Summary
El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.
Abstract
El pez cebra ha demostrado ser un sistema modelo valioso para la exploración de la función del músculo esquelético y para el estudio de enfermedades musculares humanas. A pesar de las muchas ventajas que ofrece el análisis in vivo de los músculos esqueléticos en el pez cebra, visualizando el complejo y finamente estructurada entorno proteína responsable de la función muscular, especialmente en los embriones en su conjunto, puede ser problemático. Este obstáculo se deriva del pequeño tamaño del músculo esquelético pez cebra (60 m) y el tamaño aún más pequeño del sarcómero. Aquí describimos y demostrar un método sencillo y rápido para el aislamiento de miofibras esqueléticas a partir de embriones de pez cebra y larvas. También se incluyen los protocolos que muestran técnicas de correos de preparación útiles para el análisis de la estructura y la función muscular. Concretamente, se detalla la localización inmunocitoquímica posterior de las proteínas del músculo esquelético y el análisis cualitativo de la liberación de calcio estimulado a través de imágenes de calcio de células vivas. En general, este videoartículo proporciona un método sencillo y eficiente para el aislamiento y caracterización de miofibras esqueléticas de pez cebra, una técnica que proporciona un conducto para estudios posteriores miríada de estructura y la función muscular.
Introduction
El músculo esquelético es un tejido altamente especializado responsable de generar las fuerzas contráctiles necesarias para la motilidad. La contracción se inicia a través de un proceso conocido como excitación-contracción (CE) de acoplamiento que convierte las señales eléctricas a la liberación de calcio desde las reservas intracelulares 1,2. La liberación de calcio intracelular activa el sarcómero se acorte y generar fuerza. Los numerosos componentes específicos de la maquinaria molecular responsable de mediar la transmisión unión neuromuscular 3, acoplamiento CE 4,5, y la actina-miosina contracciones dependientes 6 continúan siendo objeto de una intensa investigación en curso. Además, las proteínas que estabilizan la membrana muscular durante 7,8 contracción y que median la señalización entre la miofibras y la matriz extracelular 7,9 se han identificado y estudiado en gran detalle.
Las mutaciones en un número de genes importantes para la estructura de un músculoND función se han identificado como causas de enfermedades del músculo esquelético humanos ( http://www.musclegenetable.org/ ). Estas enfermedades, que se clasifican en términos generales como miopatías esqueléticas y distrofias musculares basados en las características clínicas e histopatológicas, se asocian a debilidad muscular, incapacidad permanente y 10,11 mortalidad temprana. El pez cebra ha demostrado ser un sistema excelente para modelar y estudiar las enfermedades del músculo esquelético humanos 8,12,13. Se ha empleado para validar nuevas mutaciones del gen 8, definir nuevos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad 14,15, e identificar nuevos enfoques terapéuticos 15,16. El poder del pez cebra para el estudio de la enfermedad de músculo humano se refiere a la gran cantidad de el rápido desarrollo de la estructura muscular y la función, la claridad óptica del embrión de pez cebra, y la facilidad de manipulación genética y farmacológica de la cebra el desarrollo de la descendencia,pescado 17.
Nosotros y otros 12,18,19 hemos desarrollado recientemente una técnica simple para el aislamiento rápido y eficiente de las miofibras del pez cebra en desarrollo. Esta metodología ha permitido el examen de las miofibras en mayor detalle que puede ser proporcionada por el análisis de embriones conjunto. La técnica se ha explotado para la caracterización de la proteína de localización subcelular 20, así como para la identificación de importantes características histopatológicas como parte de los estudios de validación en modelos de enfermedad de nuevo desarrollo 21. Además, las miofibras aisladas, además, se pueden usar para formación de imágenes en vivo y para los estudios electrofisiológicos 22, técnicas que permiten la interrogación de los aspectos clave de la función muscular. El protocolo específico para el aislamiento de miofibras, junto con dos ejemplos de experimentos analíticos posteriores, se detalla en las partes restantes de este manuscrito.
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Protocol
1. Preparación de poli-L-lisina recubierto cubreobjetos (Tiempo: 1 hr)
Cubreobjetos de recubrimiento permite una rápida sedimentación de miofibras y adhesión. Esto se puede realizar durante la etapa de disociación del aislamiento de miofibras (paso 2 a continuación).
- Cortar y colocar Parafilm en la parte inferior de una placa de 60 mm de Petri (de cualquier marca).
- Coloca los resbalones de la cubierta de vidrio de microscopio (12 mm de diámetro) en Parafilm en un 60 mm placa de cultivo de tejidos o colocarlos individualmente en pocillos individuales de placas de 24 pocillos.
Nota 1: Estos pequeños cubreobjetos redondos ayudan a concentrarse miofibras números y reducir el uso de exceso de anticuerpo.
Nota 2: Otros cubreobjetos tamaño trabajarán, sin embargo, tendrán que ajustarse en consecuencia los volúmenes de los reactivos y de los embriones utilizados.
- Pipeta de 50-200 l de solución de poli-L-lisina (0,01%) en cada vidrio de cubierta en la placa de Petri.
- Deje que los portaobjetos para sentarse por lo menos una hour a 37 ° C. Incubaciones más largas no influirán negativamente en los resultados.
- Retire la solución de poli-L-lisina de la cubierta de vidrio y se lava dos veces con un mínimo de 100 l de PBS 1x.
- Permitir cubreobjetos se sequen.
- Cubreobjetos ya están listos para las miofibrillas.
Nota 3: Para asegurar la esterilidad, de recubrimiento se puede hacer en una campana y en cubreobjetos tratados en autoclave.
Nota 4: Mantener el 60 mm placa de Petri con Parafilm en la parte inferior. Esta configuración se utilizará durante miofibra galvanoplastia y immunolabeling (posteriores pasos).
Alternativa 1: En lugar de cubreobjetos de revestimiento inmediatamente antes del uso, un cubreobjetos de papel estucado se puede utilizar. Un plato de 60 mm de Petri que contiene un mínimo de 2 ml de poli-L-lisina se puede almacenar a 4 ° C que contiene numerosos cubreobjetos. Con esta alternativa comience en el paso 1.5 para procesar los cubreobjetos de las miofibrillas.
Alternativa 2: También cubreobjetos capa de poli-L-ornitina. Tla suya es más mano de obra, pero es útil para el cultivo a largo plazo porque cubreobjetos recubiertos con poli-L-ornitina puede ser tratado UV. Con el tratamiento UV y una técnica estéril cuidado miofibras en vivo típicamente se pueden mantener en cultivo de 4-7 días.
2. Disociación de embriones de pez cebra y Plating de miofibras (Tiempo: 1 a 3 horas)
Nota: el protocolo estándar se aplica mejor a 3 dpf (días después de la fecundación) embriones.
- Transferencia de embriones de pez cebra en un tubo de centrífuga de 1,5 ml estándar y eliminar la mayor cantidad de agua el exceso de pescado como sea posible. Por lo general, se pueden utilizar 10 a 20 embriones por tubo, aunque menos. El uso de más de 20-25 embriones a menudo resulta en una preparación de densidad excesiva.
- Eliminar chorions antes de la disociación, usando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, la eliminación corion química se consigue con un 10-15 min tratamiento con pronasa. Por lo general, sólo es necesaria la eliminación previa del corion cuando la confirmación previa de un mutSe requiere fenotipo hormiga o morfología, o cuando se utilizan etapas donde los embriones son, naturalmente, nacido de su corion.
- Añadir 900 l de CO 2 medios de comunicación independientes para el tubo que contiene los embriones.
- Añadir 100 l de colagenasa de tipo II, una concentración final de 3,125 mg / ml (solución madre colagenasa a 31,25 mg / ml diluida en 1X PBS) para comenzar la disociación. La colagenasa IV también se puede utilizar para la disociación.
- Girar embriones en un agitador orbital, y se tritura cada 30 min a temperatura ambiente usando un P1000 Pipetman para la trituración.
Nota 2: Es importante vigilar cuidadosamente la disociación de embriones; sobre o debajo de la disociación (sobre todo mayores) son las razones más comunes para el fracaso del protocolo. Los tiempos para la digestión pueden variar dependiendo de la intensidad de la trituración, el número de embriones por tubo, y la edad de los embriones. También es a menudo menos (en comparación con los tipos salvajes) para embriones de los mutantes del músculo esquelético.
Nota3: tiempo de digestión promedio por edad del embrión: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 horas, 3 dpf = 2 h, y 4 dpf = 2-2,5 horas.
- Detener la digestión cuando no hay embriones enteros son visibles, todavía trozos sólidos siguen siendo visibles - esto es esencial para prevenir overdigestion.
- Tubos centrífuga con embriones disociadas a 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos a las células de pellets.
- Aspirar el sobrenadante de células sedimentadas y lavar 2 veces con CO 2 medios de comunicación independientes.
- Añadir CO fresco 2 medios de comunicación independientes para volver a suspender las células. 1 ml se utiliza normalmente para preparaciones de 10-20 embriones. El volumen se puede escalar basada en el número de embriones.
- Con una pipeta P1000, pasar la suspensión del embrión a través de un filtro de 70 micras. Esto ayuda a eliminar los residuos no deseados de la preparación.
Nota 4: suspensión de embriones se puede filtrar una segunda vez a través de un filtro de 40 micras para eliminar adicionalmente los desechos no deseados. A partir de una doble filtración, la recuperación es aproximadam ente 800 l de un volumen inicial de 1 ml.
- Añadir aproximadamente 50-100 l de suspensión de miofibras a cada cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
Nota 5: Realice el paso 2.9 en las placas de Petri con Parafilm en la parte inferior, previamente preparado. El Parafilm mantiene la suspensión miofibra escurra los cubreobjetos recubiertos. Mantenga placas Petri cubiertas para evitar la evaporación.
- Permitir miofibras se asienten aproximadamente 1 hr en los cubreobjetos recubiertos a temperatura ambiente.
Nota 6: miofibras comenzarán a instalarse dentro de 5-10 min. Sin embargo, para un buen agarre miofibra, se recomienda un mínimo de 1 hora (1-2 horas). Permitir que las miofibrillas se asienten durante más tiempo no dañará la preparación. Para incubaciones más largas (incluyendo durante la noche), los antibióticos pueden ser añadidos a los medios de comunicación. Con antibióticos y técnica estéril cultivos vivos normalmente se pueden mantener durante 1-2 días.
- Vivo myofibers se puede observar en este punto. Miofibrillas de embriones 2 DPF y más tarde se verá como células estriadas y alargadas (Figura 1). En este punto, las miofibras ya están listas para análisis en vivo o para immunolabeling.
Nota 7: El músculo esquelético de 1 fdd embriones no platear fibras alargadas y claramente estriadas. En cambio, las grandes myoballs son visibles. Además, durante la fase de granulación mensaje de disociación (paso 2.6), 1 dpf myoballs necesitan ser centrifuga durante un mínimo de 8 minutos a 5000 xg para obtener un pellet. Para el análisis de los embriones en esta etapa, se recomienda utilizar la línea transgénica que expresa EGFP específicamente en el músculo esquelético 23. Esto permitirá la identificación de las células de origen muscular en comparación con otras fuentes.
3. Fluorescencia inmunotinción de disociadas de pez cebra miofibras (Tiempo: aproximadamente 1 día)
3.1. Immunolabeling
- Retire una parte demedios de miofibras adheridas a la cubreobjetos recubierto
- Fijar las células utilizando paraformaldehído al 4% o metanol. Para PFA, retire ½ el volumen de los medios de comunicación y reemplazar con la misma cantidad de PFA. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente, a continuación, extraiga el volumen total, reemplace con 50-100 l de PFA, y fijar, por una suma adicional de 10 min. Para la fijación de alcohol, metanol enfriado con hielo o acetona se puede aplicar a 4 º C durante 10 min o 5 min, respectivamente.
- Lávese las miofibrillas al menos 3 a 5 veces con 1x PBS o 1x PBS más 0,1% de Tween. El volumen medio de lavado es de 50 a 100 l por cubreobjetos.
- Añadir la solución de bloqueo a las miofibrillas (solución de trabajo) e incubar 20-60 minutos a temperatura ambiente. El bloqueo de solución variará dependiendo de los anticuerpos primarios y secundarios. Los dos más comunes utilizados en el laboratorio son (1) 1x PBS, 2 mg / ml de BSA, 1% de suero de ovejas, 0,25% de Triton X-100 final y (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) y 5% de suero de oveja / cabra.
- Eliminar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo primario diluido en cualquiera de bsolución de PBS o de bloqueo. Incubar miofibras la noche a 4 ° C. Asegúrese de que sea Parafilm o envuelva en Saran Wrap la placa de Petri que contiene los cubreobjetos miofibras cargada recubiertas con anticuerpos. Pequeños trozos de toalla de papel humedecida se pueden añadir para crear una cámara humidificada.
- Eliminar el anticuerpo primario de cubreobjetos y lavar cubreobjetos 3-5x por 5 min con PBS o solución de bloqueo.
- Añadir anticuerpo secundario a una concentración apropiada diluida en 1X PBS o solución de bloqueo durante 1-2 horas a TA.
- Se quita el anticuerpo secundario y lavar miofibras 3-5x en PBS durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
3.2. Cubreobjetos de montaje
- Aplicar 1-2 gotas de antifade reactivo a un portaobjetos de microscopio.
- Pick-up con cuidado el cubreobjetos recubierto y immunolabled utilizando fórceps y lugar (miofibrillas hacia abajo) el cubreobjetos sobre la antifade reactivo en el portaobjetos de un microscopio.
Nota 1: La atención a la orientación de la ccubreobjetos oated es crítica.
- Coloque 1-2 Kimwipes sobre una superficie sólida duro. Invertir rápidamente la diapositiva con los cubreobjetos recubiertos de descanso en la antifade reactivo y colocarlo (cubreobjetos hacia abajo) en la Kimwipes.
- Aplique una leve presión sobre las esquinas del portaobjetos para retirar el exceso Antifade y formar un sello hermético entre el portaobjetos y cubreobjetos
- Permitir la Antifade restante secar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, y luego las fibras musculares están listos para la imagen (Figuras 2 A y B) o se almacenan a 4 ° C.
4. Celular en vivo Imagen de calcio Usando GCaMP3
Experimentos con células vivas pueden ser realizados en fibras musculares antes de la fijación (siguientes paso 2,10). El siguiente protocolo describe imágenes en vivo en miofibras que expresan GCaMP3 24, un indicador de calcio codificado genéticamente, expresado por el promotor pez cebra específica del músculo esquelético-α actina (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica se puede adaptar fácilmente para utilizar colorantes indicadores de calcio tales como Fura-2.
- Inyectar embriones con pSKM: GCaMP3 construir en la etapa de 1-2 células
- A las 3 dpf, recoger larvas y preparar las miofibrillas como se describe en las secciones 1 y 2. Permitir miofibras que se adhieran durante un mínimo de 1 hora. Para esta técnica, se requiere la preparación de cubreobjetos en placas de 24 pocillos.
- Retire con cuidado el exceso de medios de comunicación, y añadir 300 l de fresco CO 2 medios de comunicación independientes a TA.
- Observar las células bajo un microscopio invertido. Miofibras GCaMP3 positivos deben ser visibles bajo fluorescencia verde.
- Preparar la cámara para la grabación, si se desea.
- Prepare una solución de cafeína 30 mM en CO 2 medios de comunicación independientes. Para estimular las células, pipetear suavemente 300 l de solución de cafeína en el pozo con una lupa. Dentro de 5-10 segundos, miofibras GCaMP positivos deben responder a la cafeína con un rápido aumento de la fluorescencia (Figura 3). Myofibres también pueden contraer. Es de destacar que la cafeína induce la liberación de calcio de los almacenes de retículo sarcoplásmico 25. Otros agentes, como KCl 26 y rianodina 4, se pueden utilizar para estudiar la liberación de calcio inducible.
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Representative Results
Inmunomarcaje fluorescente de miofibras (Figura 2)
Las imágenes que muestra un patrón marcado fluorescente que se espera de las miofibrillas inmunotiñeron después del aislamiento y de las planchas de éxito. Las fibras musculares se han etiquetado con cualquier anti-receptor de rianodina (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticuerpos, y revelar la inmunotinción de la tríada y la banda Z, respectivamente. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron Alexa Fluor 555 (1:500). Las imágenes capturadas mediante microscopía confocal.
Liberación de calcio inducida a partir de una miofibras (Figura 3)
Series Panel que muestra la liberación de calcio desde un representante miofibra aislados tratados con cafeína. En breve, embriones de pez cebra fueron inyectados en la etapa de una célula con la pSKM: constructo GCaMP3. En 3 dpf, los embriones se disociaron y se cultivaron como se describe en el protocol. Para el análisis, se seleccionaron GCaMP3 miofibras que expresan, como se indica por la presencia de fluorescencia verde al inicio del estudio. Utilizando una micropipeta para la administración de fármacos, la fibra seleccionada fue bañado en una solución de cafeína 30 mM para inducir la liberación de calcio. La grabación de vídeo se inició antes de la aplicación de cafeína y continuó hasta que se alcanzó un pico de fluorescencia. Esta figura demuestra la liberación normal inducida por la cafeína de calcio, y la técnica se puede utilizar para interrogar al dispositivo de acoplamiento de excitación-contracción a través de formación de imágenes en vivo.
Figura 1. Cronología esquemática de disociación de Embriones. Paneles sucesivos (de arriba abajo) ilustran distintos pasos, el tiempo y el equipo necesario para la disociación del embrión. A) La selección de embriones para la disociación. La barra de escala de 500 micras. B) Imago de configuración de la disociación. Los embriones están en medios de comunicación y la colagenasa mientras gira hasta que se disocian suficientemente (paso del protocolo 2) C) La imagen de ambas técnicas de chapado miofibras;. Cubreobjetos redondos o placas de 24 pocillos (Protocolo de los pasos 1 y 4, respectivamente) D) A-campo claro. imagen en directo disociado miofibras pez cebra chapada en poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos. Las flechas indican las miofibras alargadas de 48 HPF pez cebra. La barra de escala 30 micras.
Figura 2. Immunolabeling de fibras musculares individuales aislados a partir de 48 embriones de pez cebra HPF. A) miofibra etiquetados con anti-receptor de rianodina (RyR1), revelando un patrón de bandas a lo largo de la fibra consistente con la localización de la tríada / aparato de acoplamiento de la CE. B) miofibra etiquetados con anti-α -actinina, visualizin estrías g (rojo) a lo largo del miofibra localizar al sarcómero y resaltando las bandas Z. En ambas imágenes, los núcleos están etiquetados con DAPI, vistos como óvalos azules. Inserta muestran imágenes de mayor aumento de la miofibrilar en la imagen grande. A) y B) la barra de escala 30 micras.
Figura 3. Representante indujo respuesta de la liberación de calcio desde un único aislado miofibra pez cebra. Todos los paneles muestran una miofibra pez cebra pseudocoloreada expresar GCaMP3. El curso de tiempo muestra el aumento de la fluorescencia GCaMP3 (color rojo) en respuesta a la aplicación de cafeína 30 mM. Grabación comenzó antes de la aplicación de cafeína (0 ms) y continuó con la respuesta de fluorescencia máxima (992 ms). La barra de escala 30 micras.nk "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
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Discussion
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio de desarrollo de los músculos y la función en vivo 25,27,28. Ellos también se han convertido en un activo valioso para el modelado de enfermedades musculares humanas 14,15,20,29. Aunque se han dado grandes pasos para avanzar en el uso y aplicación de pez cebra para el estudio de la función muscular y la enfermedad del músculo, hay una necesidad crítica constante para desarrollar herramientas que permitan análisis más profundo que se complementa con la genética, morfológica, conductual y funcional ventajas pez cebra ya ofrecen 17. Por ello, hemos adaptado y desarrollado una técnica simple y robusto para la caracterización de las fibras musculares de pez cebra a partir de embriones enteros disociadas.
El uso de fibras musculares individuales es un lugar común en los estudios que utilizan el sistema modelo murino. En los ratones que ha permitido a las investigaciones y análisis que son impracticables o imposibles en animales enteros, including localización subcelular de proteínas estudia 30, imágenes de células vivas 31, y las mediciones electrofisiológicas 32. En el pez cebra, técnicas de disociación similares se han desarrollado previamente para identificar y examinar motoneuronas 33, así como las neuronas sensoriales Rohon-Beard 34 específicamente, y estas técnicas han permitido el análisis detallado de estos subtipos de neuronas.
La amplia aplicabilidad de miofibras aisladas, en combinación con las muchas ventajas únicas del pez cebra ofrece como modelo de vertebrados 17, son lo que nos motivó a desarrollar una técnica para aislar y caracterizar las miofibrillas pez cebra embrionarias y larvarias. Hemos utilizado fibras musculares aisladas en los estudios previos para determinar la localización subcelular de las proteínas musculares 20,21, para estudiar la localización de los transgenes expresados quiméricamente 35 y para definir los parámetros de miofibras específicos incluyendo especialmente el tamaño
Grabner y sus colegas también han utilizado el sistema miofibra con gran éxito 19,22,36. Son el único grupo que informe el cultivo prolongado de fibras aisladas. Además, han sido capaces de utilizar las fibras para medir las propiedades electrofisiológicas del músculo. En concreto, han puesto a prueba el impacto de la pérdida de la subunidad beta del receptor de dihidropiridina en la liberación de calcio y se mide la capacidad de un conjunto de transgenes para rescatar defects en esta versión. Estos estudios iluminan algunas de las muy poderosas aplicaciones potenciales de miofibras aisladas.
Otro grupo reportar el uso de la preparación para el estudio de la enfermedad miofibrilar del músculo es Nixon et al., Que utiliza fibras musculares para estudiar el impacto de morpholino mediada por caveolina 3 knockdown en el desarrollo muscular y la estructura muscular 18. Estos autores no sólo examinaron los parámetros por microscopía de luz, sino que también estudiaron las fibras mediante microscopía electrónica. Su trabajo identifica otra ventaja del sistema de miofibras aisladas: la capacidad para estudiar la ultraestructura de la miofibras en un entorno aislado y controlado.
Estos estudios, junto con nuestro trabajo, apuntan a la posible utilidad de gran alcance de esta técnica. Las aplicaciones adicionales están determinados a desarrollar, como la medición de los rápidos picos de calcio a través de indicadores como la Fura-2. Además, esta preparación ofrece la oportunidad de obserhe actividad eléctrica, tales como los potenciales de acción a través de colorantes sensibles al voltaje (di-4-ANEPPS) o registro electrofisiológico directa. Parece claro que todas las técnicas actuales utilizadas en las miofibrillas murinos deben ser aplicables a las miofibrillas de pez cebra. Además, la capacidad de expresar diferentes transgenes en el pez cebra en desarrollo, así como la disponibilidad de un número grande y creciente de pez cebra transgénico que expresa varias proteínas marcadoras ( www.zfin.org ), añade una capa adicional de complejidad y aplicabilidad a la sistema. Demostramos este hecho con las fibras musculares cultivadas de GCaMP3 pez cebra expresa, donde tomamos ventaja de la capacidad de expresar GCaMP3 en el músculo para estudiar imágenes de calcio inducida en tiempo real en las fibras aisladas (Figura 3).
Como con la mayoría de las técnicas, también hay algunas limitaciones claras en el sistema de miofibras aisladas. Estas cuestiones son adicionales a la gradadeficiencias de ARD de estudio de un tipo de célula in vitro que funciona como un sincitio en tres dimensiones en vivo y de la realización de experimentos electrofisiológicos con estímulos no fisiológicos. El uso de nuestra metodología, uno no es capaz de obtener una preparación pura de miofibras. Esto no es un problema para inmunotinción o para mediciones electrofisiológicas, pero se opone a ciertos enfoques experimentales. Por ejemplo, todavía tenemos que determinar una metodología adecuada para la identificación de una población pura de fibras musculares para el análisis de transcriptómica. Hemos intentado FACS clasificación de las buenas prácticas agrarias miofibras que expresan seguido de preparación miofibra, pero esto no se ha traducido en un cultivo puro con un número adecuado de fibras musculares de ARN o el análisis de proteínas.
Otro reto es el cultivo a largo plazo de las miofibrillas. Hemos sido capaces de mantener los cultivos durante aproximadamente 24 horas, y Grabner y colegas reportar una preparación que ha sido suitable para varios días de experimentación 19. El desafío relacionado con este aspecto de la técnica es la prevención de la contaminación, ya que estos cultivos (tanto como preparaciones de miofibras murinos) son a menudo difíciles de mantener estéril. Se necesita mucho cuidado si se va a intentar culturas prolongados. También recomendamos el uso de antimicrobianos incluyendo antifúngicos.
En total, se demuestra un método práctico para el aislamiento de miofibras pez cebra, así como esbozo de cómo realizar inmunomarcación fluorescente y calcio de imágenes en tiempo real sobre los preparativos de fibras aisladas. Modificación continua y el desarrollo de esta técnica ofrecerán un repertorio cada vez más amplia de herramientas para experimentar en tipos celulares específicos, aislados en el pez cebra. Por disociar embriones de pez cebra en las miofibrillas individuales aisladas, podemos mejorar nuestra comprensión del desarrollo muscular, la función y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, y William Telfer) que contribuyeron al desarrollo de la técnica y para la producción del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Instituto Taubman, el Departamento de Pediatría de la Universidad de Michigan, y en parte de subvenciones de la Asociación de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) y los Institutos Nacionales de Salud (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
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