Summary
Målrettede metabolomics giver en hypotese genererer øjebliksbillede af en metabolisk profil. Denne protokol vil demonstrere ekstraktion og analyse af metabolitter fra celler, serum eller væv. En række metabolitter undersøges ved hjælp af væske-væske fase ekstraktion, Microflow ultraperformance væskekromatografi / høj opløsning massespektrometri (UPLC-HRMS) koblet til differential analyse software.
Abstract
Her præsenterer vi en arbejdsproces til at analysere de metaboliske profiler til biologiske prøver af interesse, herunder, celler, serum eller væv. Prøven først adskilles i polære og ikke-polære fraktioner ved en væske-væske fase ekstraktion, og delvist oprenset for at lette downstream analyse. Både vandige (polære metabolitter) og organisk (ikke-polære metabolitter) faser af indledende ekstraktion behandles for at undersøge en bred vifte af metabolitter. Metabolitter adskilt af forskellige flydende kromatografiske metoder baseret på deres partition egenskaber. I denne metode, præsenterer vi Microflow ultra-performance (UP) LC-metoder, men protokollen er skalerbar til højere strømme og lavere tryk. Introduktion i massespektrometret kan være gennem enten generelle eller sammensatte optimerede kilde betingelser. Påvisning af en bred vifte af ioner udføres i fuld scanning i både positiv og negativ modus over et bredt m / z rækkevidde ved hjælp af høj opløsning på en nylig calibrated instrument. Label-fri differentieret analyse udføres på bioinformatik platforme. Anvendelser af denne fremgangsmåde omfatter metaboliseringsvej screening, biomarkør opdagelse og udvikling af lægemidler.
Introduction
Grund af de seneste teknologiske fremskridt inden for HRMS har målrettede, hypotese-genererende metabolomics tilgange blevet en realistisk tilgang til analyse af komplekse prøver. 1 massespektrometre stand 100.000 resolution lette rutinemæssig lave del per million (ppm) masse nøjagtighed blevet bredt tilgængelige fra flere leverandører. 2,3 Denne masse nøjagtighed tillader større specificitet og tillid i en indledende tildeling af analyt identitet, isotop mønstergenkendelse og adduct identifikation. 4. Når kombineret med en passende ekstraktionsprocedure og højtydende LC eller UPLC, komplekse blandinger kan analyseres med ekstra specificitet stammer fra fastholdelse tid data. 5. UPLC besidder større kromatografisk effektivitet og giver større følsomhed, opløsning og analyse tid på at gøre en større dækning af metabolomet muligt. 6. De resulterende store datasæt kan integreres i ethvertaf multiple differential analyse software og udvindes til nyttige mønstre eller individuelle analytter af interesse. 7,8,9,10,11 Formodede hits kan i første omgang identificeres ved hjælp af en kombination af peak detekteringsalgoritmer, præcis masse baseret kemiske formel forudsigelse, fragmentering forudsigelse og kemisk database søgning. Denne fremgangsmåde giver mulighed for prioritering af mål for tidskrævende fuldstændig strukturel identifikation eller af udvikling af mere følsomme og mere specifikke stabil isotopfortynding UPLC / udvalgte eller multipel reaktion overvågning / MS undersøgelser, som de nuværende guld standard metoder til kvantificering. 12.
De forskellige former for biologiske prøver har ført til optimering af udvinding protokoller for urin 13 celler 14, serum 15 eller væv 16. Denne protokol funktioner ekstraktioner for celler, serum og væv. I givet fald har kommentarer og yderligere henvisninger er medtaget for ændrintioner af proceduren for at løse inddragelse af stabile isotoper, eller om optagelse af særligt ustabile metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Sample Udtræk fra Cells
- For en 10 cm plade af celler: indsamle 1,5 ml løftet cellesuspension i medier i en præ-mærket 10 ml glas centrifugerør. For vedhængende linjer bør celler løftes med blide skrabning i 1,5 ml af medier holdes på is Valgfrit:. Hvis de interne standarder anvendes, tilsættes en passende portion på dette trin.
Kommentar: Bratkøling af cellulær metabolisme er afgørende for visse metabolitter. Til analyse af tidsfølsomme metabolitter, bør procedurer såsom kulde methanolekstraktion overvejes. 17. - Tilføj 6 ml chloroform (CHCl3) / methanol (CH3OH) (2:1, v / v) til hver af de 10 ml glasrør med prøver. Indstil prøverne i en shaker eller flere vortexer på lav hastighed i 30 min. Efter omrystning prøverne centrifugeres med en lav acceleration / deceleration indstilling ved 1.935 xg i 10 minutter ved 4 ° C til fuldstændig adskille faserne.
Valgfri CHCI3 kan ekstraktioner udføres med dichlormethan (CH 2 Cl 2) 18,12. - Ved hjælp af en lang stilk Pasteur pipette den organiske (bund) lag overføres til en ny pre-mærket 10 ml glas centrifugerør. Fortsæt til 4.1.
- Overfør den øvre vandige senere i en ren plast 2 ml Eppendorf-rør. Fordampe prøven under nitrogengas. Fortsæt med at 2.6.2 for vandfasen afsaltning eller fortsætte til 4,1 til direkte analyse.
2.. Sample Udtræk fra Serum
- Overfør 20 ul serum i en plastik 2 ml Eppendorf rør Valgfrit:. Hvis de interne standarder anvendes, tilsættes en passende portion på dette trin.
- Tilføj 190 pi CH3OH og vortex i 10 sek.
- Tilføj 380 ul CHCI3 og vortex i 10 sek.
- Tilføj 120 ul H2O at fremkalde faseseparation. Vortex prøverne i 10 sek og lad ligevægt ved stuetemperatur i 10min.
- Centrifuger prøverne ved 8000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at adskille faserne.
- Overfør lavere organisk fase i en ren plast 2 ml Eppendorf-rør. Fortsæt til 4.1.
- Overfør den øvre vandige senere i en ren plast 2 ml Eppendorf-rør. Fordampe prøven under nitrogengas.
- Genopslæmmes prøven i 200 pi H 2 O. Syre eller base reagenser (0,1% eddikesyre, myresyre eller 0,1% ammoniumhydroxid) kan anvendes til fortrinsvis at udtrække pH-følsom metabolitter. Sonikeres i 20 min på is for at re-suspendere prøven helt.
- Aktiver C18 spinsøjler med 500 ul CH3OH.
- Ækvilibrere centrifugesøjle med to vasker af 500 pi H 2 O og derefter indlæse prøven. Hvis syre / base reagenserne anvendes opretholde denne koncentration i vasketrinnene.
- Vask med 500 pi H 2 O for at afsalte prøven. Igen, hvis syre / base reagenser anvendes opretholde denne koncentration i vasktrin.
- Der elueres med to volumener af 200 pi 80% CH3OH i H2O i en præ-mærket rent 2 ml Eppendorf-rør. Igen, hvis syre / base reagenser anvendes opretholde denne koncentration i vasketrinnene. Fortsæt til 4.1.
3.. Sample Udsugning fra Tissue
- Afhængigt af væv, mellem 10-100 mg frosset væv bruge. Tilsæt hele stykke væv til en præ-mærket 2 ml lav tilbageholdelse Eppendorf-rør med 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) i et isbad Valgfrit:. Hvis de interne standarder anvendes, tilføje det i bufferen, før tilsætning vævet.
- Homogenisere vævet i is med en elektrisk vævsformaler i 30 sek i hver Eppendorf. Mellem prøverne, rengøre vævsformaler i to separate rør indeholdende CH3OH og H2O, hhv.
- Overfør vævshomogenatet med en plastik pipette en pre-mærket 10 ml glas centrifugerør. Efter overførslen, skylles hver Eppendorf rør2x med 1 ml CH3OH og tilføj vaskene til vævshomogenatet i glasrør.
- Tilsæt 4 ml CHCl3 til hver af de 10 ml glasrør indeholdende vævshomogenatet og CH3OH vaske. Indstil prøverne i en shaker eller flere vortexer på lav hastighed i 30 min.
- Efter omrystning prøverne centrifugeres med en lav acceleration / deceleration indstilling ved 1.935 xg i 10 min til helt adskille faserne Valgfrit:. At undgå at bruge kloroform har ekstraktioner blevet udviklet med CH 2 Cl 2.
- Ved hjælp af en lang stilk Pasteur pipette den organiske (bund) lag overføres til en ny pre-mærket 10 ml glas centrifugerør. Fortsæt til 4.1.
- Ved hjælp af en lang stilk Pasteur pipette det vandige lag overføres til en ny pre-mærket 10 ml glas centrifugerør. Gå til 2.6.2 for afsaltning eller fortsætte med at 4.1.
4.. Resuspension og Filtrering af prøver for UPLC
- Inddampes Samples under nitrogengas.
- Opløs tørret ned prøver i et passende volumen af udgangsopløsningen for den ønskede UPLC metode (se tabel 1). 50-100 pi er normalt en ønskelig resuspension volumen. Forsigtigt vortex og / eller pipette prøven op og ned for at hjælpe med at opløse analytter.
- Overfør prøven i et 0,22 um nylon rør filter og centrifugering ved op til 14.000 xg indtil prøven er helt har passeret gennem filteret (~ 5 min). Sørg for, at der ikke er nogen synlige udfældninger tilbage i prøven.
- Supernatanten overføres af den filtrerede prøve i en præ-mærket UPLC hætteglas med indsatsen. Cap hætteglas, og svirp hætteglasset for at fjerne eventuelle bobler fra bunden af prøven hætteglasset. Prøven anbringes i den afkølede autosampleren (4-5 ° C).
5.. UPLC Setup
- Brug af kontrol software til væskekromatograf skabe en køre for det organiske stikprøve baseret off af de betingelser, der er anført i
- Lad UPLC i tilstrækkelig ligevægt. Dette bør omfatte en komplet priming af opløsningsmidler, før du sætter en kolonne, og følge producentens anvisninger for ligevægt volumen af en ny kolonne (normalt 3-5 kolonnevolumener). Opretholder en log over at starte igen pres for at hjælpe med at diagnosticere problemer i fremtiden.
6.. Mass Spectrometer Setup
- Brug af kontrol software til den høje opløsning massespektrometer, at skabe en positiv indstilling med anvendelse af betingelserne anført i tabel 2. Derefter bruger de samme vilkår, skabe en negativ tilstand metode Valgfrit:. Hvis kendt sæt målanalytter er af høj intpåløbne, optimere kilde og optik forhold med den tunge mærkede analog af disse forbindelser, og generere en fremgangsmåde under anvendelse af disse betingelser.
- Rengør og kalibrere instrumentet etablere en stabil spray i spektrometeret og give tid til kalibreringsopløsningens tilstrækkeligt spredes fra kilden og optik. Acceptable stabilitet spray bør give en 3-5% RSD af intensitet over mindst 100 scanninger med injektion af kalibreringsopløsning i samme flow som LC metode der anvendes.
- Opsæt sekvensen for alle prøver, sæt passende injektionsvolumen og køre en tom før den første prøve. Hvis afsmittende eller matrix effekter mellem prøver mistanke køres tilstrækkelige blanks / skylninger. Prøver bør være setup i en randomiseret måde ved hjælp af et tilfældigt tal generator og en nøgle til at undgå batch effekter indført ved analyse.
Kommentar: Kvalitet kontrolprøver, herunder stabile isotop standarder eller analytiske standarder for sandsynlige mål kan væreyderst værdifulde ved fejlfinding og sikre pålidelige, reproducerbare, og gyldige resultater. En teknisk gentagelse af en standard kun prøve efterfulgt af et opløsningsmiddel blank kan anvendes til adgang afvigelse af signalet intensitet og opholdstid samt overførsel i det tomme løb. - Begynd sekvens og overvåge jævnligt for problemer, herunder tryksvingninger eller tab af signal intensitet på tværs af løb. Hvis der opstår alvorlige problemer opdages, stop løb og gentage proceduren fra 6.2.
7.. Differential Analyse
- To arbejdsgange er præsenteret for denne protokol. Den første er gennem sigte 2,0, proprietær label-fri differentieret analyse software sælges af Thermo Fisher. Den anden arbejdsgang er gennem XCMS Online, en gratis platform gennem Scripps Research Institute. 11. Før differentieret analyse manuelt at kontrollere tics eller se på filtrerede kromatogrammer for alle kendte stof i prøven for at sikre reproducerbarhed kørslerog indsprøjtning / UPLC / spray stabilitet i alle prøverne.
- SIEVE
- Overfør. Rådatafiler fra massespektrometer til harddisken på den arbejdsstation, hvor SIEVE er installeret. (Bemærk: der kører sigte med data lagret på en netværks-eller USB-port tilsluttede drev er ikke tilrådeligt, da det kan begrænse hastigheden for analyse.)
- Åbent sigte, og begynde et nyt eksperiment.
- Ilæg det relevante filer i sigte.
- Tildel sammenligningsgrupper og vælge en enkelt henvisning fil, så SIEVE for at generere de parametre til analyse.
- Følg anvisningerne, og justere enhver parametre pr krav af nogen enkelt eksperiment. Det er ofte tilrådeligt at starte med strenge parametre, og derefter gå tilbage og løsne de parametre som flere generøse indstillinger kan forlænge analyse tid.
- Læg den rigtige adduct liste for positiv eller negativ indstilling i parametrene.
- XCMS Online
- Konvertere fileri et acceptabelt format for XCMS Online. I vores tilfælde, konvertere vi mzXML format. 19.
- Åbne XCMS Online og Opret Job.
- Upload og navngive datasæt. Kun to datasæt (f.eks Kontrol vs Treatment) kan uploades som XCMS stand-alone er begrænset til head-to-head sammenligninger.
- Vælg de ønskede indstillinger fra drop-down listen. Pre-befolkede parametre er tilgængelige for forskellige instrumentering opsætninger, og disse kan modificeres yderligere til forsøg behov. I vores tilfælde bruger vi de HPLC-Orbi2 indstillinger.
- Indsend og bekræft job.
- Dataanalyse
- For Si og XCMS en liste af rammer og funktioner, henholdsvis vil blive befolket når analysen er færdig. Sørg for, at LC tilpasning overlejrer nogen skelsættende toppe. Hvis nogen af de unaligned LC kørsler viser stor afvigelse i banebrydende toppe det kan indikere et problem med prøven.
Valgfrit: For sigte, hvis de interne standarder anvendes, lokalisereden tilsvarende top gruppen og normalisere til den valgte ramme. For XCMS On-line, kan normalisering gøres i et regneark efter eksport. - Plot dataene ved variationskoefficient (CV) inden for en lignende stikprøve (f.eks kontrolprøver). Eventuelle store CV værdier kan indikere et problem med en eller flere prøve. Sortere listen baseret på ønskede egenskaber (f.eks p-værdi på <0,05, Fold Skift> 1,5, lav standardafvigelse inden for en gruppe, osv.).
- Undersøg hver top for passende peak tilpasning på tværs af grupperne, peak integration, Gauss topform, signal intensitet, isotoper og adduct opgave.
- Eksportere data som ønsket for yderligere analyse eller til at generere målrettede masse lister for bekræftelse og MS n eksperimenter.
- For Si og XCMS en liste af rammer og funktioner, henholdsvis vil blive befolket når analysen er færdig. Sørg for, at LC tilpasning overlejrer nogen skelsættende toppe. Hvis nogen af de unaligned LC kørsler viser stor afvigelse i banebrydende toppe det kan indikere et problem med prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De præsenterede resultater viser udvalgte data fra en 6 timers behandling af SH-SY5Y glioblastomceller med pesticidet og mitokondrie kompleks jeg inhibitor rotenon. For kortheds skyld, er det kun den organiske fase positive tilstand data præsenteres. Prøverne blev behandlet og analyseret som beskrevet ovenfor (figur 1, tabel 1, tabel 2) og sat på to differential analyse platforme til etiket-fri kvantificering, Si og XCMS online. Selv om et stort antal hits (figur 2, figur 3) er identificeret ved de to programmer, der bruges til differentieret analyse af disse funktioner omfatter sandsynlige artefakter, dårligt integrerede toppe, og andre funktioner af tvivlsom analytisk værdi. Dette kan bedømmes ved at screene de hits for passende signal intensitet, lav variation mellem prøver af samme koncern, baggrundsniveauer, og god kromatografisk top figurer (figur 3).
For at demonstrere downstream bekræftelse af indledende hits, vi isolerer en funktion med en masse svarende til vores behandling sammensatte rotenon indenfor 3 ppm (figur 3, figur 4). Vi bekræfte identiteten af denne analyt med UPLC-HR/tandem massespektrometri (MS / MS) i vores prøve, og den rene forbindelse (figur 5). Vi også identificere en differentielt rigelige træk reduceret i rotenon behandlede gruppe, forsøgsvis identificeret som D-pantethine ved nøjagtig masse databasesøgning (figur 3).
Figur 1. General Experimental Skitse til Prøveforberedelse og analyse af Microspray UPLC-HRMS. En generel oversigt over prøveforberedelse, herunder den valgfrie indførelse af interne standarder og protein eller lipid / proteinindhold analyse. Faseseparation væskekromatografi, og analyse af forskellige ion tilstande i massespektrometer er skitseret.
Tabel 1. UPLC betingelser. Generelle og sammensatte optimerede UPLC betingelser. For organisk fase 1, konstant strømningshastighed på 1,8 ul / min gennem en Waters nanoACQUITY C18 BEH130 kolonne holdt i et varmelegeme ved 35 ° C blev anvendt. Opløsningsmiddel A: 99,5% water/0.5% acetonitril med 0,1% myresyre, opløsningsmiddel B: 98% acetonitril / 2% vand med 0,1% myresyre For organiske fase 2, konstant strømningshastighed på 3,4 ul / min gennem en Acentis Express C8-søjle holdt i et varmeapparat ved 35 ° C blev anvendt. Opløsningsmiddel A: 40% vand/20% acetonitril med 0,1% myresyre og 10 mM ammoniumformiat, opløsningsmiddel B: 90% isopropanol/10% acetonitril med 0,1% myresyre og 10 mM ammoniumformiat For vandige fase, konstant strømningshastighed på 1,2 μ l / min gennem en Waters nanoACQUITY C18 BEH130 kolonne holdt i et varmelegeme ved 35 ° C blev anvendt. Opløsningsmiddel A: 95% vand / 5% methanol med 0,1% ammoniumhydroxid, opløsningsmiddel B: 95% methanol / 5% vand med 0,1% ammoniumhydroxid.
Figur 2. Mirror Plot Dannet med XCMS. Et spejl plot viser forskelligt rigelige funktioner påvises og kvantificeres gennem XCMS online fra den organiske fase positive tilstand UPLC-MS analyse. Hver prik repræsenterer en særlig "funktion." Grønne prikker er funktioner mere rigelige (større integrerede område) i kontrollen, mens røde prikker er mere rigelige i behandlingen. Øget størrelse af prik angiver stigende størrelsen af fold skift mellem grupperne, og intensiteten af farven indikerer en faldende p-værdi med den voksende mætning af farve.
Figur 3. Analyt Peaks. Kromatogrammer viser den organiske fase positiv ion-mode UPLC-MS analyse. A) berigtiget (aligned) Samlet ion strøm (TIC) fra SIEVE 2.0. B) udvundet ionkromatogram for funktionen tentativt identificeret som D-pantethin gennem XCMS. C ) udvundet ionkromatogram for funktionen senere identificeret som rotenon fra si. D) XIC for funktionen senere identificeret som rotenon fra SIEVE normaliseret til TIC. Klik her for at se større figur .
pg "/>
Figur 4.. . Database Søgeresultater Database hits for A) human metabolomet Database ( http://www.hmdb.ca ) og b) ChemSpider / KEGG (via sigte) (ChemSpider alene kan også være ansat - http://www.chemspider.com ) ved hjælp af nøjagtige masse bestemmelser for de funktioner er vist i figur 3B, 3C og 3D svarende til ioner med m / z 555,2516 og 395,1481 baseret på identifikation af disse ioner som [MH] + arter. Klik her for at se større figur .
Figur 5. HR / MS / MS Structural Bekræftelse. Bekræftelse af identifikation af funktionen svarer til ion ved 395.1481 m / z med en retentionstid på 23,22 min som rotenon baseret på UPLC-MS/MS sammenligning med en kommerciel standard med A) lignende retentionstid og B) den samme m / z (395.1481, ~ 0 ppm fejl) med næsten identisk fragmentering. Klik her for at se større figur .
| Massespektrometri Parameter | Indstilling | Kommentar |
| Source | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Model | Positiv eller Negativ | |
| Metode Længde | Variabel (~ 40-60 min) | |
| Opløsning | 60,000-100,000 | |
| Spray (kV) | 1.75 | |
| Tube Lens (V) | 130 | Target Compound Afhængig |
| Kapillær Temperatur (° C) | 250 | Kan forkorte levetiden af sprøjtedyser |
| Kapillær Voltage (V) | 50 | Target Compound Afhængig |
| Datatype | Tyngdepunkt | (Til Profil data, se diskussionen) |
Tabel 2. MS-indstillinger. Generelt og sammensatte optimerede massespektrometer indstillinger anvendes til LTQ XL-Orbitrap med en Michrom Thermo Advance fangenskab spray ESI kilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målrettede metabolomics tilbyder et kraftfuldt værktøj til at undersøge endogene eller miljøfremmede biotransformationer, eller indfange en metabolisk profil fra en prøve af interesse. Udgangen af teknikken skalaer med opløsning og følsomhed af den teknologi, der anvendes til at adskille og analysere prøverne, evnen til at håndtere de store genererede datasæt, og evnen til at udvinde datasættet for nyttige oplysninger (f.eks nøjagtige masse database søgning). For nylig har dette blevet fremmet af fremskridt i høj opløsning massespektrometre, og high-eller ultra-performance væskekromatografi. Differential analyse software har behandlet analysen flaskehals, og kan udrette topdetektion justering for fastholdelse tidsforskydninger, filtrering og statistisk analyse med high-throughput. 20,21,22 Valg af korrekt informatik rørledningen bør omfatte overvejelser om data centroiding algoritmer, topdetektion, peak integration, alignment, evne til at integrere MS / MS data og evnen til at håndtere isotoper eller addukter. 23. Valg af passende cheminformatics databaser bør også overvejes. 24,25,26,27 Den nuværende utilstrækkelige nogen særlig database til omfattende identificere forbindelser og integrere Nøjagtig masse data, MS / MS-data, eller LC data fortsat et stort problem på området.
Arbejdsgangen præsenteres her integrerer væske-væske-ekstraktion, mikro-flow væskekromatografi, og højopløsningsmassespektrometri med to forskellige differentiale analyse software platforme demonstreret i en cellekultur behandling model. Derudover er ekstraktionsprotokoller anført for serum og væv, da disse kan tjene som nyttige prøver til lignende analyse.
Selvom enhver metode, der anvendes til ikke-målrettede metabolomics bør optimeres for repeterbarhed, stabile UPLC forhold, og source stabilitet, en vis variation er uundgåelig. Både si og XCMS allow korrektion for opholdstid skift, men særlig opmærksomhed skal rettes mod at sikre, at de parametre, der i forsøget er tilstrækkelige til at korrigere variation. Desuden kan stabil isotop mærket intern standard (er) let kan integreres i denne procedure for at reducere artefakter og inter-sample variation skyldes forskelle i prøven ud eller LC-MS-analyse. 12. Som med alle følsomme LC-MS metode, er det afgørende at bruge reagenser med høj renhed, og sikre, at prøveforberedelsen fjerner uønsket partikler eller aggregat. Artefakter kan blive genereret af normal variation i forureninger, og det kan være ønskeligt at bekræfte, at formodede hits ikke er i virkeligheden allestedsnærværende kontaminanter i udvinding eller analyseprocessen.
Endelig, selv om metoden er mærket som "målrettede" eller "neutral" metabolomics, dette er en delvis misvisende. Arten af udvinding, separation og analyse vil favorisere metabolitter med visse kendetegntics, herunder stabilitet under ekstraktion, interaktion med stationære og mobile faser under separation, og ionisering ved kilden til massespektrometer. 28,29,30 Afhængigt af den tilgængelige instrumentering, kan denne procedure tilpasses forskellige ekstraktioner, strømningshastigheder, LC pres , ionkilder eller massespektrometre. Derfor har vi medtaget noter i den procedure, hvor visse betingelser kan optimeres baseret på generel viden eller interne standarder repræsentant for en klasse af molekyler af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte til NIH tilskud P30ES013508 og 5T32GM008076. Vi takker også Thermo Scientific for adgang til SIEVE 2.0 og Drs. Eugene Ciccimaro og Mark Sanders Thermo Scientific for nyttige drøftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
