Summary
Drosophila S2-celler og dyrkede neuroner er gode systemer til billeddannelse af motordreven organel transport in vivo. Her beskriver vi detaljerede protokoller til dyrkning både celletyper, deres billedbehandling og analyse af transport.
Abstract
Drosophila S2-celler belagt på et dækglas i tilstedeværelsen af actin-depolymerisering drug danne lange ugrenede processer fyldt med ensartet polariserede mikrotubuli. Organeller bevæge sig langs disse processer af mikrotubuli motorer. Nem vedligeholdelse, høj følsomhed til RNAi-medieret protein knock-down og effektiv procedure for at skabe stabile cellelinjer gøre Drosophila S2-celler en ideel model for at studere godstransport via direkte billedvisning. De opnåede resultater med S2-celler kan yderligere anvendes til en mere fysiologisk relevant system: axonal transport i ubearbejdet neuroner dyrket fra dissocierede Drosophila embryoner. Dyrkede neuroner vokse lange neuritter fyldt med bundtede mikrotubuli, meget ligner S2 processer. Ligesom i S2-celler, kan organeller i dyrkede neuroner visualiseres ved enten organel-specifik fluorescerende farvestoffer eller ved anvendelse af fluorescerende organel markører kodes af DNA injiceret i tidlige embryoner eller udtrykkes i transgenic fluer. Derfor kan organel transport let optages i neuroner dyrket på dækglas anvender levende billeddannelse. Her beskriver vi procedurer for dyrkning og visualisere godstransport i Drosophila S2-celler og primære neuroner. Vi mener, at disse protokoller gør begge systemer tilgængelige for laboratorier studerer godstransport.
Introduction
Drosophila S2-celler har vundet stigende popularitet til at studere mange cellulære processer. Disse celler blev oprindeligt stammer fra trypsinerede sene embryoner af OregonR Drosophila melanogaster og vedligeholde makrofaglignende funktioner 1.. Drosophila S2-celler har mange fordele frem for andre cellelinjer. De dyrkes ved 25 ° C uden CO 2, og kan afbildes i mange timer ved stuetemperatur uden behov for opvarmning eller gasudveksling. Endnu vigtigere er, Drosophila S2-celler er meget følsomme over for RNAi behandling giver høj effektivitet knockdown af proteiner af interesse. S2-celler er yderst transficerbare og kan vælges stabile cellelinier mindre end fire uger for at tillade stabil ektopisk ekspression af proteiner af interesse. S2-celler normalt vokse enten løst tilknyttet, men ikke spredes på en kolbe eller i suspension. De kan induceres til at spredes på dækglas belagt med en plante lectin concanavalin A (ConA). Periferien af de spredte celler er specielt tynd og derfor er ideel til levende celler mikroskopi. Detaljerede protokoller for S2-celler kultur, RNAi behandling levende lys billeddannelse og immunfarvning kan findes i litteraturen 2,3. Vores laboratorium har vedtaget S2-celler som et modelsystem til at studere mikrotubulus-baserede godstransport. Drosophila-S2-celler behandlet med et lægemiddel, som depolymeriserer eller skærer F-actin, såsom cytochalasin D (CytoD), vokser lange processer fyldt med ensartet polariserede mikrotubuli 4 -10, hvilket gør det til et ideelt system til at studere last bevægelse langs mikrotubuli arrays. Forskellige parametre for transport i disse processer (. Dvs. fremskrivning længder, hastigheder, retningsbestemmelse osv.) kan let måles ved hjælp af automatiserede partikel-tracking software, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Disse egenskaber gør S2-celler en tiltalende system til at studere godstransport langs mikrotubuli i vævsdyrkningsceller.
Pilotforsøg i S2-celler kan udvides til en fysiologisk vigtig model for transporterende studier i Drosophila primære neuroner. Svarende til S2-celler, neuroner dyrket fra dissocierede embryoner er permeabel for små molekyler, såsom farvestoffer og inhibitorer og høj opløsning til billeddannelse af organel transport kan udføres i neuroner ved stuetemperatur. Brug Drosophila med forskellige genetiske baggrunde, kan vi undersøge gen-funktion i ubearbejdet neuroner på knockout (genetiske tab af funktion mutationer), knockdown (dsRNA injektion eller udtryk) eller ektopisk udtryk (transgene fluer). Konkret betyder fragmentering af actin filamenter hjælp CytoD behandling ikke forhindre neuritudvækst, men i stedet de vokser hurtigere, og dermed kan vi studere mikrotubuli-dependent organel transport CytoD-behandlede neuroner uden indflydelse af actinfilamenter 11. Derfor primære neuronale kulturer kombinere fordelene ved vævsdyrkningsceller og flyve genetik, hvilket gør det en stor system til at studere godstransport i en fysiologisk relevant system, 10,12. Da flere familiær neurodegenerative sygdomme kan være forårsaget af eller associeret med transportenheder defekter (fx Parkinsons sygdom 13, Huntingtons sygdom 14. Alzheimers sygdom 15,16, Amyotrofisk Lateral Sclerose / ALS 17, HMN7B og Perry syndrom 18,19, og spinocerebellar ataksi typen 5/SCA5 20), kan primære neuronale kulturer være nyttige i analysen af virkningerne af specifikke mutationer forårsager disse sygdomme på mikrotubuli-afhængige transport.
Endelig er der vigtige egenskaber ved mikrotubuli-afhængige transport velbevaret mellem pattedyr og fluer, men
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila S2-celler
Fremstilling af ConA overtrukne dækglas
- Placer dækglas i en keramisk rack og vaske dem med chromsyre nedsænkning i 1 time. [ADVARSEL: chromsyre er ætsende og kan forårsage irritation af øjne, næse, hals og hud].
- Skyl dækglas grundigt med konstant kører dH2O i 30 min, indtil den sure er helt vasket ud.
- Lad dækglas lufttørring og belægge dem med ConA (opløsning 0,5 mg / ml i dH2O) i 30 min.
- Skyl dækglas med dH2O i 15 minutter og lad dem lufttørre. ConA coatede dækglas kan gemmes op til 1 måned.
Udpladning af celler
- Tillad S2-celler til eksponentielt vokse i T25 eller T75 cm2 kolber afhængigt af antallet af celler, der kræves til eksperimentet.
- Tæl celledensiteten ved hjælp af et hæmocytometer. Tilsæt 1 ml vækst medium (f.eks Insect-Xpress) i en 35 mm vævskulturskål med ConA-belagt dækglas, og forsigtigt overføre ~ 1 x 10 5 celler til fadet. Denne celle tæthed er optimal for billedbehandling, fordi processer fra forskellige celler ikke overlapper hinanden.
- For at inducere dannelse af processer, umiddelbart efter udpladning tilsættes 1 ml medium med 5 uM CytoD i skålen (til en slutkoncentration på 2,5 uM CytoD). Tillade fuld udvikling af processer ved at inkubere cellerne i mindst 2 timer ved 25 ° C, før billeddannelse.
2.. Drosophila Primær neuronkultur
Forberedelse til neuron kultur
- Forbered Drosophila neuronal vækstmedium (Schneider medium suppleret med: 20% føtalt bovint serum, varmeinaktiveret ved 55 ° C i 30 min, 5 ug / ml insulin, 100 ug / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 ug / ml tetracyclin) . Denne supsuppleret Schneiders medium kan opbevares ved 4 º C i 6 måneder.
- Forbered æblejuice agar hætteglas til opsamling Drosophila embryoner (22,5 g agar, 12,0 g sukker og 750 ml H 2 O i en 2-liters kolbe, autoklave 20-25 min, tilsæt 250 ml æblejuice og hæld ~ 10 ml i hver Drosophila hætteglasset, efter størkning, plug hætteglas med vatkugler, og wrap hætteglas med plastic mad wrap for at undgå over tørring af fødevarer). Æblesaft i agar hætteglas kan opbevares ved 4 º C i godt forseglede plastposer til 4 uger.
- Frakke syrevaskede 25 mm cirkel dækglas med ConA (se detaljer i protokollen om Drosophila S2-celler), og sterilisere dem under UV-lys i 10-15 min. Disse dækglas kan opbevares i en måned.
Drosophila embryonale neuron kultur
- Hold unge voksne fluer i æblesaft agar hætteglas suppleret med tørgær i 1-2 dage før indsamlingen embryoner feller neuron præparat.
- På indsamling dag, for at synkronisere de indsamlede embryoner voksen overførsel flyver til en frisk æblesaft agar hætteglas i 1 time precollection i lys og kassere disse embryoner.
- Overførsel flyver til en ny æblejuice agar hætteglas, indsamle embryoner til 1 time, og overføre fluerne til en anden hætteglasset til en anden time, både i mørke at øge udbyttet foster.
- Fjern voksne fluer fra æblejuice agar hætteglas og lad embryoner udvikle yderligere 4 timer til trin 9-11 ved stuetemperatur (4-6 hr gamle embryoer er mellem trin 9-11).
- Fjern embryoner ved at sprøjte vand ind i hætteglas og løsne embryoner fra æblesaft agar med en lille pensel (der kræves mindst 10 embryoner til en god neuron prep).
- Overfør embryoner til en 100 um nylonnet cellefilter med en overførsel pipette til at dræne vand (forskylningen overførselspipetten i Drosophila embryo vaskebuffer, 0,4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Saml embryoner fra sien med en lille pensel, og overføre dem til et 1,5 ml mikrorør fyldt med 1 ml Drosophila embryo vask (Bemærk: rengøre agar eller bomuldsfibre hjælp af pensel eller pipettespidser). I denne protokol, 1,5 ml mikrorør leveres med et matchende engangs pille pistil.
- Vask embryoner i Drosophila embryo vask 3x.
- Dechorionate embryoner i en frisk 1:1-opløsning af kommerciel blegemiddel og 95% ethanol i 10 min [ADVARSEL: blegemiddel kan forårsage irritation af øjne, næse, hals og hud].
- Flyt til vævskultur hætte, og vaske embryoer 2x i suppleret Schneiders medium.
- Lad 200-300 pi medium i røret med embryonerne, og forsigtigt mekanisk dissociere dechorionated embryoner hjælp Kimble Chase engangs pellet pestles som er blevet steriliseret med 70% ethanol (male 10-15x).
- Centrifuger homogeniserede blanding ved 20 g i 2 minutter og transfer supernatanten til et frisk rør. [Dette trin er valgfrit, det hjælper til at fjerne embryo vragrester]
- Centrifugeres supernatanten ved 550 g i 2 minutter for at pelletere cellerne.
- Pellet resuspenderes i 500 pi suppleret Schneiders medium og spin-celler ned igen ved 550 xg i 2 min, gentag resuspension-spinning cyklus én gang.
- Endelig pellet resuspenderes i ~ 100 pi suppleret Schneider medium og plade cellerne på en 25 mm ConA-belagt dækglas i en steril 35 mm petriskål. Inkuber i 10 minutter for at tillade cellebinding.
- Tilsæt 2 ml suppleret Schneiders medium, med 5 uM CytoD at oversvømme dækglasset med vedhæftede celler.
- Inkubér fadet i en befugtet 25 º C inkubator natten før billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila S2-celler, der er knyttet på Cona-belagt dækglas spredes ind i en flad rund "pandekage" form (figur 1A og 1C). Men når S2-celler udsået på dækglas i overværelse af CytoD og lov til at sprede for 2-3 timer, danner de lange tynde processer fyldt med parallelle mikrotubuli (figur 1B og 1D). Disse mikrotubuli har ensartet polaritet med plus-ender ud 7. Time-lapse fluorescens billeddannelse af Drosophila S2 stabilt udtrykker mCherry-tubulin viser, at processer er meget dynamisk, især i de første 60 min efter vedhæftet fil (figur 2). Efter 1 times inkubation, deres vækst bremser og 2-3 timers inkubation sikrer, at størstedelen af cellerne er fuldt udvoksede processer. Her viser vi to repræsentative eksempler på organel transport langs mikrotubuli i S2-celler, lysosomer (mærket med lysoTracker, 200 nm, 3A-B 7 (stabil transfektion med Pac-GFP-SKL, Tal 3D-E). Time-lapse billeder af celler blev udtaget hver 1 sekund til 61 rammer ved hjælp af et Nikon TU-2000 inverteret mikroskop udstyret med en perfekt Fokussystem (Nikon), og Coolsnap CCD kamera (Roper Scientific) drevet af Metamorph software. En 100 W halogen lyskilde blev anvendt til fluorescens-excitation at minimere fotoblegning og fototoksicitet. Hver af de 61 frames i sekvens blev farvekodet i henhold til baren på øverste højre og billeder blev overlejret at generere farvekodede spor. Således bevæger partikler genereret regnbue spor, mens stationære partikler optrådte hvid 10. ImageJ plug-in Temporal Farve-kode ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) blev anvendt til denne behandling. Til kvantitativ analyse af organel bevægelse vi brugte DiaTrack software (Semasopht Inc.), vælger vi kunorganeller, der er lokaliseret i processer, fordi de let kan spores, og polariteten af mikrotubuli spor er kendt. Tal 3C og 3F viser typiske fordelinger af retrograd og anterograd hastigheder opnået ved lysosomer og peroxisomer sporing, hhv.
Lignende teknikker bruges i vores laboratorium til analyse af organel transport i primære dyrkede neuroner. Neuroner er en fremherskende celletype i blandede kulturer opnået fra trin 9-11 embryoner. Efter natten over dyrkning de er nemme at genkende med karakteristisk celleform med neuritter, der er over 50 um lang (figur 4A). Disse celler er også positive for den pan-neuronal markør, Elav 21 (figur 4B og 4B). Processer i neuroner er fyldt med mikrotubuli (figur 4B og 4B "). Vi kan spore organel transport langs neurites hjælp af techniques beskrevet ovenfor for S2-celler. Mitokondrier kan mærkes med mitokondrie-GFP (Mito-GFP) under kontrol af en motor neuron-specifik promotor D42 22 (figur 5A og 5A), og peroxisomer kan markeres ved injektion af DNA kodende for en peroxisom målrettet mCherry 7 i syncytial blastodermstadiet embryoer (figur 5B og 5B «).
Figur 1.. Drosophila S2 proces dannelse induceret af CytoD. (A, C) Drosophila S2-celler vedhæfte og spredes i tromle og runde former, når forgyldt i ConA-belagt dækglas. (B, D) S2-celler udpladet i nærvær af 2,5 mM CytoD danner lange processer fyldt med mikrotubuli efter 3 timers inkubation. <strong> AB og CD er transmitteret lys og fluorescerende mCherry-mærket tubulin billeder, hhv. Scale bar, 10 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Tidsforskydning af processer vækst i en Drosophila S2-celle. Fluorescens time-lapse af en Drosophila S2-celle, der udtrykker mCherry-tubulin i nærværelse af 2,5 uM CytoD. Tallene angiver tiden efter cellen tillægger dækglasset. Målestokken, 5 um. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Organel transport i Drosophila S2-celler. (AC) Lysosom bevægelse i Drosophila S2-celle. Et repræsentativt 1 min-Lysosom transport (mærket med 200 nM lysoTracker) i en celle (A, DIC billede) repræsenteret ved den kunstige Temporal-kode (skabt af Fiji) (B). Hastigheder opnået fra analysen af Lysosom bevægelse spores i processer (DiaTrack, 663 partikler i 23 celler) (C). (DF) Peroxisome bevægelse i Drosophila S2-celle. Et repræsentativt 1 min-peroxisom transport (mærket med pMT-GFP-SKL) i en celle (D, DIC billede) repræsenteret ved den kunstige Temporal-kode (skabt af Fiji) (E). Hastigheder opnået fra analysen af peroxisome bevægelse spores i processer (DiaTrack, 228 partikler i 20 celler) (F). Bemærk, at lysosomer flytte med længere og hurtigere forløb end peroxisomer. Målestokken, 5 um. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Primær Drosophila neuroner fra natten over kultur. (A) En overnatning dyrkede Drosophila neuron har karakteristisk neuronal morfologi med lange neuritter. (B) Neuron udtrykte en pan-neuronal markør, Elav (rød i B og hvid i B ', DSHB, 7E8A10, 1:100), og med lange neuritter fyldt med mikrotubuli (grønt B og hvide i B'', DM1α , 1:1000). Målestokken, 5 um. nk "> Klik her for at se større billede.
Figur 5. Organel transport i dyrkede Drosophila-neuroner. (A) Mitokondrier i en dyrket Drosophila neuron præget af Mito-GFP under kontrol af en motor neuron-specifik promotor, D42. (A) 5 min-mitokondrie bevægelse i (A) er repræsenteret ved den kunstige Temporal-Farvekode (skabt af Fiji). (B) Peroxisomer i en kultiveret Drosophila neuron præget af Pac-SKL-mCherry, injiceret i tidlige syncytial blastodermstadiet embryoner. (B ') 2 min-peroxisome bevægelse i (B) er repræsenteret ved den kunstige Temporal-Farvekode (skabt af Fiji). Målestokken, 5 um.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
| Organel | Beskrivelse |
| Peroxisomer | Peroxisomal målretning signal 1 tripeptid (SKL), mærket med en FP 25 |
| Mitokondrier | Mitokondrie målretning sekvens af cytochrom c oxidase subunit VIII tagget med en FP 26 |
| Mitokondrier | MitoTracker (Dye som akkumuleres i aktiv mitokondrier) 27 |
| Lysosomer | LysoTracker (Dye, som akkumuleres i cellulærerum med lav indre pH) 28 |
Tabel 1. Mest almindelige organel mærkningsordninger strategier.
Denne tabel opsummerer de mest almindelige organel mærkningsordninger strategier i vævskulturceller, herunder mærkning af peroxisomer, mitokondrier og lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi detaljerede protokoller for at studere mikrotubuli-afhængig godstransport i Drosophila S2-celler og primære neuron kultur. Både S2 processer og neurites er strukturer fyldt med bundtede mikrotubuli arrays, der tjener som spor til organel transport.
To strategier er typisk anvendt til at mærke organeller: transfektion af vektorer, der koder for et fluorescerende protein med en organel-targeting sekvens eller farvning med fluorescerende farvestoffer tilsat direkte til kulturer. Almindelige eksempler på fragt etiketter er anført i tabel 1. Forbigående transfektion eller RNAi behandlinger af Drosophila S2-celler om nødvendigt udføres i suspension 4,6,7,9,10 før celler udplades på dækglas til billeddannelse.
For at få pålidelige resultater i S2 celle eksperimenter, er det vigtigt at holde følgende punkter i tankerne:
- Plate cellerne ved optimal tæthed til billeddannelse. Høj hulefoldighed vil resultere i overlapning af processer fra forskellige celler, mens lav densitet celler har dårlig rentabilitet og er i stand til at danne processer.
- Tillad S2-celler helt udvikle processer. Vi rutinemæssigt inkuberes celler for 2 timer efter plettering men inkubationstid på op til 24 timer kan udføres, hvis det er nødvendigt.
- S2-celler skal behandles med CytoD før de tillægger ConA coatede dækglas. Tilføjelse af lægemidlet efter cellerne er bundet, vil ikke fremkalde processer formation.
- Ved anvendelse af farvestoffer, ændre prøver til billeddannelse hver 20-25 min, langvarig inkubering af celler med enten MitoTracker eller lysoTracker er toksisk for cellerne.
- Vi plejer at spore godstransport i S2-celler ved billeddannelse til 1 min ved 1 billede / sek. Under denne betingelse celler ikke er tilgængeligt beskadigede.
- Kun analysere organel bevægelse i celleprocesser. Organel tæthed i cellen kroppen er for høj for pålidelig sporing og polaritet af bevægelsen ikke let kunne bestemmes.
I denne protokol, kan du blive nødt til at betale opmærksomhed til flere vigtige nedenstående trin:
- Stage embryoner korrekt. De indsamlede embryoner skal synkroniseres og trinvis til trin 9-11, hvor neuroblast delaminering fra ektodermen opstår. Staging embryoner for tidligt eller for sent, kan resultere i færre neuroblaster i hvert embryo og dermed manglende høst neuroner af de dissocierede embryoner.
- Dechorionate embryoner til højre grad (alle embryoner skifter farve fra helt hvid til mere gennemsigtig). Under-dechorionation kunne føre til vanskeligheder i embryo dissociation, mens over-dechorionation kan beskadige embryoner. Decemberhorionated embryoner bliver meget klistret og blød, og dermed forsøge at undgå pipettering eller røre embryoner med pipettespidser løbet vasketrinene før dissociation.
- Vær særlig opmærksom på embryoner dissociation. Vi finder, at plast engangs pellet pestles og matchende mikrorør giver bedre dissociation end et glas dounce homogenisator, især for mindre antal embryoner. Under-dissociation vil efterlade store celleklynger, mens over-dissociation vil føre til celler fordeling og massiv ophobning af cellerester. Justér dissociation niveau i henhold til de embryonale numre.
- Plating neuron på dækglas til en rimelig tæthed. Overfyldte neuroner normalt udvikle meget korte neuritter, mens sparsomme neuroner ofte undlader at overleve.
Derudover har vi bemærket, at det primære cellekulturer indeholder ofte muskelceller og blodceller. Behandling natten over med CytoD hjælper med at reducere antallet af muskelceller og blodlegemer, og fremmes neuritudvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af Gelfand lab, der har bidraget til udviklingen af disse protokoller. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Science af National Institutes of Health under tildelingen nummer R01GM052111 til VIG og baskiske regering Department of Education, universiteter og forskning under tildeling nummer BFI-2011-295 til UDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
