Summary
Drosophila S2 celler og kultiverte nevroner er gode systemer for avbildning av motordrevet organelle transport in vivo. Her beskriver vi detaljerte protokoller for dyrking av begge celletyper, deres avbildning og analyse av transport.
Abstract
Drosophila S2 celler belagt på et dekkglass i nærvær av noen aktin-depolymerisering narkotika danner lange unbranched prosesser fylt med jevnt polarisert mikrotubuli. Organeller bevege seg langs disse prosessene ved microtubule motorer. Enkelt vedlikehold, høy følsomhet for RNAi-mediert protein knock-down og effektiv prosedyre for å skape stabile cellelinjer gjør Drosophila S2 celler en ideell modell system for å studere transport av varer av levende avbildning. Resultatene oppnådd med S2 celler resultatene kan videre brukes på en mer fysiologisk relevant system: aksonal transport i primære nerveceller dyrket fra dissosiert Drosophila embryoer. Dyrkede nerveceller vokser lange neurites fylt med medfølgende mikrotubuli, svært lik S2 prosesser. Som i S2-celler, organeller kan i dyrkede neuroner visualiseres ved enten organellespesifikk fluorescerende fargestoffer eller ved hjelp av fluorescerende markører organelle kodet av DNA injiseres i tidlige embryoer eller uttrykt i transgenic flyr. Derfor kan organelle transport være lett registreres i nerveceller dyrket på glass dekkglass ved hjelp av levende bilder. Her beskriver vi prosedyrer for dyrking og visualisere transport av varer i Drosophila S2 elementer og nevroner. Vi tror at disse protokollene gjøre begge systemer tilgjengelig for laboratorier som studerer transport av varer.
Introduction
Drosophila S2 celler har fått økende popularitet for å studere mange cellulære prosesser. Disse cellene ble opprinnelig hentet fra trypsinisert sent stadium embryoer fra OregonR Drosophila melanogaster og vedlikeholde makrofag-lignende funksjoner en. Drosophila S2 celler har mange fordeler fremfor andre cellelinjer. De er dyrket ved 25 ° C uten CO2 og kan avbildes i mange timer ved romtemperatur uten behov for varme-eller gassutveksling. Enda viktigere, Drosophila S2 celler er svært følsomme for RNAi behandling slik at høy effektivitet knockdown av proteiner av interesse. S2-celler er svært transfectable og stabile cellelinjer kan velges mindre enn fire uker for å tillate stabil ektopisk ekspresjon av proteiner av interesse. S2-celler som normalt vokser enten løst festet, men ikke spredt på en kolbe eller i suspensjon. De kan bli overtalt til å spre seg på dekkglass-belagt med en plante lectin concanavalin A (ConA). Periferien av de spredte celler er særlig tynn og derfor er ideell for levende celle mikroskopi. Detaljerte protokoller for S2 celler kultur, RNAi behandling, levende lys bildebehandling og farging kan bli funnet i litteraturen 2,3. Laboratoriet er innført S2-celler som et modellsystem for å studere microtubule baserte transport av varer. Drosophila S2-celler som ble behandlet med en hvilken som helst medikament som depolymerizes eller Severs F-aktin, så som cytokalasin D (CytoD), vokser lange prosesser fylt med jevnt polarisert mikrotubuli 4 -10, noe som gjør det til et ideelt system for å studere last bevegelse langs microtubule arrays. Ulike parametre for transport i disse prosessene (. Dvs. baner lengder, hastigheter, retnings etc) lett kan måles ved hjelp av automatisert partikkel-sporing, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Disse egenskapene gjør S2-celler til et attraktivt system for å studere transport av varer langs mikrotubuli i vevskultur-celler.
Pilot eksperimenter i S2-celler kan bli utvidet til et fysiologisk viktig modell av transport-last studier i Drosophila primære neuroner. I likhet med S2-celler, nerveceller dyrket fra dissosierte embryoer er gjennomtrengelig for små molekyler slik som fargestoffer og-inhibitorer, og høy oppløsning direkte avbildning av organelle transport kan utføres i nevroner ved romtemperatur. Ved hjelp av Drosophila med ulike genetiske bakgrunn, kan vi undersøke gen-funksjon i primær nevroner på knockout (genetiske tap-av-funksjon mutasjoner), knockdown (dsrna injeksjon eller uttrykk) eller ektopisk uttrykk (transgene fluer). Konkret betyr fragmentering av aktin filamenter som bruker CytoD behandling ikke hindre neurite utvekst, i stedet de vokser raskere, og dermed kan vi studere microtubuli-dependent organelle transport i CytoD-behandlede neuroner uten påvirkning av aktin filamenter 11.. Derfor primære nevrale kulturer kombinere fordelene med vevskulturceller og fly genetikk, noe som gjør det til et godt system for å studere transport av varer i en fysiologisk relevant system 10,12. Siden flere familiære nevrodegenerative sykdommer kan være forårsaket av eller assosiert med cargo transport defekter (f.eks Parkinsons sykdom 13, Huntingtons sykdom 14, Alzheimers Disease 15,16, Amyotrofisk lateral sklerose / ALS 17, HMN7B og Perry syndrom 18,19, og Spinocerebellar ataksi typen 5/SCA5 20), kan det primære nevronale kulturer være nyttig ved analyse av virkningene av spesifikke mutasjoner som forårsaker disse sykdommene på mikrotubulus-avhengige transport.
Til slutt, er viktige egenskaper for microtubule avhengig transport godt bevart mellom pattedyr og fluer, men
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Drosophila S2 celler
Utarbeidelse av ConA belagt dekkglass
- Plasser Dekk i en keramisk stativ og vask dem med kromsyre nedsenking i 1 time. [FORSIKTIG: kromsyre er etsende og kan forårsake irritasjon av øyne, nese, hals og hud].
- Skyll Dekk grundig med stadig kjører dH 2 O i 30 min før syren er helt vasket ut.
- Let Dekklufttørke og belegge dem med ConA (0,5 mg / ml oppløsning i dH 2 O) i 30 min.
- Skyll Dekk med dH 2 O for 15 min og la dem lufttørke. ConA belagt Dekk kan lagres i opp til en måned.
Plating cellene
- Tillat S2-celler eksponensielt til å vokse i T25 eller T75 cm 2 kolber, avhengig av antall celler som kreves for forsøket.
- Telle celletetthet ved hjelp av et hemocytometer. Tilsett 1 ml vekst medium (for eksempel Insekt-Xpress) inn i en 35 mm vev kultur parabolen med ConA-belagt dekkglass, og forsiktig overføre ~ 1 x 10 5 celler til parabolen. Denne celletettheten er optimal for bildebehandling fordi prosesser fra ulike celler ikke overlapper hverandre.
- For å kunne indusere dannelse av prosesser, umiddelbart etter plating legge 1 ml medium med 5 uM CytoD til fatet (til den endelige konsentrasjon på 2,5 uM CytoD). Tillat fulle utvikling av prosesser ved å inkubere cellene i det minste i 2 timer ved 25 ° C, før avbildning.
2. Drosophila Primær Neuron Kultur
Forberedelse til nevron kultur
- Forbered Drosophila neuronal vekstmedium (Schneider medium supplert med 20% føtalt bovint serum, varme-inaktivert ved 55 ° C i 30 min, 5 ug / ml insulin, 100 pg / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 10 ug / ml tetracyklin) . Denne støttenplemented Schneiders medium kan lagres ved 4 º C i seks måneder.
- Forbered eplejuice agar hetteglass for å samle Drosophila embryoer (22,5 g agar, 12,0 g sukrose og 750 ml H 2 O i en 2-liters kolbe; autoklav for 20-25 min, tilsett 250 ml eplejuice og hell ~ 10 ml i hver Drosophila hetteglass, etter størkning, plugg ampuller med bomull baller, og pakk ampuller med plast mat brytes for å unngå over tørking av mat). Eplejuice i agar ampuller kan oppbevares ved 4 º C i godt forseglede plastposer for fire uker.
- Coat syrevasket 25 mm sirkel Dekk med ConA (se detaljer i protokollen for Drosophila S2 celler) og sterilisere dem under UV-lys for 10-15 min. Disse Dekk kan lagres i en måned.
Drosophila embryonale nevron kultur
- Hold ung voksen flyr i eplejuice agar ampuller supplert med tørrgjær i 1-2 dager før innsamling av embryoene teller nevron forberedelse.
- På den samle dag, for å synkronisere de innsamlede embryoer, fluer overføring til en frisk voksen eplejuice agar ampulle i 1 time precollection i lys og kaste disse embryoer.
- Transfer flyr til en ny eplejuice agar hetteglass, samle embryoer for en time, og overføre fluene til en annen beholder for en time, både i mørket for å øke embryo yield.
- Fjern den voksne fluer fra eplejuice agar hetteglass og la embryoene utvikler en annen 4 hr å etapper 9-11 ved romtemperatur (4-6 hr gamle embryoer er mellom scene 9-11).
- Fjern embryoene ved squirting vann i ampuller og løsne embryoer fra eplejuice agar med en liten pensel (minst 10 embryoer er nødvendig for en god nevron prep).
- Overfør embryoene til en 100 mikrometer nylon mesh celle sil med en overføring pipette for å drenere vann (prerinse overføringspipetten i Drosophila embryo vaskebuffer, 0,4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Samle embryoene fra silen med en liten pensel, og overføre dem til en 1,5 ml mikrorør fylt med en ml Drosophila embryo vask (Merk: rense agar eller bomullsfibre bruker pensel eller pipetter). I denne protokollen, kommer 1,5 ml mikrorør med en matchende disponibel pellet stampe.
- Vask embryoer i Drosophila embryo vask 3x.
- Dechorionate embryoene i en fersk 1:01 løsning av kommersielle blekemiddel og 95% etanol i 10 min [FORSIKTIG: blekemiddel kan forårsake irritasjon i øyne, nese, hals og hud].
- Flytt til panseret vev kultur, og vaske embryoer 2x i supplert Schneiders medium.
- La 200-300 mL medium i røret med embryoene, og forsiktig mekanisk distansere dechorionated embryoer ved hjelp Kimble Chase engangspellets pestles som har blitt sterilisert med 70% etanol (slipe 10-15x).
- Sentrifuger den homogeniserte blandingen ved 20 x g i 2 min, og transfer supernatanten til et nytt rør. [Dette trinnet er valgfritt, det hjelper å fjerne embryo rusk]
- Sentrifuger supernatanten ved 550 x g i 2 min for å pelletere cellene.
- Resuspender pellet i 500 mL supplert Schneiders middels og spinn celler ned igjen på 550 xg for 2 min, gjenta resuspensjon spinning syklus gang.
- Endelig resuspender pelleten i ~ 100 mL supplert Schneiders medium og plate cellene på en 25 mm ConA-belagt dekkglass i en steril 35 mm petriskål. Inkuber i 10 min for å tillate cellefesting.
- Tilsett 2 ml supplert Schneiders medium, med 5 mikrometer CytoD å senke dekkglass med vedlagte celler.
- Inkuber fatet i en fuktet 25 º C inkubator over natten før bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila S2 celler festet på ConA-belagt dekk spredde seg inn i en flat runde "pannekake"-form (figur 1A og 1C). Imidlertid, når S2-celler sådd ut på dekkglass i nærvær av CytoD og tillatt å spre seg etter 2-3 timer, danner de lange tynne prosesser fylt med parallelle mikrotubuli (figurene 1B og 1D). Disse mikrotubuli har uniform polaritet med pluss-ender ut syv. Time-lapse fluorescens avbildning av Drosophila S2 stabilt uttrykker mCherry-tubulin viser at prosessene er svært dynamisk, særlig i løpet av de første 60 min etter vedlegg (Figur 2). Etter 1 time inkubering, reduseres deres vekst nedover og 2-3 timers inkubasjon sikrer at mesteparten av cellene har vokst ut prosesser. Her viser vi to representative eksempler på organelle transport langs mikrotubuli i S2 celler, lysosomer (merket med LysoTracker, 200 nM; Tall 3A-B 7 (stabil transfeksjon med Pac-GFP-SKL; Tall 3D-E). Time-lapse bilder av cellene ble tatt hver 1 sek for 61 rammer ved hjelp av et Nikon TU-2000 invertert mikroskop utstyrt med et perfekt system Focus (Nikon) og Coolsnap CCD-kamera (Roper Scientific) drevet av Metamorph programvare. En 100-W halogen-lyskilde ble benyttet for fluorescenseksitasjon å minimalisere fotobleking og fototoksisitet. Hver av de 61 rammer i sekvensen ble fargekodet etter baren øverst til høyre, og bildene ble lagt oppå for å generere fargekodede sporene. Dermed bevegelige partikler generert regnbuespor, mens stasjonære partikler dukket hvit 10. ImageJ plug-in Oral Color-kode ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) ble brukt for denne behandlingen. For kvantitativ analyse av organelle bevegelsen vi brukte DiaTrack programvare (Semasopht Inc.), velger vi kunorganeller som er lokaliserte i prosesser fordi de lett kan spores, og polariteten av microtubule spor er kjent. Figurene 3C og 3F viser typiske fordelinger av retrograd og anterograd hastigheter innhentet av lysosomer og peroxisomes sporing, henholdsvis.
Lignende teknikker brukes i vårt laboratorium for analyse av organtransport i primær dyrkede nerveceller. Nerveceller er en dominerende celletype i blandede kulturer hentet fra scenen 9-11 embryoer. Etter over natten dyrking er de lette å kjenne igjen etter karakteristiske cellen form med neurites som er over 50 mikrometer lang (Figur 4A). Disse cellene er også positivt for den pan-nevronale markør, Elav 21 (Tall 4B og 4B '). Prosesser i nervecellene er fylt med mikrotubuli (Tall 4B og 4B "). Vi kan spore organelle transport langs neurites bruke techniques beskrevet ovenfor for S2-celler. Mitokondrier kan merkes med mitokondrie GFP (Mito-GFP) under kontroll av en motor nevron-promoter D42 22 (figur 5A og 5A '), og peroxisomes kan merkes ved injeksjon av DNA som koder for en peroksisom-målrettet mCherry 7, inn syncytialt blastoderm scenen embryoer (Tall 5B og 5B ').
Figur 1. Drosophila S2 prosess dannelse indusert av CytoD. (A, C) Drosophila S2 celler feste og spredte seg inn blir flate og runde former når belagt i ConA-belegges på forhånd Dekk. (B, D) S2-celler belagt i nærvær av 2,5 mikrometer CytoD danne lange prosesser fylt med mikrotubuli etter 3 timers inkubasjon. <strong> AB og CD er overført lys og fluorescerende mCherry-merket tubulin bilder, henholdsvis. Scale bar, 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Tidsforløp av prosesser vekst i et Drosophila S2 celle. Fluorescens time-lapse av et Drosophila S2 celle som uttrykker mCherry-tubulin i nærvær av 2,5 uM CytoD. Tallene angir tiden etter cellen feste til dekkglass. Scale bar, 5 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Organelle transport i Drosophila S2-celler. (AC) Lysosome bevegelse i Drosophila S2 celle. A representerer en min-lysosomer transport (merket med 200 nM Lysotracker) i en celle (A, DIC image) representert ved den kunstige Temporal-kode (laget av Fiji) (B). Hastigheter oppnådd fra analysen av lysosomer bevegelse spores i prosesser (DiaTrack, 663 partikler i 23 celler) (c). (DF) Peroksisom bevegelse i Drosophila S2 celle. En representant 1 min-peroxisome transport (merket med PMT-GFP-SKL) i en celle (D, DIC bilde) representert ved den kunstige Oral-kode (opprettet av FIJI) (E). Hastigheter oppnådd fra analysen av peroksisom bevegelse spores i prosesser (DiaTrack, 228 partikler i 20 celler) (F). Merk at lysosomer flytte med lengre og raskere baner enn peroxisomes. Scale bar, 5 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Primær Drosophila nerveceller fra natten kultur. (A) En overnatting kultivert Drosophila nevron har karakteristisk neuronal morfologi med lange neurites. (B) Den nevron uttrykt et pan-neuronal markør, Elav (rød i B og hvitt i B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) og med lange neurites fylt med mikrotubuli (grønne i B og hvitt i B'', DM1α , 1:1000). Scale Bar, 5 mikrometer. nk "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. Organelle transport i dyrkede Drosophila nevroner. (A) Mitokondrier i en kultivert Drosophila nevron preget av Mito-GFP under kontroll av en motor nevron-promoter, D42. (A ') 5 min-mitokondriell bevegelse i (A) er representert ved den kunstige Temporal-fargekode (laget av Fiji). (B) peroxisomes i en kultivert Drosophila nevron preget av Pac-SKL-mCherry, injiseres i tidlig syncytialt blastoderm stadium embryoer. (B ') 2 min-peroxisome bevegelse i (B) er representert ved den kunstige Temporal-fargekode (opprettet av FIJI). Scale bar, 5 mikrometer.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
| Organeller | Beskrivelse |
| Peroxisomes | Peroksisomal målretting signal en tripeptid (SKL) merket med en FP 25 |
| Mitokondrier | Mitokondrie målretting sekvens av cytokrom c oksidase subenheten VIII merket med en FP 26 |
| Mitokondrier | Mitotracker (Dye som akkumuleres i aktiv mitokondrier) 27 |
| Lysosomer | Lysotracker (Dye som akkumuleres i mobilnettetlommer med lav indre pH) 28 |
Tabell 1. De vanligste organelle merking strategier.
Denne tabellen oppsummerer de vanligste organ merking strategier i vev kultur celler, inkludert merking av peroxisomes, mitokondrier og lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi detaljerte protokoller for å studere mikrotubulus avhengig transport av varer i Drosophila S2 celler og primær nevron kultur. Både S2 prosesser og neurites er strukturer fylt av buntet mikrotubuli arrays som fungerer som spor for organelle transport.
To strategier er vanligvis brukes til å merke organ: transfeksjon av vektorer som koder for et fluorescerende protein med en organelle-targeting sekvens eller farging med fluorescerende fargestoffer lagt direkte til kulturer. Vanlige eksempler på laste etiketter er oppført i Tabell 1. Forbigående transfeksjon eller RNAi behandlinger av Drosophila S2-celler ved behov utføres i suspensjon 4,6,7,9,10 før cellene blir sådd ut på dekkglass for avbildning.
For å få pålitelige resultater i S2 celleforsøk, er det viktig å holde følgende punkter i bakhodet:
- Plate celler på optimal tetthet for bildebehandling. Høy hietsity vil føre til overlapping av prosesser fra forskjellige celler, mens celler med lav tetthet har dårlig levedyktighet og ikke er i stand til å danne prosesser.
- Tillat S2 celler til helt utvikle prosesser. Vi rutinemessig inkubere cellene i 2 timer etter plating men inkubering opp til 24 timer kan utføres om nødvendig.
- S2 celler må behandles med CytoD før de fester seg til ConA belagt dekkglass. Utlegging av medikamentet etter at cellene er festet vil ikke indusere prosesser formasjonen.
- Ved bruk av fargestoffer som endrer prøver for å avbilde hver 20-25 min; langvarig inkubering av celler med enten Mitotracker eller Lysotracker er toksisk for cellene.
- Vi pleier å spore transport av varer i S2 celler ved bildebehandling i 1 min på en ramme / sek. Under denne tilstanden celler er ikke foto-skadet.
- Bare analysere organelle bevegelsen i celleprosesser. Organelle tetthet i cellelegemet er for høy for pålitelig sporing og polaritet av bevegelsen ikke lett kan bestemmes.
I denne protokollen, må du kanskje betale oppmerksomhet til flere sentrale punktene under:
- Stage embryoer riktig. De innsamlede Embryoene må synkroniseres og iscenesatt for å etapper 9-11, når neuroblast delaminering fra ektoderm oppstår. Staging embryoer for tidlig eller for sent, kan resultere i færre neuroblasts i hvert embryo og dermed svikt i nerveceller høsting av de dissosierte embryoer.
- Dechorionate embryoer til høyre grad (alle embryoer endrer farge fra helt hvit til mer gjennomsiktig). Under-dechorionation kan føre til vanskeligheter med embryo dissosiasjon, mens over-dechorionation kan skade fostre. Desemberhorionated embryoer blir veldig klissete og mykt, og dermed prøve å unngå pipettering eller berøre embryoer med pipettespisser under vasketrinnene før dissosiasjon.
- Vær spesielt oppmerksom på embryoer dissosiasjon. Vi finner at plast disponibel pellets pestles og matchende mikrorør gi bedre dissosiasjon enn et glass Douce-homogenisator, spesielt for lite antall embryoer. Under-dissosiasjon vil etterlate store celleklynger, mens over-dissosiasjon vil føre til sammenbrudd celler og massiv akkumulering av celleavfall. Juster dissosiasjon nivå i henhold til den embryo tall.
- Plating nevron på glass dekkglass til en rimelig tetthet. Crowded nevroner utvikler seg vanligvis svært korte neurites, mens sparsom nevroner ofte ikke klarer å overleve.
I tillegg la vi merke til at primærcellekulturer inneholder ofte muskelceller, og blodceller. Over natten behandling med CytoD bidrar til å redusere antall muskelcelle-og blodceller, og markedss neurite utvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Gelfand lab som har bidratt til utviklingen av disse protokollene. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Science of National Institutes of Health i henhold award nummer R01GM052111 til VIG og ved baskiske regjeringen Department of Education, universiteter og forskningsdepartementet i henhold award nummer BFI-2011-295 til UDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
