근육 기능의 주요 측면의 심문을 허용 기술을 사용할 수 있습니다. 이후의 분석 실험의 두 가지 예와 함께 근섬유 격리를위한 특정 프로토콜은이 원고의 나머지 부분에 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬는 생체 내 25,27,28의 근육 발달과 기능 연구를위한 강력한 척추 동물 모델 시스템이다. 그들은 또한 인간의 근육 질환 14,15,20,29 모델링을위한 귀중한 자산으로 등장했습니다. 커다란 진보가 근육 기능과 근육 질환의 연구를위한 제브라 피쉬의 사용과 응용 프로그램을 사전에 촬영되었지만, 행동과 기능적인 유전, 형태 학적를, 칭찬보다 심층적 인 분석을 할…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술의 개발 및 원고의 생산에 기여 다울 링 실험실의 구성원 (아론 Reifler, 트렌트 워, 안젤라 부스타, 윌리엄 Telfer)을 감사드립니다. 이 작품은 터 브먼 연구소, 미시간 대학에서 소아과와 근육질 영양 장애 협회 (JJD MDA186999)과 국립 보건원 (JJD 1K08AR054835)에서 교부금에서 일부에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
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