Summary
अलक्षित metabolomics एक चयापचय प्रोफ़ाइल के स्नैपशॉट सृजन एक परिकल्पना प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल सीरम कोशिकाओं, या ऊतक से मेटाबोलाइट्स की निकासी और विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे. मेटाबोलाइट्स की एक श्रेणी तरल तरल चरण निष्कर्षण का उपयोग कर सर्वेक्षण कर रहे हैं, microflow ultraperformance तरल क्रोमैटोग्राफी / अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए युग्मित उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS).
Abstract
यहाँ हम सहित हित के जैविक नमूने लिए चयापचय प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक कार्यप्रवाह वर्तमान; कोशिकाओं, सीरम, या ऊतक. नमूना पहले एक तरल तरल चरण निष्कर्षण द्वारा ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय भागों में अलग, और आंशिक रूप से बहाव के विश्लेषण की सुविधा के लिए शुद्ध होता है. प्रारंभिक निष्कर्षण के जलीय (ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) और जैविक दोनों (गैर ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) चरणों मेटाबोलाइट्स के एक विस्तृत रेंज सर्वेक्षण करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं. मेटाबोलाइट्स उनके विभाजन के गुणों पर आधारित विभिन्न तरल क्रोमैटोग्राफी तरीकों से अलग हो रहे हैं. इस विधि में, हम (उत्तर प्रदेश) नियंत्रण रेखा के तरीकों microflow अति प्रदर्शन मौजूद है, लेकिन प्रोटोकॉल उच्च प्रवाह और कम दबाव के लिए स्केलेबल है. मास स्पेक्ट्रोमीटर में परिचय सामान्य या यौगिक अनुकूलित स्रोत की स्थिति में या तो के माध्यम से किया जा सकता है. आयनों की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए एक हाल ही में ग पर उच्च संकल्प का उपयोग करते हुए एक व्यापक मी / z सीमा पर सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में पूर्ण स्कैन मोड में किया जाता हैसाधन alibrated. लेबल मुक्त अंतर विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान प्लेटफार्मों पर किया जाता है. इस दृष्टिकोण के आवेदन चयापचय मार्ग स्क्रीनिंग, biomarker खोज, और नशीली दवाओं के विकास में शामिल हैं.
Introduction
HRMS के क्षेत्र में हाल ही में तकनीकी प्रगति के कारण, अलक्षित, परिकल्पना पैदा metabolomics दृष्टिकोण जटिल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण बन गए हैं. लाख प्रति दिनचर्या कम हिस्से की सुविधा 100,000 संकल्प (पीपीएम) जन सटीकता के लिए सक्षम 1 मास स्पेक्ट्रोमीटर व्यापक रूप से हो गए हैं कई विक्रेताओं से उपलब्ध है. 2,3 इस जन सटीकता अधिक से अधिक विशिष्टता और विश्लेष्य पहचान, समस्थानिक पैटर्न मान्यता, और अभिवर्तन पहचान की एक प्रारंभिक काम में विश्वास की अनुमति देता है. 4 एक उचित निकासी प्रक्रिया और उच्च प्रदर्शन नियंत्रण रेखा या UPLC, जटिल मिश्रण के साथ युग्मित अवधारण समय डेटा से प्राप्त अतिरिक्त विशिष्टता के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. 5 UPLC अधिक chromatographic दक्षता के पास है और जिसके परिणामस्वरूप बड़े डेटासेट किसी में एकीकृत किया जा सकता है संभव metabolome. 6 का एक बड़ा कवरेज बनाने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता, संकल्प और विश्लेषण समय की अनुमति देता हैकई अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और उपयोगी पैटर्न या ब्याज के व्यक्तिगत analytes के लिए खनन. 7,8,9,10,11 ख्यात हिट शुरू में चोटी का पता लगाने एल्गोरिदम का एक संयोजन, सटीक जन आधारित रासायनिक सूत्र भविष्यवाणी, विखंडन भविष्यवाणी का उपयोग कर पहचाना जा सकता है, और के रासायनिक डेटाबेस खोज. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है समय लेने वाली पूर्ण संरचनात्मक पहचान के लिए या अधिक संवेदनशील और अधिक विशिष्ट स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने के विकास के लिए लक्ष्य UPLC / चयनित या एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी / मात्रा का ठहराव के लिए वर्तमान सोने के मानक तरीके हैं कि एमएस पढ़ाई. 12 की प्राथमिकता
जैविक नमूने की बदलती प्रकृति मूत्र 13, 14 कोशिकाओं, सीरम 15, या ऊतक 16 के लिए निकासी प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए प्रेरित किया है. इस प्रोटोकॉल सुविधाओं एक्सट्रेक्शन कोशिकाओं, सीरम, और ऊतकों के लिए. जहां उपयुक्त हो, टिप्पणियों और अतिरिक्त संदर्भ संशोधन के लिए शामिल किया गया हैप्रक्रिया के माहौल स्थिर आइसोटोप के शामिल किए जाने का पता, या विशेष रूप से अस्थिर मेटाबोलाइट्स के शामिल किए जाने के लिए करने के लिए.
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Protocol
1. कोशिकाओं से नमूने निकालना
- कोशिकाओं की एक 10 सेमी की थाली के लिए: एक पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब में मीडिया में उठाया सेल निलंबन के 1.5 मिलीलीटर इकट्ठा. पक्षपाती लाइनों के लिए, कोशिकाओं को बर्फ पर रखा मीडिया के 1.5 मिलीलीटर में कोमल scraping के साथ उठाया जाना चाहिए वैकल्पिक:. आंतरिक मानकों का उपयोग किया जाता है, तो इस कदम पर एक उपयुक्त विभाज्य जोड़ें.
टिप्पणी: सेलुलर चयापचय के शमन कुछ मेटाबोलाइट्स के लिए महत्वपूर्ण है. समय के प्रति संवेदनशील मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए, ऐसी ठंड मेथनॉल निकासी प्रक्रियाओं के रूप में माना जाना चाहिए. 17 - नमूनों युक्त 10 एमएल ग्लास ट्यूब में से प्रत्येक को 6 क्लोरोफॉर्म की मिलीलीटर (CHCl 3) / मेथनॉल (सीएच 3 OH) (2:1, v / v) जोड़ें. 30 मिनट के लिए कम गति पर एक प्रकार के बरतन या बहु vortexer में नमूने निर्धारित करें. झटकों के बाद, नमूने 4 बजे 10 मिनट के लिए 1935 XG पर एक कम त्वरण / मंदी की स्थापना के साथ centrifuged हैं डिग्री सेल्सियस पूरी चरणों अलग करने के लिए.
वैकल्पिक 3 का उपयोग कर से बचने के लिए, एक्सट्रेक्शन (सीएच 2 सीएल 2) dichloromethane के साथ आयोजित किया जा सकता 18,12. - एक लंबे स्टेम पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक नया पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब जैविक (नीचे) परत हस्तांतरण. 4.1 पर जारी.
- बाद में एक साफ प्लास्टिक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में ऊपरी जलीय स्थानांतरण. नाइट्रोजन गैस के तहत नमूना लुप्त हो जाना. जलीय चरण desalting के लिए 2.6.2 पर जारी या प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए 4.1 जारी है.
2. सीरम से नमूना निकालना
- एक प्लास्टिक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सीरम के 20 μl स्थानांतरण वैकल्पिक:. आंतरिक मानकों का उपयोग किया जाता है, तो इस कदम पर एक उपयुक्त विभाज्य जोड़ें.
- 10 सेकंड के लिए सीएच 3 ओह, और भंवर के 190 μl जोड़ें.
- 10 सेकंड के लिए CHCl 3 और भंवर के 380 μl जोड़ें.
- चरण जुदाई प्रेरित करने के लिए एच 2 ओ के 120 μl जोड़ें. भंवर 10 सेकंड के लिए नमूनों और 10 के लिए आरटी पर संतुलित करने की अनुमतिमि.
- 4 में 10 मिनट के लिए 8000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस चरणों अलग करने के लिए.
- एक साफ प्लास्टिक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में कम जैविक चरण स्थानांतरण. 4.1 पर जारी.
- बाद में एक साफ प्लास्टिक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में ऊपरी जलीय स्थानांतरण. नाइट्रोजन गैस के तहत नमूना लुप्त हो जाना.
- 200 μl एच 2 ओ में नमूना फिर से निलंबित एसिड या आधार अभिकर्मकों (0.1% एसिटिक एसिड, चींटी एसिड या 0.1% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड) अधिमान्यतया पीएच संवेदनशील मेटाबोलाइट्स निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पूरी तरह से नमूना फिर से निलंबित करने के लिए बर्फ पर 20 मिनट के लिए Sonicate.
- 500 μl सीएच 3 ओह के साथ C18 स्पिन स्तंभों को सक्रिय करें.
- 500 μl एच 2 ओ के दो washes के साथ स्पिन स्तंभ संतुलित करना और तब नमूना लोड. एसिड / आधार अभिकर्मकों उपयोग किया जाता है धोने चरणों में यह एकाग्रता बनाए रखें.
- नमूना फीका बनाना करने के लिए 500 μl एच 2 ओ के साथ धोएं. एसिड / आधार अभिकर्मकों इस्तेमाल कर रहे हैं तो फिर, धोने में इस एकाग्रता बनाए रखने केकदम.
- एक पूर्व लेबल साफ 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में एच 2 ओ में 3 ओह सीएच 200 μl 80% के दो संस्करणों के साथ Elute. एसिड / आधार अभिकर्मकों इस्तेमाल कर रहे हैं तो फिर, धोने के चरणों में यह एकाग्रता बनाए रखें. 4.1 पर जारी.
3. ऊतक से नमूने निकालना
- ऊतक पर निर्भर करता है, जमे हुए ऊतक के 10-100 मिलीग्राम के बीच का उपयोग करें. एक बर्फ स्नान में पीबीएस के 1 मिलीलीटर (एम 1, 6.8 पीएच) के साथ एक पूर्व लेबल 2 मिलीलीटर कम प्रतिधारण Eppendorf ट्यूब के लिए ऊतक के पूरे टुकड़ा जोड़ें वैकल्पिक:. आंतरिक मानकों का उपयोग किया जाता है, तो जोड़ने से पहले, बफर में जोड़ ऊतक.
- प्रत्येक Eppendorf में 30 सेकंड के लिए एक बिजली के ऊतक बनाने की मशीन के साथ बर्फ में ऊतक homogenize. नमूने के बीच, क्रमशः, सीएच 3 ओह, और एच 2 ओ युक्त दो अलग ट्यूबों में ऊतक चक्की साफ.
- एक पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक प्लास्टिक विंदुक के साथ ऊतक homogenate स्थानांतरण. हस्तांतरण के बाद, प्रत्येक Eppendorf ट्यूब कुल्लासीएच 3 ओह के 1 मिलीलीटर के साथ 2x और ग्लास ट्यूब में ऊतक homogenate को धोने जोड़ें.
- ऊतक homogenate और सीएच 3 ओह धोने युक्त 10 एमएल ग्लास ट्यूब में से प्रत्येक के लिए CHCl 3 से 4 मिलीलीटर जोड़ें. 30 मिनट के लिए कम गति पर एक प्रकार के बरतन या बहु vortexer में नमूने निर्धारित करें.
- झटकों के बाद, पूरी तरह चरणों अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए 1935 XG पर एक कम त्वरण / मंदी की स्थापना के साथ नमूने अपकेंद्रित्र वैकल्पिक:. क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर से बचने के लिए, एक्सट्रेक्शन सीएच 2 सीएल 2 के साथ विकसित किया गया है.
- एक लंबे स्टेम पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक नया पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब जैविक (नीचे) परत हस्तांतरण. 4.1 पर जारी.
- एक लंबे स्टेम पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक नया पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब जलीय परत हस्तांतरण. Desalting के लिए 2.6.2 पर जाएं या 4.1 जारी है.
4. फिर से निलंबन और UPLC के लिए नमूने का निस्पंदन
- Samp लुप्त हो जानानाइट्रोजन गैस के नीचे लेस.
- पुनर्गठित वांछित UPLC विधि (1 टेबल देखें) के लिए शुरू कर समाधान का एक उचित मात्रा में नमूने नीचे सूख गया. 50-100 μl आमतौर पर एक वांछनीय फिर से निलंबन मात्रा है. धीरे भंवर और / या analytes भंग करने में सहायता करने के लिए नीचे नमूना विंदुक ऊपर और.
- नमूना पूरी तरह से फिल्टर (~ 5 मिनट) के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक ऊपर 14,000 XG करने पर 0.22 माइक्रोन नायलॉन ट्यूब फिल्टर और स्पिन में नमूना स्थानांतरण. नमूने में शेष precipitates नहीं दिखाई है कि वहाँ सुनिश्चित करें.
- डालने के साथ एक पूर्व लेबल UPLC शीशी में फ़िल्टर नमूना की सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. कैप शीशी, तो नमूना शीशी के नीचे से किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए शीशी झटका. ठंडा autosampler (4-5 डिग्री सेल्सियस) में नमूना रखें.
5. UPLC सेटअप
- तरल chromatograph के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, में सूचीबद्ध शर्तों के आधार पर जैविक नमूने के लिए एक रन बनाने के लिए
- UPLC पर्याप्त रूप से संतुलित करने की अनुमति दें. यह एक स्तंभ संलग्न है, और एक नया स्तंभ (आमतौर पर 3-5 स्तंभ संस्करणों) का संतुलन मात्रा के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करने से पहले सॉल्वैंट्स की एक पूरी भड़काना शामिल होना चाहिए. भविष्य की समस्याओं का निदान करने में मदद करने के लिए दबाव वापस शुरू करने की एक लॉग इन बनाए रखें.
6. मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटअप
- उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, 2 टेबल में सूचीबद्ध शर्तों का उपयोग कर एक सकारात्मक मोड विधि बनाने के लिए. तो फिर एक ही शर्तों का उपयोग, एक नकारात्मक मोड विधि बनाने वैकल्पिक:. लक्ष्य analytes की एक ज्ञात सेट उच्च पूर्णांक के हैंerest, अनुकूलन स्रोत और इन यौगिकों की भारी लेबल अनुरूप उपयोग कर प्रकाशिकी की स्थिति, और इन शर्तों का उपयोग कर एक विधि उत्पन्न करते हैं.
- साधन साफ और जांचना, स्पेक्ट्रोमीटर में एक स्थिर स्प्रे की स्थापना, और पर्याप्त रूप से स्रोत और प्रकाशिकी से फैलने के लिए अंशांकन समाधान के लिए समय की अनुमति. स्प्रे के स्वीकार्य स्थिरता नियंत्रण रेखा विधि का इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में एक ही प्रवाह दर पर अंशांकन समाधान के इंजेक्शन के साथ कम से कम 100 स्कैन से अधिक तीव्रता का RSD एक 3-5% देना चाहिए.
- सभी नमूनों के लिए अनुक्रम सेट करें, उचित इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करते हैं, और पहला नमूना से पहले एक खाली चला रहे हैं. नमूने के बीच भार या मैट्रिक्स प्रभाव पर शक कर रहे हैं, पर्याप्त कारतूस / धोने चला रहे हैं. नमूने विश्लेषण द्वारा पेश किसी भी बैच के प्रभाव से बचने के लिए एक यादृच्छिक संख्या जनरेटर और एक चाबी का उपयोग कर एक बेतरतीब ढंग से सेटअप किया जाना चाहिए.
टिप्पणी: संभावित ठिकानों की स्थिर आइसोटोप मानकों या विश्लेषणात्मक मानकों सहित गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने हो सकते हैंविश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और वैध परिणाम निवारण और सुनिश्चित करने में अत्यंत मूल्यवान. एक विलायक खाली इसके बाद मानक केवल नमूने के एक तकनीकी दोहराने रिक्त रन में संकेत तीव्रता और प्रतिधारण समय के विचलन, साथ ही भार तक पहुँचता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - अनुक्रम शुरू करते हैं और दबाव में उतार चढ़ाव, या रन के पार संकेत तीव्रता के नुकसान सहित समस्याओं के लिए समय - समय पर नजर रखने के. गंभीर समस्याओं का पता चलता है तो रन रोकने, और 6.2 से दोहराएँ.
7. अंतर विश्लेषण
- दो वर्कफ़्लोज़ इस प्रोटोकॉल के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. पहला चलनी 2.0, थर्मो फिशर द्वारा बेचा मालिकाना लेबल मुक्त अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के माध्यम से है. दूसरी कार्यप्रवाह अंतर विश्लेषण शुरू करने से पहले XCMS ऑनलाइन, स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट के माध्यम से एक स्वतंत्र मंच. 11 के माध्यम से है, मैन्युअल tics की जाँच करें या रन के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए नमूने में किसी भी नाम से जाना जाता यौगिक के लिए फ़िल्टर chromatograms को देखोऔर सभी के नमूने भर इंजेक्शन / UPLC / स्प्रे स्थिरता.
- चलनी
- मास स्पेक्ट्रोमीटर से चलनी स्थापित किया गया है जहां कार्य केंद्र की हार्ड ड्राइव करने के लिए. कच्चे डेटा फ़ाइलों को हस्तांतरण. (नोट: यह विश्लेषण की गति को सीमित कर सकते हैं के रूप में एक नेटवर्क या यूएसबी पोर्ट से जुड़ा ड्राइव पर संग्रहीत डेटा के साथ चलनी चल उचित नहीं है.)
- ओपन चलनी है, और एक नया प्रयोग शुरू करते हैं.
- चलनी में उपयुक्त फ़ाइलों को लोड करें.
- तुलना समूहों निरुपित और चलनी विश्लेषण के लिए मानकों को उत्पन्न करने के लिए अनुमति देने के लिए एक संदर्भ फ़ाइल का चयन करें.
- संकेत देता है और किसी भी व्यक्ति के प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुसार किसी भी पैरामीटर को समायोजित पालन करें. यह कड़े मानकों के साथ शुरू करते हैं और फिर वापस जाने के लिए और अधिक उदार सेटिंग्स विश्लेषण के समय को लंबा कर सकते हैं के रूप में मानकों को ढीला करने के लिए अक्सर सलाह दी जाती है.
- मानकों में सकारात्मक या नकारात्मक मोड के लिए सही अभिवर्तन सूची लोड.
- XCMS ऑनलाइन
- फ़ाइलों को परिवर्तितऑनलाइन XCMS के लिए एक स्वीकार्य प्रारूप में. हमारे मामले में, हम प्रारूप mzXML की. 19
- ओपन XCMS ऑनलाइन, और नौकरी बनाएँ.
- अपलोड और डेटासेट नाम है. केवल दो डेटासेट (जैसे नियंत्रण बनाम उपचार) खड़े अकेले XCMS सिर से सिर तुलना करने के लिए सीमित है के रूप में अपलोड किया जा सकता है.
- ड्रॉप डाउन सूची से इच्छित सेटिंग्स का चयन करें. पूर्व आबादी वाले मापदंडों के विभिन्न उपकरण की व्यवस्था के लिए उपलब्ध हैं, और इन आगे प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए संशोधित किया जा सकता है. हमारे मामले में, हम HPLC-Orbi2 सेटिंग्स का उपयोग करें.
- जमा करें और काम की पुष्टि करें.
- डेटा विश्लेषण
- विश्लेषण समाप्त हो गया है एक बार चलनी और XCMS लिए क्रमश फ्रेम और सुविधाओं की एक सूची, आबादी जाएगा. नियंत्रण रेखा संरेखण किसी भी ऐतिहासिक चोटियों overlays सुनिश्चित करें. Unaligned नियंत्रण रेखा रन के किसी भी ऐतिहासिक चोटियों में बड़े विचलन दिखाते हैं तो इस नमूने के साथ एक समस्या का संकेत हो सकता.
वैकल्पिक: आंतरिक मानकों इस्तेमाल कर रहे हैं तो चलनी के लिए, पता लगानेइसी शिखर समूह और चयनित फ्रेम करने के लिए मानक के अनुसार. ऑन लाइन XCMS के लिए, सामान्य बनाने के निर्यात के बाद एक स्प्रेडशीट में किया जा सकता है. - एक तरह नमूना जनसंख्या (जैसे नियंत्रण के नमूने) में भिन्नता के गुणांक (सीवी) द्वारा डेटा प्लॉट. कोई बड़ी सीवी मानों एक या एक से अधिक नमूने के साथ एक समस्या का संकेत हो सकता. वांछित लक्षण (जैसे पी मूल्य <0.05, मोड़ो बदलें> 1.5, एक समूह के भीतर कम मानक विचलन, आदि) के आधार पर सूची को सॉर्ट.
- समूहों में उपयुक्त शिखर संरेखण, शिखर एकीकरण, गाऊसी शिखर आकार, संकेत तीव्रता, आइसोटोप, और अभिवर्तन काम के लिए प्रत्येक चोटी की जांच करना.
- आगे के विश्लेषण के लिए वांछित के रूप में डेटा निर्यात करें या पुष्टि और एमएस एन प्रयोगों के लिए लक्षित जन सूची उत्पन्न करने के लिए.
- विश्लेषण समाप्त हो गया है एक बार चलनी और XCMS लिए क्रमश फ्रेम और सुविधाओं की एक सूची, आबादी जाएगा. नियंत्रण रेखा संरेखण किसी भी ऐतिहासिक चोटियों overlays सुनिश्चित करें. Unaligned नियंत्रण रेखा रन के किसी भी ऐतिहासिक चोटियों में बड़े विचलन दिखाते हैं तो इस नमूने के साथ एक समस्या का संकेत हो सकता.
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Representative Results
परिणाम प्रस्तुत कीटनाशक और mitochondrial परिसर मैं अवरोध rotenone साथ एसएच SY5Y glioblastoma कोशिकाओं का एक 6 घंटा उपचार से चयनित डेटा बताते हैं. संक्षिप्तता के लिए, केवल जैविक चरण सकारात्मक मोड डेटा प्रस्तुत किया है. नमूने संसाधित और ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण (चित्रा 1, 1 टेबल, टेबल 2) और लेबल से मुक्त मात्रा का ठहराव, चलनी और XCMS ऑनलाइन के लिए दो अंतर विश्लेषण प्लेटफार्मों पर लादा गया. हिट की एक बड़ी संख्या (चित्रा 2, चित्रा 3) के अंतर के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया दो कार्यक्रमों के द्वारा की पहचान कर रहे हैं हालांकि इन सुविधाओं संभावना कलाकृतियों, खराब एकीकृत चोटियों, और संदिग्ध विश्लेषणात्मक मूल्य की अन्य विशेषताओं में शामिल हैं. यह उचित संकेत तीव्रता, एक ही समूह के नमूने, पृष्ठभूमि के स्तर, और अच्छा chromatographic शिखर आकार (चित्रा 3) के बीच कम बदलाव के लिए हिट स्क्रीनिंग से आंका जा सकता है.
Downstre प्रदर्शित करने के लिएप्रारंभिक हिट की पुष्टि कर रहा हूँ, हम 3 पीपीएम के भीतर हमारे उपचार परिसर rotenone (चित्रा 3, चित्रा 4) के लिए इसी एक जन के साथ एक फीचर को अलग. हम UPLC-HR/tandem द्रव्यमान हमारे नमूना की स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) और शुद्ध यौगिक (चित्रा 5) के साथ इस analyte की पहचान की पुष्टि. हम भी अंतरिम रूप से सटीक जन डेटाबेस खोज (चित्रा 3) द्वारा डी pantethine के रूप में पहचान rotenone इलाज समूह में कम एक विभिन्न प्रकार से प्रचुर मात्रा में सुविधा पहचान.
चित्रा 1. Microspray UPLC-HRMS द्वारा नमूना तैयार करना और विश्लेषण के लिए जनरल प्रायोगिक रेखांकित करें. आंतरिक मानकों और प्रोटीन या लिपिड / प्रोटीन सामग्री के विश्लेषण के वैकल्पिक परिचय सहित नमूना तैयार करने की एक सामान्य रूपरेखा,. अलग कब से चरण जुदाई, तरल क्रोमैटोग्राफी, और विश्लेषणमास स्पेक्ट्रोमीटर में n मोड रेखांकित कर रहे हैं.
तालिका 1. UPLC स्थितियां. जनरल और यौगिक अनुकूलित UPLC शर्तों. जैविक चरण 1, 1.8 35 पर एक हीटर में रखा एक वाटर्स nanoACQUITY C18 BEH130 स्तंभ के माध्यम से μl / मिनट की निरंतर प्रवाह की दर के लिए डिग्री सेल्सियस इस्तेमाल किया गया था. सॉल्वेंट एक: 99.5% 0.1% चींटी एसिड, सॉल्वेंट बी के साथ water/0.5% acetonitrile: जैविक चरण 2 के लिए 98% acetonitrile / 0.1% चींटी एसिड के साथ 2% पानी, एक Acentis एक्सप्रेस C8 के कॉलम के माध्यम से 3.4 μl / मिनट की निरंतर प्रवाह की दर 35 पर एक हीटर में रखा डिग्री सेल्सियस इस्तेमाल किया गया था. सॉल्वेंट एक: 40% 0.1% चींटी एसिड और 10 मिमी अमोनियम स्वरूप, सॉल्वेंट बी के साथ water/20% acetonitrile: 90% जलीय चरण के लिए 0.1% चींटी एसिड और 10 मिमी अमोनियम स्वरूप के साथ isopropanol/10% acetonitrile, के निरंतर प्रवाह दर 1.2 μ एल / 35 पर एक हीटर में रखा एक वाटर्स nanoACQUITY C18 BEH130 स्तंभ के माध्यम से मिनट डिग्री सेल्सियस इस्तेमाल किया गया था. 95% मेथनॉल / 0.1% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 5% पानी: सॉल्वेंट एक: 0.1% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, सॉल्वेंट बी के साथ 95% पानी / 5% मेथनॉल.
चित्रा 2. मिरर प्लॉट XCMS साथ उत्पन्न. का पता चला और जैविक चरण सकारात्मक मोड UPLC-एमएस विश्लेषण से ऑनलाइन XCMS के माध्यम से मात्रा निर्धारित के रूप में एक दर्पण साजिश विभिन्न प्रचुर मात्रा में सुविधाओं दिखा. प्रत्येक डॉट एक विशिष्ट "सुविधा." का प्रतिनिधित्व करता है लाल डॉट्स उपचार में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं जबकि ग्रीन डॉट्स, नियंत्रण में (बड़ा एकीकृत क्षेत्र) अधिक प्रचुर विशेषताएं हैं. डॉट का आकार बढ़ाने से समूहों के बीच गुना परिवर्तन की बढ़ती भयावहता को इंगित करता है, और रंग की तीव्रता रंग की बढ़ती संतृप्ति के साथ एक कम पी मूल्य इंगित करता है.
चित्रा 3. Analyte चोटियों. जैविक चरण सकारात्मक आयन मोड UPLC-एमएस विश्लेषण दिखा chromatograms. चलनी 2.0. बी से मौजूदा एक) सही (गठबंधन) कुल आयन (घरेलू)) अंतरिम XCMS के माध्यम से डी pantethine रूप में पहचान की सुविधा के लिए आयन chromatogram निकाले. सी ) बाद में घरेलू के लिए सामान्यीकृत चलनी से rotenone के रूप में पहचान की सुविधा के लिए XIC बाद चलनी. डी से rotenone के रूप में पहचान की सुविधा) के लिए आयन chromatogram निकाले. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
स्नातकोत्तर "/>
4 चित्रा. . ए) मानव metabolome डाटाबेस (के लिए डेटाबेस खोज परिणाम डाटाबेस हिट http://www.hmdb.ca ) और बी) ChemSpider / KEGG (चलनी के माध्यम से) (अकेले ChemSpider भी नियोजित किया जा सकता है - http://www.chemspider.com ) के रूप में इन आयनों की पहचान के आधार पर मी / z 555.2516 और 395.1481 के आयनों को इसी आंकड़े 3 बी, 3 सी, और 3 डी में दिखाया सुविधाओं के लिए जन सटीक निर्धारण का उपयोग कर [महाराष्ट्र] + प्रजातियों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. मानव संसाधन / एमएस / एमएस एसtructural पुष्टि. ए) की तरह अवधारण समय और बी) एक ही साथ एक व्यावसायिक मानक के UPLC-MS/MS तुलना के आधार पर rotenone के रूप में 23.22 मिनट का अवधारण समय के साथ 395.1481 मी / z पर आयन को इसी विशेषता की पहचान की पुष्टि लगभग समान विखंडन के साथ मी / z (395.1481, ~ 0 पीपीएम त्रुटि). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| मास स्पेक्ट्रोमेट्री पैरामीटर | स्थापना | टिप्पणी |
| स्रोत | ईएसआई | Michrom CaptiveSpray |
| आयन मॉडल | सकारात्मक या नकारात्मक | |
| विधि लंबाई | परिवर्तनीय (~ 40-60 मिनट) | |
| संकल्प | 60,000-100,000 | |
| स्प्रे (केवी) | 1.75 | |
| ट्यूब लेंस (वी) | 130 | आश्रित लक्ष्य यौगिक |
| केशिका तापमान (डिग्री सेल्सियस) | 250 | स्प्रे टिप का जीवन कम हो सकता है |
| केशिका वोल्ट (वी) | 50 | आश्रित लक्ष्य यौगिक |
| डेटा प्रकार | केन्द्रक | (प्रोफ़ाइल डेटा के लिए, चर्चा देखें) |
तालिका 2. एमएस सेटिंग्स. जनरल और यौगिक अनुकूलित मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स एक Michrom थर्मो अग्रिम बंदी स्प्रे ईएसआई स्रोत के साथ LTQ एक्स्ट्रा लार्ज Orbitrap के लिए इस्तेमाल किया.
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Discussion
अलक्षित metabolomics अंतर्जात या जीनोबायोटिक biotransformations की जांच, या ब्याज का एक नमूना से एक चयापचय प्रोफाइल पर कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. संकल्प और संवेदनशीलता उत्पन्न बड़े डेटासेट के साथ सौदा करने की क्षमता का नमूना अलग और विश्लेषण करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है, और उपयोगी जानकारी (जैसे जन सटीक डेटाबेस खोज) के लिए डाटासेट मेरे लिए क्षमता के साथ तकनीक तराजू का उत्पादन. हाल ही में, इस उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर के क्षेत्र में प्रगति से मदद की, और उच्च या अति प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी किया गया है. अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर विश्लेषण टोंटी संबोधित किया गया है, और उचित सूचना पाइपलाइन के उच्च throughput. 20,21,22 चयन के साथ प्रतिधारण समय पाली, फ़िल्टरिंग, और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए चोटी का पता लगाने समायोजन हासिल कर सकते हैं, एल्गोरिदम centroiding डेटा के रूप में विचारों को शामिल करना चाहिए चोटी का पता लगाने, शिखर एकीकरण, alignmenटी, एमएस / एमएस डेटा को एकीकृत करने की क्षमता, और आइसोटोप या adducts के साथ सौदा करने की क्षमता. उचित cheminformatics डेटाबेस के 23 चुनाव में भी विचार किया जाना चाहिए. किसी विशेष डेटाबेस की 24,25,26,27 वर्तमान अपर्याप्तता व्यापक यौगिकों की पहचान करने और एकीकृत करने के लिए जन सटीक डाटा, एमएस / एमएस डेटा, या नियंत्रण रेखा डेटा क्षेत्र में एक प्रमुख समस्या बनी हुई है.
यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह तरल तरल निष्कर्षण, सूक्ष्म प्रवाह तरल क्रोमैटोग्राफी, और एक सेल संस्कृति उपचार मॉडल में प्रदर्शन दो अलग अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म के साथ उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री एकीकृत करता है. इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रोटोकॉल इन इसी तरह के विश्लेषण के लिए उपयोगी नमूने के रूप में सेवा कर सकता है के रूप में, सीरम और ऊतक के लिए सूचीबद्ध हैं.
अलक्षित metabolomics के लिए इस्तेमाल किसी भी विधि repeatability, स्थिर UPLC की स्थिति, और स्रोत स्थिरता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए हालांकि, कुछ बदलाव अपरिहार्य है. चलनी और XCMS allo दोनोंअवधारण समय पाली, लेकिन विशेष ध्यान देने के लिए डब्ल्यू सुधार प्रयोग में निर्धारित मापदंडों भिन्नता सही करने के लिए पर्याप्त हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. इसके अलावा, आंतरिक मानक (एस) लेबल स्थिर आइसोटोप आसानी कलाकृतियों और नमूना एक्सट्रेक्शन या नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण में मतभेद की वजह से अंतर - नमूना भिन्नता को कम करने के लिए इस प्रक्रिया में एकीकृत किया जा सकता है. सभी संवेदनशील नियंत्रण रेखा एमएस पद्धति के रूप में 12, यह महत्वपूर्ण है उच्च शुद्धता अभिकर्मकों का उपयोग करें, और नमूना तैयार अवांछनीय बात कण या कुल निकालता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. कलाकृतियों दूषित पदार्थों में सामान्य बदलाव से उत्पन्न किया जा सकता है, और यह ख्यात हिट निकासी या विश्लेषण की प्रक्रिया के तथ्य सर्वव्यापक दूषित पदार्थों में नहीं कर रहे हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए वांछनीय हो सकता है.
विधि "अलक्षित" या "निष्पक्ष" metabolomics रूप में चिह्नित है, हालांकि अंत में, यह एक आंशिक मिथ्या नाम है. निष्कर्षण, जुदाई, और विश्लेषण की प्रकृति कुछ characteris साथ मेटाबोलाइट्स के पक्ष में होगामास स्पेक्ट्रोमीटर के स्रोत पर निष्कर्षण, जुदाई के दौरान स्थिर और मोबाइल चरणों के साथ बातचीत, और आयनीकरण के दौरान स्थिरता सहित tics. 28,29,30 उपलब्ध उपकरण पर निर्भर करता है, इस प्रक्रिया के विभिन्न एक्सट्रेक्शन, प्रवाह दर, नियंत्रण रेखा के दबाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है , आयन सूत्रों, या मास स्पेक्ट्रोमीटर. इसलिए, हम कुछ शर्तों के सामान्य ज्ञान या ब्याज के अणुओं के एक वर्ग की आंतरिक मानकों प्रतिनिधि के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, जहां प्रक्रिया में नोटों को शामिल किया है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम एनआईएच अनुदान P30ES013508 और 5T32GM008076 के समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम भी चलनी 2.0 और डीआरएस के उपयोग के लिए थर्मो वैज्ञानिक धन्यवाद. उपयोगी विचार विमर्श के लिए यूजीन Ciccimaro और थर्मो वैज्ञानिक के मार्क सैंडर्स.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
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