El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.
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Artículo de método
Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra ha demostrado ser un sistema modelo valioso para la exploración de la función del músculo esquelético y para el estudio de enfermedades musculares humanas. A pesar de las muchas ventajas que ofrece el análisis in vivo de los músculos esqueléticos en el pez cebra, visualizando el complejo y finamente estructurada entorno proteína responsable de la función muscular, especialmente en los embriones en su conjunto, puede ser problemático. Este obstáculo se deriva del pequeño tamaño del músculo esquelético pez cebra (60 m) y el tamaño aún más pequeño del sarcómero. Aquí describimos y demostrar un método sencillo y rápido para el aislamiento de miofibras esqueléticas a partir de embriones de pez cebra y larvas. También se incluyen los protocolos que muestran técnicas de correos de preparación útiles para el análisis de la estructura y la función muscular. Concretamente, se detalla la localización inmunocitoquímica posterior de las proteínas del músculo esquelético y el análisis cualitativo de la liberación de calcio estimulado a través de imágenes de calcio de células vivas. En general, este videoartículo proporciona un método sencillo y eficiente para el aislamiento y caracterización de miofibras esqueléticas de pez cebra, una técnica que proporciona un conducto para estudios posteriores miríada de estructura y la función muscular.
Introducción
El músculo esquelético es un tejido altamente especializado responsable de generar las fuerzas contráctiles necesarias para la motilidad. La contracción se inicia a través de un proceso conocido como excitación-contracción (CE) de acoplamiento que convierte las señales eléctricas a la liberación de calcio desde las reservas intracelulares 1,2. La liberación de calcio intracelular activa el sarcómero se acorte y generar fuerza. Los numerosos componentes específicos de la maquinaria molecular responsable de mediar la transmisión unión neuromuscular 3, acoplamiento CE 4,5, y la actina-miosina contracciones dependientes 6 conti....
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Protocolo
1. Preparación de poli-L-lisina recubierto cubreobjetos (Tiempo: 1 hr)
Cubreobjetos de recubrimiento permite una rápida sedimentación de miofibras y adhesión. Esto se puede realizar durante la etapa de disociación del aislamiento de miofibras (paso 2 a continuación).
- Cortar y colocar Parafilm en la parte inferior de una placa de 60 mm de Petri (de cualquier marca).
- Coloca los resbalones de la cubierta de vidrio de microscopio (12 mm de diámetro) en Parafilm en un 60 mm placa de cultivo de tejidos o colocarlos individualmente en pocillos individuales de placas de 24 pocillos.
Nota 1: ....
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Resultados
Inmunomarcaje fluorescente de miofibras (Figura 2)
Las imágenes que muestra un patrón marcado fluorescente que se espera de las miofibrillas inmunotiñeron después del aislamiento y de las planchas de éxito. Las fibras musculares se han etiquetado con cualquier anti-receptor de rianodina (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticuerpos, y revelar la inmunotinción de la tríada y la banda Z, respectivamente. Los an.......
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Discusión
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio de desarrollo de los músculos y la función en vivo 25,27,28. Ellos también se han convertido en un activo valioso para el modelado de enfermedades musculares humanas 14,15,20,29. Aunque se han dado grandes pasos para avanzar en el uso y aplicación de pez cebra para el estudio de la función muscular y la enfermedad del músculo, hay una necesidad crítica constante para desarrollar herramientas que permitan an.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, y William Telfer) que contribuyeron al desarrollo de la técnica y para la producción del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Instituto Taubman, el Departamento de Pediatría de la Universidad de Michigan, y en parte de subvenciones de la Asociación de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) y los Institutos Nacionales de Salud (JJD 1K08AR054835).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| placa de cultivo de 24 pocillos | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Medio independiente | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Colagenasa Tipo II | Worthington Biochemical | LS004186 Lote 41H12764 | |
| Colagenasa Tipo IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| Paraformaldehído al 8% | Microscopía Electrónica Ciencias | 157-8 | |
| Metanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Suero de oveja | Sigma | S3772 | |
| Suero de cabra | Sigma | G9023 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lisine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μ m Filtro | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μ m Filtro | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold reactivo antidecoloración | Invitrogen | P36931 | |
| Anticuerpo anti-&alfa;-actinina | Sigma | A5044 | |
| Anticuerpo anti-RYR | Abcam | 34C | |
| Alexa Anticuerpo flúor | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| Placa de Petri de 60 mm | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
Referencias
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
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Reimpresiones y permisos
