Summary
Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).
Abstract
Burada da dahil olmak üzere ilgi biyolojik örnekler için metabolik profilleri analiz etmek için bir iş akışı sunmak, hücreleri, serum veya doku. Örnek ilk olarak bir sıvı-sıvı faz çıkarımı ile, polar ve polar olmayan fraksiyonlar halinde ayrıldı ve kısmen aşağı analiz kolaylaştırmak için saflaştırılır. Ilk ekstraksiyon sulu (polar metabolitler) hem de organik (polar-olmayan metabolitleri) aşamaları metabolitlerin geniş bir anket için işlenir. Metabolitler kendi bölümü özelliklere bağlı olarak farklı sıvı kromatografisi yöntemleri ile ayrılırlar. Bu yöntemde, biz (UP) LC yöntemleri Mikrosirkülasyon ultra performanslı mevcut, ancak protokol daha yüksek akım ve düşük baskılara ölçeklenebilir. Kütle spektrometresi içine Giriş genel veya bileşik optimize edilmiş kaynak koşulları ya yoluyla olabilir. Iyon geniş bir aralığı saptanması en son C yüksek çözünürlük kullanılarak, geniş m / z aralığı üzerinde hem pozitif hem negatif modunda, tam tarama modunda gerçekleştiriliralet alibrated. Etiket-ücretsiz diferansiyel analizi biyoinformatik platformlarda gerçekleştirilir. Bu yaklaşımın Uygulamaları metabolik yolu tarama, biyolojik keşif ve ilaç geliştirme içerir.
Introduction
HRMS alanındaki son teknolojik gelişmeler nedeniyle, hedefsiz, hipotez üreten metabolomik yaklaşımları karmaşık numunelerin analizi için uygun bir yaklaşım haline gelmiştir. Milyonda rutin alt kısım kolaylaştırmak 100.000 çözünürlük (ppm) kütle doğruluk yeteneğine 1 kütle spektrometresi yaygın hale gelmiştir birden çok tedarikçiden temin. 2,3 Bu kitle doğruluğu daha fazla özgüllük ve analit kimlik, izotop örüntü tanıma, ve yaklaşımlı kimlik ön atama güven sağlar. 4 uygun bir çıkarma işlemi ve yüksek performanslı LC veya UPLC, kompleks karışımlar ile birleştiğinde tutma zamanlı veri elde edilen ek özgünlüğü ile analiz edilebilir. 5 UPLC büyük kromatografik verimlilik sahip ve sonucunda büyük veri setleri herhangi bir entegre edilebilir olası metabolome. 6 daha büyük bir kapsama yapmak daha yüksek hassasiyette, çözünürlük ve analiz süresi sağlarbirden fazla diferansiyel analiz yazılımı ve kullanışlı desen veya ilgi bireysel analit için mayınlı. 7,8,9,10,11 farzedilen hit ilk tepe algılama algoritmaları bir arada, doğru kitle tabanlı kimyasal formülü tahmini, parçalanma tahmini kullanılarak tespit edilebilir, ve kimyasal veritabanı arama. Bu yaklaşım zaman alıcı tam yapısal tanımlama için ya da daha duyarlı ve daha spesifik izotop seyreltme gelişimi için hedefler UPLC / Seçilen veya birden fazla reaksiyon izleme / ölçümü için mevcut altın standart yöntemlerdir MS çalışmaları. 12 önceliklendirilmesi
Biyolojik örneklerin değişen doğası idrar 13, hücre 14, 15, serum, veya doku 16 ekstraksiyon protokolleri optimizasyonu yol açmıştır. Bu protokol özellikleri çekimi hücreleri, serum ve doku için. Uygun olduğunda, yorum ve ek referanslar değişikliği yapılarak için dahil edilmiştirProsedürün lar kararlı izotoplar dahil ele, ya da özellikle kararsız metabolitleri dahil etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücreler örnek Ekstraksiyon
- Hücrelerin 10 cm uzunluğunda bir parçası: bir ön-etiketli 10 ml bir cam santrifüj tüpü içine medya kaldırdı hücre süspansiyonu, 1.5 ml toplar. Yapışkan hatları için, hücreler, buz üzerinde tutulur medya 1.5 ml hafifçe kazınarak kaldırılmasıdır Opsiyonel:. Iç standartlar kullanıldığında, bu adımda uygun bir alikot ekleyin.
Yorum: hücresel metabolizma Islah bazı metabolitleri için çok önemlidir. Zamana duyarlı metabolitleri analizi için, örneğin, soğuk metanol ekstraksiyon gibi işlemler olarak kabul edilmelidir. 17 - Örnekleri içeren 10 ml'lik bir cam tüplerin her 6 ml kloroform (CHCI3) / metanol (CH3 OH) (2:1 v / v) ekleyin. 30 dakika için düşük hızda bir karıştırıcı ya da çok-vortexer örneklerin ayarlayın. Çalkalamadan sonra, numuneler 4 10 dakika boyunca 1,935 x g'de düşük bir hızlanma / yavaşlama ayarı ile santrifüjlenir ° C tamamen fazlar ayırmak için.
Isteğe bağlı CHCl3 kullanarak önlemek için, ekstraksiyon (CH 2 Cl 2) diklorometan ile yapılabilir 18,12. - Uzun bir kök Pasteur pipeti kullanarak, yeni bir ön-etiketli 10 ml bir cam santrifüj tüpüne organik (alt) katmanı aktarın. 4.1 devam edin.
- Daha sonra, temiz bir plastik 2 ml Eppendorf tüpüne üst sulu aktarın. Azot gazı altında örnek buharlaşır. Sulu faz tuzsuzlaştırma için 2.6.2 devam ya da doğrudan analiz için 4.1 devam ediyor.
2. Serum örnek Ekstraksiyon
- Plastik bir 2 ml Eppendorf tüp içine serum 20 ul aktarın İsteğe bağlı:. Iç standartlar kullanılırsa, bu aşamada uygun bir kısım ekleyin.
- 10 sn için CH 3 OH ve vorteks 190 ul ekleyin.
- 10 sn için CHCl3 ve vorteks 380 ul ekleyin.
- Faz ayrılması neden H 2 O 120 ul ekleyin. Girdap 10 saniye için numune ve 10 için oda sıcaklığında dengelenmeye olanakdk.
- 4, 10 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüje örnekleri ° C fazlar ayırmak için.
- , Temiz bir plastik 2 ml Eppendorf tüp içine alt organik faz transfer edin. 4.1 devam edin.
- Daha sonra, temiz bir plastik 2 ml Eppendorf tüpüne üst sulu aktarın. Azot gazı altında örnek buharlaşır.
- 200 ul H 2 O içinde örnek yeniden askıya Asit veya baz reaktif (% 0.1 asetik asit, formik asit ya da% 0.1 amonyum hidroksit), tercihen, pH'a duyarlı metabolitleri elde etmek için kullanılabilir. Tamamen örnek yeniden askıya almak için buz üzerinde 20 dakika boyunca sonikasyon.
- 500 ul CH 3 OH ile C18 dönüş sütunları etkinleştirin.
- 500 ul H2O iki yıkama ile spin kolon dengeye ve daha sonra, örnek yükleyin. Asit / baz reaktifler kullanılması durumunda, yıkama basamakları bu konsantrasyonu muhafaza.
- Örnek desalt için 500 ul H 2 O ile yıkayın. Asit / baz reaktifler kullanılır Yine, eğer yıkama bu konsantrasyonunu korumakadımlar.
- Bir ön-etiketli temiz 2 ml Eppendorf tüpüne H2O 3 OH CH 200 ul% 80, iki hacim elute. Asit / baz reaktifler kullanılır Yine, eğer yıkama adımda bu konsantrasyonu muhafaza. 4.1 devam edin.
3. Doku örnek Ekstraksiyon
- Dokuya bağlı olarak, dondurulmuş doku 10-100 mg arasında kullanın. Bir buz banyosu içinde 1 ml PBS (1 M, pH 6.8) ile bir ön-etiketli 2 ml az tutma Eppendorf tüpüne dokusunun bütün parça ekleme Opsiyonel:. Iç standartlar kullanıldığında, eklemeden önce, tampon içine eklemek doku.
- Her bir Eppendorf 30 saniye boyunca bir elektrik doku öğütücü ile buz dokusu homojenize edilir. Örnekleri arasında, sırasıyla, CH3, OH ve H2O içeren iki ayrı tüplere doku öğütücü temizleyin.
- Bir ön-etiketli 10 ml bir cam santrifüj tüpü içine, plastik bir pipet ile homojen doku aktarın. Aktarımdan sonra, her bir Eppendorf tüp durulamaCH3, OH, 1 ml 2x ve cam tüpler içinde homojen doku için yıkama ekleyin.
- Doku homojenatı, ve CH 3 arasında OH yıkama içeren 10 ml'lik bir cam tüplerin her CHCl3 4 ml ilave edilir. 30 dakika için düşük hızda bir karıştırıcı ya da çok-vortexer örneklerin ayarlayın.
- Çalkalamadan sonra, tamamen fazlar ayırmak için 10 dakika boyunca 1935 x g'de düşük bir hızlanma / yavaşlama ayarı ile örnekleri santrifüj Opsiyonel:. Kloroform kullanılarak önlemek için, ekstraksiyon CH2 CI2 ile geliştirilmiştir.
- Uzun bir kök Pasteur pipeti kullanarak, yeni bir ön-etiketli 10 ml bir cam santrifüj tüpüne organik (alt) katmanı aktarın. 4.1 devam edin.
- Uzun bir kök Pasteur pipeti kullanarak, yeni bir ön-etiketli 10 ml bir cam santrifüj tüpüne sulu tabaka aktarın. Tuzsuzlaştırma için 2.6.2 gitmek veya 4.1 devam ediyor.
4. Yeniden süspansiyon ve UPLC için Numune Filtrasyon
- Samp buharlaşmasıazot gazı altında les.
- Sulandırın istenen UPLC yöntemi (bkz. Tablo 1) için bir başlangıç çözeltisinin uygun bir hacimde numuneler kurutulmuştur. 50-100 ul genellikle arzu edilen bir yeniden süspansiyon birimdir. Yavaşça girdap ve / veya analitlerin çözünmesine yardımcı olmak için aşağı örnek pipet ve.
- Örnek tamamen filtre (~ 5 dk) geçti kadar 14.000 xg için bir 0.22 mikron naylon tüp filtre ve spin içine örnek aktarın. Numunedeki kalan çökeltiler görünür olduğundan emin olun.
- Kesici uç ile bir ön-etiketli UPLC şişenin içine süzüldü numunenin süpernatant aktarın. Cap flakon, daha sonra örnek şişesine altından herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için flakon hafifçe vurun. Soğutulmuş Otosampler (4-5 ° C) içinde örnek yerleştirin.
5. UPLC Kurulum
- Akışkan kromatograf için kontrol yazılımı kullanarak, listelenen koşulların kapalı tabanlı organik örnek için bir çalışma oluşturmak
- UPLC yeterince gelmesini sağlayınız. Bu, bir sütun bağlama, ve yeni bir sütun (genellikle 3-5 kolon hacmi) bir dengeleme birimi için, üreticinin talimatları takip önce çözücü, tam bir astar içermelidir. Gelecekteki sorunları teşhis yardımcı olmak için baskılar geri başlayan bir günlük koruyun.
6. Kütle Spektrometre Kurulum
- Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi için bir kontrol yazılımı kullanarak, Tablo 2'de listelenen koşullar kullanılarak bir pozitif mod yöntem oluşturmaktır. Daha sonra aynı şartlar kullanılarak, bir negatif mod yöntem oluşturmak Opsiyonel:. Hedef analitlerin, bilinen bir dizi yüksek int iseerest optimize kaynağı ve bu bileşiklerin ağır etiketli analog kullanılarak optik koşulları ve bu koşullar kullanılarak bir yöntem oluşturur.
- Araç temiz ve kalibre, spektrometre içine istikrarlı bir sprey kurmak ve yeterli kaynak ve optik gelen dağıtmak için kalibrasyon çözüm için zaman tanımak. Sprey Kabul edilebilir istikrar LC yöntemi kullanılan ile aynı akış hızında kalibrasyon çözüm enjeksiyonu ile en az 100 tarama üzerinde yoğunluk RSD bir% 3-5 vermelidir.
- Tüm örnekler için sırasını ayarlayın, uygun enjeksiyon seviyesini ayarlamak, ve ilk örnek önce boş çalıştırın. Örnekleri arasında taşınmasını veya matriks etkileri şüpheleniliyorsa, yeterli boşlukları / yıkar çalıştırın. Örnekler analiz tarafından eklenen toplu etkilerini önlemek için bir rasgele sayı üreteci ve bir anahtar kullanarak bir randomize bir şekilde kurulum olmalıdır.
Yorum: olası hedeflerin izotop standartları veya analitik standartlar dahil olmak üzere Kalite kontrol örnekleri olabilirgüvenilir, tekrarlanabilir ve geçerli sonuçlar giderme ve sağlanmasında son derece değerli. Bir Boş Çözücü takiben standart bir tek numune bir teknik çoğaltmak boş bir çalışma içine sinyal yoğunluğu ve tutma süresi sapma, hem de ertelenmiş eriştiği için kullanılabilir. - Dizisi başlayın ve basınç dalgalanmaları, ya da çalışma boyunca sinyal yoğunluğu kaybı gibi sorunlara için periyodik olarak izlemek. Ciddi sorunlar tespit edilirse, kaçak durdurmak ve 6.2 tekrarlayın.
7. Diferansiyel Analizi
- İki iş akışları bu protokol için sunulmaktadır. İlk ELEK 2.0, Thermo Fisher tarafından satılan özel etiket içermeyen diferansiyel analiz yazılımı geçer. İkinci iş akışı diferansiyel analiz başlamadan önce XCMS Çevrimiçi, Scripps Araştırma Enstitüsü ile ücretsiz bir platform. 11 geçer, elle TIC kontrol veya ishal tekrarlanabilirliği sağlamak için örnek herhangi bir bilinen bileşik için filtre kromatogramları bakmakve tüm örnekler boyunca enjeksiyon / UPLC / sprey istikrar.
- ELEK
- Kütle spektrometresi gelen ELEK yüklü olduğu iş istasyonunun sabit disk için. Ham veri dosyaları aktarın. (Not: bu analiz hızını sınırlamak gibi bir ağ veya USB bağlantı noktası bağlı diskinde saklanan verilerle ELEK çalışan tavsiye edilmez.)
- Açık ELEK, ve yeni bir deneme başlar.
- ELEK içine uygun dosyaları yükleyin.
- Karşılaştırma grupları atamak ve ELEK analiz parametrelerini oluşturmak için izin vermek için tek bir referans dosyasını seçin.
- Ister ve herhangi bir bireyin deney ihtiyaçlarına göre herhangi bir parametre ayarlamak izleyin. Bu sıkı parametreleri ile başlamak ve daha sonra geri dönüp daha cömert ayarları analiz süresi uzatmak gibi parametreleri gevşetmek için genellikle tavsiye edilir.
- Parametreleri olumlu veya olumsuz modu için doğru kimyasal katkı listesi yüklenemedi.
- XCMS Çevrimiçi
- Dosyalarını dönüştürmeÇevrimiçi XCMS için kabul edilebilir bir biçime. Bizim durumumuzda, biz biçimine mzXML dönüştürmek. 19
- Açık XCMS Çevrimiçi ve İş oluşturun.
- Yükle ve veri setleri isim. Sadece iki veri setleri (örneğin Kontrol vs Tedavi) tek başına XCMS kafa kafaya karşılaştırmalar sınırlıdır olarak yüklenebilir.
- Açılan listeden istediğiniz ayarları seçin. Önceden doldurulmuş parametreleri farklı enstrümantasyon kurulumları için kullanılabilir, ve bu daha deneysel ihtiyaçları için değiştirilebilir. Bizim durumumuzda, biz HPLC-Orbi2 ayarlarını kullanın.
- Gönder ve işini onaylamak.
- Veri Analizi
- Analiz tamamlandıktan sonra ELEK ve XCMS için sırasıyla kare ve özellikleri, bir liste, doldurulur. LC uyum herhangi bir bölgenin pik bindirmeleri emin olun. Hizalanmamış LC çalışır herhangi bir bölgenin zirveleri büyük sapma gösteriyorsa, bu örnek ile bir sorun olduğunu gösterebilir.
Opsiyonel: İç standartlar kullanılması durumunda ELEK için, bulunkarşılık gelen tepe grubu ve seçilen çerçeveye normalize. On-line XCMS için, normalleştirme ihracat sonra elektronik tabloyu yapılabilir. - Bir gibi örnek nüfus (örneğin kontrol numuneleri) içinde değişim katsayısı (CV) verileri çizmek. Herhangi bir büyük CV değerleri bir veya daha fazla örnek ile bir sorun olduğunu gösterebilir. Istenen özellikleri (örneğin p-değeri <0.05, Fold değiştir> 1.5, bir grup içinde düşük standart sapma, vb) göre sıralamak.
- Grupları arasında uygun pik uyum, tepe entegrasyonu, Gauss pik şekli, sinyal yoğunluğu, izotoplar ve kimyasal katkı atama için her tepe inceleyin.
- Daha fazla analiz için istediğiniz gibi veri ihracat veya onay ve MS n deneyleri için hedef kitle listeleri oluşturmak için.
- Analiz tamamlandıktan sonra ELEK ve XCMS için sırasıyla kare ve özellikleri, bir liste, doldurulur. LC uyum herhangi bir bölgenin pik bindirmeleri emin olun. Hizalanmamış LC çalışır herhangi bir bölgenin zirveleri büyük sapma gösteriyorsa, bu örnek ile bir sorun olduğunu gösterebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan sonuçlar pestisit ve mitokondriyal kompleks I inhibitörü rotenone ile SH-SY5Y glioblastoma hücrelerinin bir 6 saatlik tedavi seçilen verileri göstermektedir. Kısalık için, sadece organik faz olumlu modu veri sunulmuştur. Numuneler işlenmiş ve yukarıda tarif edildiği gibi analiz (Şekil 1, Tablo 1, Tablo 2) ve etiket içermeyen miktar, elek ve XCMS çevrim için iki diferansiyel analizi platformlar üzerine yüklendi. Hit çok sayıda (Şekil 2, Şekil 3) diferansiyel analiz için kullanılan iki program tarafından tespit olmasına rağmen bu özellikleri muhtemelen eserler, kötü entegre zirveleri ve şüpheli analitik değer diğer özellikleri şunlardır. Bu uygun sinyal yoğunluğu, aynı grubun örnekleri, arka plan düzeyleri ve iyi kromatografik pik şekilleri (Şekil 3) arasında düşük varyasyon için hit tarama tarafından karar olabilir.
Downstre göstermek içinilk hit onay değilim, biz 3 ppm içinde bizim tedavi bileşik rotenone (Şekil 3, Şekil 4) karşılık gelen bir kitle ile bir özelliği izole. Biz UPLC-HR/tandem kütle eden numune spektrometrisi (MS / MS) ve saf bileşik (Şekil 5) ile bu analitin kimliğini teyit etmektedir. Ayrıca geçici olarak doğru kitle veritabanı arama (Şekil 3) ile D-pantethine olarak tanımlanan rotenone tedavi edilen grupta, azalmış bir farklı şekilde bol özelliği belirlemek.
Şekil 1. Mikrosprey UPLC-HRMS tarafından Numune Hazırlama ve Analiz Genel Deneysel Anahat. Iç standartları ve protein veya yağ / protein içeriği analiz isteğe bağlı giriş de dahil olmak üzere numune hazırlama genel bir anahat,. Farklı IO ile faz ayrılması, sıvı kromatografi ve analizkütle spektrometresi n modları özetlenmiştir.
Tablo 1. UPLC Koşullar. Genel ve bileşik optimize UPLC koşulları. Organik faz, 1, 1.8 35 bir ısıtıcı tutulur bir Waters C18 nanoACQUITY BEH130 kolonundan ul / dak 'lık sabit bir akış hızının ° C kullanıldı. Çözücü A:% 99.5% 0.1 formik asit, Çözücü B ile water/0.5% asetonitril: Organik faz 2 için% 98 asetonitril /% 0.1 formik asit ile% 2 su, bir Acentis Hızlı C8 kolonu boyunca 3.4 ml / dk 'lık sabit bir akış hızıyla 35 bir ısıtıcı tutulur ° C kullanıldı. Çözücü A:% 40% 0.1 formik asit ve 10 mM amonyum format, Çözücü B ile su/20% asetonitril:% 90 sulu faz için% 0.1 formik asit ve 10 mM amonyum format ile isopropanol/10% Asetonitril, sabit bir akış hızıyla 1.2 μ l / 35 bir ısıtıcı tutulur bir Waters C18 nanoACQUITY BEH130 kolonundan dakika ° C kullanıldı. % 95 metanol /% 0.1 amonyum hidroksit ile% 5 oranında su: Çözücü A:% 0.1 amonyum hidroksit, Çözücü B ile% 95 su /% 5 metanol.
Şekil 2. Ayna Arsa XCMS ile oluşturuldu. Tespit ve organik faz olumlu modu UPLC-MS analizi online XCMS ile sayısal olarak bir ayna arsa diferansiyel bol özellikler gösteren. Her nokta ayrı bir "özelliği" temsil eder. Kırmızı noktalar tedavisinde daha bol iken yeşil noktalar, kontrol (büyük entegre bölge) daha bol özellikleridir. Nokta boyutu artan grupları arasında katlı değişim artan büyüklüğü gösterir ve renk yoğunluğu artan renk doygunluğu ile azalan bir p-değeri gösterir.
Şekil 3,. Analitin Peaks. Organik faz pozitif iyon modu UPLC-MS analizi gösteren Kromatogramlar. ELEK 2.0. B akım A) düzeltildi (hizalanmış) Toplam iyon (TIC)) geçici XCMS ile D-pantethine olarak tanımlanan özelliği İyon Kromatografi Çıkarılan. C ) daha sonra TIC normalize ELEK gelen rotenone olarak tanımlanan özellik için XIC sonra ELEK. D rotenone olarak tanımlanan özelliği) için İyon Kromatografi Çıkarılan. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
pg "/>
Şekil 4. . A) İnsan metabolome Veritabanı (için Veritabanı Arama Sonuçları Veritabanı hit http://www.hmdb.ca ) ve B) ChemSpider / KEGG (ELEK yoluyla) (tek başına ChemSpider da kullanılabilir - http://www.chemspider.com ) bu iyonların belirlenmesi dayalı m / z 555.2516 ve 395.1481 en iyonları karşılık gelen Şekil 3B, 3C ve 3D gösterilen özellikler için doğru kitle tespitler kullanarak [MH] + tür. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. İK / MS / MS Structural Onay a.) benzer bir tutma süresi ve B) ile aynı ticari bir standart UPLC-MS/MS karşılaştırılmasına dayalı olarak rotenon 23.22 dakikalık bir tutma süresi ile birlikte 395,1481 m / z iyonuna tekabül eden özellik kimlik teyidi hemen hemen aynı parçalanma ile m / z (395.1481, ~ 0 ppm hata). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
| Kütle Spektrometre Parametre | Ayar | Yorum |
| Kaynak | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| İyon Model | Pozitif veya negatif | |
| Yöntem Uzunluk | Değişken (~ 40-60 dk) | |
| Karar | 60,000-100,000 | |
| Sprey (kV) | 1.75 | |
| Tüp Lens (V) | 130 | Bağımlı hedef bileşik |
| Kılcal Sıcaklık (° C) | 250 | Püskürtme ucunun ömrünü kısaltabilir |
| Kılcal Gerilim (V) | 50 | Bağımlı hedef bileşik |
| Veri Türü | Ağırlık merkezi | (Profil veri, Tartışma bakınız) |
Tablo 2'de. MS Ayarlar. Genel ve bileşik optimize edilmiş kütle spektrometresi ayarları Michrom Termo Advance esir sprey ESI kaynağı ile LTQ XL-Orbitrap için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hedefsiz metabolomik endojen veya ksenobiyotik biyotransformasyonları soruşturma, ya da ilgi örnek bir metabolik profil yakalamak için güçlü bir araç sunuyor. Çözünürlük ve hassasiyet, oluşturulan büyük veri setleri ile başa çıkmak için yeteneği örnek ayırmak ve analiz etmek için kullanılan teknoloji ve yararlı bilgiler (örneğin doğru kütle veritabanı arama) için veri kümesi benim için yeteneği ile teknik ölçeklerin çıktı. Son zamanlarda, bu yüksek çözünürlüklü kütle spektrometre ve gelişmeler ile kolaylaştırılmış ve yüksek ya da ultra-performans sıvı kromatografi edilmiştir. Diferansiyel analiz yazılımı analiz darboğaz ele almıştır ve uygun bilişim boru hattının yüksek verimli. 20,21,22 Seçim ile bekleme süresi vardiya, filtreleme, ve istatistiksel analiz için yüksek algılama ayarı yapabilirsiniz, algoritmalar centroiding veri olarak düşünceler içermelidir tepe algılama, tepe entegrasyonu, alignment, MS / MS verileri entegre yeteneği ve izotopları veya adducts ile başa çıkmak için yetenek. uygun cheminformatics veritabanları 23 seçimi de dikkate alınmalıdır. herhangi bir veritabanı 24,25,26,27 mevcut yetersizliği kapsamlı bileşikleri belirlemek ve entegre Tam Kütle verileri, MS / MS verileri, veya LC verileri alanında önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.
Burada yer akışı sıvı-sıvı ekstraksiyonu, mikro-akış sıvı kromatografisi ve bir hücre kültürü tedavi modeli gösterilmiştir iki farklı diferansiyel analiz yazılımı platformları ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi bütünleştirir. Ayrıca, ekstraksiyon protokolleri bu benzer analizi için yararlı bir örnek olarak hizmet olabilir, serum ve doku için listelenmiştir.
Hedefsiz metabolomik için kullanılan herhangi bir yöntem tekrarlanabilirlik, istikrarlı UPLC koşulları ve kaynak istikrar için optimize edilmelidir rağmen, bazı farklılıklar kaçınılmazdır. ELEK ve XCMS allo hemtutma zaman kaydırma, ama özel ilgi için w düzeltme deneyde belirlenen parametrelerin değişimi düzeltmek için yeterli olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Ayrıca, iç standart (lar) etiketli izotop kolayca eserler ve örnek çekimi veya LC-MS analizi farklılıklardan kaynaklanan arası örnek varyasyonu azaltmak için bu yordamı entegre edilebilir. Tüm hassas LC-MS yöntemi gibi 12, bu çok önemlidir yüksek saflıkta reaktifler kullanın ve numune hazırlama istenmeyen parçacık veya toplam kaldırır emin olmak için. Eserler kirleticileri normal bir varyasyon ile oluşturulabilir ve bu varsayılan isabet çıkarılması veya analiz sürecinin aslında her yerde bulunan kirletici olmayan onaylamak için istenebilecektir.
Yöntemi "hedefsiz" veya "tarafsız" metabolomik olarak etiketlenmiş olmasına rağmen Son olarak, bu kısmi bir yanlış isim. Ekstraksiyon, ayırma ve analiz doğası belirli karakteristikleri ile metabolitleri lehine olacakkütle spektrometresi kaynağında çıkarma, ayırma sırasında sabit ve mobil faz ile etkileşim ve iyonizasyon sırasında stabilite gibi tikler. 28,29,30 mevcut enstrümantasyon bağlı olarak, bu yordamı farklı çekimi, debi, LC baskılar adapte edilebilir , iyon kaynakları, veya kitle spektrometre. Bu nedenle, belirli koşullar genel bilgi ve ilgi moleküllerin bir sınıfın iç standartları temsil dayalı optimize edilebilir prosedür notları dahil ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz NIH hibe P30ES013508 ve 5T32GM008076 destek kabul. Ayrıca ELEK 2.0 ve Dr erişim için Thermo Scientific teşekkür ederim. Yararlı tartışmalar için Eugene Ciccimaro ve Thermo Scientific Mark Sanders.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
