Summary
Drosophila S2 hücreleri ve kültürlenmiş nöronların in vivo olarak motor tahrikli bir organel taşıma görüntüleme için büyük sistemlerdir. Burada, her iki hücre kültür tipleri için, görüntüleme ve taşıma analiz protokolleri ayrıntılı tarif etmektedir.
Abstract
Drosophila S2 hücrelerinin homojen bir polarize mikrotübüller ile dolu bir aktin-depolimerizasyon ilaç formu uzun dallanmamış süreçlerin mevcudiyetinde bir lamel üzerine kaplanmıştır. Organelleri mikrotübül motorları ile bu işlemler boyunca hareket eder. Kolay bakım, RNAi protein knock-down ve istikrarlı hücre hatları oluşturmak için verimli bir prosedüre yüksek hassasiyet Drosophila S2 hücreleri canlı görüntüleme ile kargo taşımacılığı çalışma için ideal bir model sistemi yapmak. Ayrışmış Drosophila embriyolardan kültür primer nöronlarda aksonal taşıma araçları: S2 hücreleri ile elde edilen sonuçlar ayrıca, daha fazla fizyolojik olarak uygun bir sistemin uygulanabilir. Kültürlü nöronlar S2 işlemlere benzer birlikte mikrotübüllerin, dolu uzun nöritler büyür. Gibi S2 hücrelerindeki, kültüre edilmiş nöronlarda organeller ya organel-spesifik floresan boyalar veya DNA tarafından kodlanan bir organel fluoresan işaretleyiciler kullanılarak görüntülenebilir erken embriyolar içine enjekte edilen ya da transgen ekspreseic uçar. Bu nedenle, organel ulaşım kolaylıkla yaşayan görüntüleme kullanarak cam lamelleri kültüre nöronlar kaydedilebilir. Burada Drosophila S2 hücreleri ve primer nöronlar kargo taşımacılığı kültüre ve görselleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır. Biz bu protokoller kargo taşımacılığı eğitim laboratuarları için her iki sistemin erişilebilir hale inanıyoruz.
Introduction
Drosophila S2 hücreler birçok hücresel süreçleri incelemek için artan popülerlik kazanmıştır. Bu hücreler başlangıçta OregonR Drosophila melanogaster tripsinlendi geç dönem embriyo elde edildi ve 1.. Drosophila S2 hücreleri diğer hücre hatları üzerinden pek çok avantajı sunmaktadır makrofaj gibi özelliklerini korumak edildi. Bu CO2 olmadan 25 ° C'de kültürlenir ve ısıtma veya gaz değişimi ihtiyacı olmadan, oda sıcaklığında saatlerce görüntülenebilir. Daha da önemlisi, Drosophila S2 hücreleri, ilgi konusu olan proteinlerin yüksek verimlilik sağlayan demonte RNAi tedaviye çok duyarlıdır. S2 hücreleri yüksek oranda transfectable ve kararlı hücre soyları ilgi konusu olan proteinlerin kararlı ektopik ifade izin vermek için en az dört hafta içinde seçilebilir. S2 hücreleri normalde ya büyümeye gevşek bağlı olduğu, ancak, bir şişe ya da süspansiyon içinde yayılmaz. Bir bitki lektin Conca ile önceden kaplanmış lameller üzerine yaymak için indüklenebilirnavalin A (ConA). Yayılmış hücrelerin çevresi özellikle incedir ve bu nedenle canlı hücre mikroskopi için idealdir. S2 hücreleri kültür, RNAi tedavisi, canlı ışık görüntüleme ve immün için ayrıntılı protokoller literatür 2,3 bulunabilir. Bizim laboratuvar. Gibi sitokalasin D gibi F-aktin depolimerize veya sunucularının herhangi bir ilaç, (CytoD) ile muamele Drosophila S2 hücrelerinin homojen bir polarize mikrotübül 4 ile doldurulmuş uzun süreçler büyümesi mikrotübül göre yük taşıma çalışmak için bir model sistem olarak S2 hücreleri benimsemiştir -10, bu mikrotübül diziler boyunca kargo hareketini incelemek için ideal bir sistem yapar. Bu süreçlerin farklı ulaşım parametreleri (. Yani yörüngeleri uzunlukları, hızlar, yön vb) kolayca otomatik partikül izleme yazılımı, DiaTrack (Semasopht kullanılarak ölçülebilir: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Bu özellikler S2 hücreleri doku kültürü hücrelerin mikrotübüllerinde birlikte kargo taşımacılığı eğitimi için cazip bir sistem yapmak.
S2 hücrelerinde Pilot Deneyler Drosophila birincil nöronlar kargo taşımacılığı çalışmalar fizyolojik olarak önemli bir örnek için uzatılabilir. S2 hücrelerine benzer şekilde, ayrışmış embriyolardan kültür nöronları gibi boyalar ve inhibitörleri gibi küçük moleküllere karşı geçirgen olan ve organel taşıma yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme oda sıcaklığında nöronlarda gerçekleştirilebilir. Farklı genetik geçmişleri ile Drosophila kullanarak, nakavtla (genetik kayıp fonksiyon-mutasyonlar) primer nöronlar gen fonksiyonunu inceleyebilirsiniz, demonte (dsRNA enjeksiyon ya da ifade) veya ektopik ifadesi (transgenik sinekler). Özellikle, CytoD tedavi kullanarak aktin filamentler parçalanması nörit gelişimini engellemez, onun yerine daha hızlı büyür ve böylece biz mikrotübül-depende eğitim görebilirsinizaktin etkisi olmadan CytoD ile muamele edilmiş nöronlarda nt organel nakil 11, parçalanmış olması gerekir. Bu nedenle, birincil nöronal kültürlerin bir fizyolojik ilgili sisteme 10,12 kargo taşımacılığı çalışma için harika bir sistem kılan, doku kültürü hücreleri avantajlarını birleştirmek ve genetik sinek. Birkaç ailesel nörodejeneratif hastalıkların yol açtığı veya kargo taşımacılığı kusurları (örneğin Parkinson hastalığı 13 ile ilişkili olabilir bu yana, Huntington hastalığı 14, Alzheimer Hastalığı 15,16, Amyotrofik Lateral Skleroz / ALS 17, HMN7B ve Perry sendromu 18,19 ve Spinoserebellar ataksi tip 5/SCA5 20), ve primer nöron kültürlerinden mikrotübüle bağlı taşıtlarda, bu hastalıklara neden olan belirli bir mutasyon etkilerinin analizinde yararlı olabilir.
Son olarak, mikrotübül-bağlı taşıma önemli özellikleri de memeli hayvanlarda ve sinekler arasında muhafaza, fakat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Drosophila S2 hücrelerinin
ConA kaplı lamelleri hazırlanması
- Seramik bir rafa lamelleri yerleştirin ve 1 saat kromik asit daldırma ile yıkayın. [DİKKAT: kromik asit aşındırıcı ve gözlerde tahriş, burun, boğaz ve cilt neden olabilir].
- Asit tamamen yıkanıp kadar sürekli 30 dakika dH 2 O ile tamamen lamelleri durulayın.
- Let lamelleri hava kuru ve Con 30 dakika (dH 2 O 0.5 mg / ml çözelti) ile kat onları.
- 15 dakika dH 2 O ile lamelleri durulayın ve onlara hava kuruması. ConA'nın kaplı lamelleri 1 aya kadar saklanabilir.
Hücreleri Kaplama
- S2 hücreleri katlanarak deney için gerekli hücre sayısına bağlı olarak, T25 veya T75 cm 2 şişelerinde büyümeye izin verin.
- Hemasitometre kullanılarak hücre yoğunluğu sayılır. 1 ekleyin ml büyüme myumuşak bir 35 mm doku kültürü ConA kaplı lamel ile çanak ve içine edium (örneğin, böcek-Xpress) çanak ~ 1 x 10 5 hücre aktarın. Farklı hücrelerden süreçler örtüşmeyen çünkü bu hücre yoğunluğu görüntüleme için en uygunudur.
- Hemen (2.5 uM CytoD nihai konsantrasyona) çanak 5 uM CytoD ile 1 ml orta ekleyin kaplama sonrası, işlemlerin oluşumunu uyarmak için. Görüntüleme önce 25 ° C'de en az 2 saat boyunca hücrelerin inkübe edilmesi ile işlemlerin tam olarak gelişmesini sağlar.
2.. Drosophila İlköğretim Nöron Kültürü
Nöron kültürü için hazırlık
- (:, 5 ug / ml insülin, 100 ug / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 ug / ml tetrasiklin,% 20 fetal sığır serumu, 30 dakika boyunca 55 ° C 'de durdurulmuş ısı Schneider ortamı ile takviye edilmiş) Drosophila nöronal büyüme ortamı hazırlayın . Bu destekuygulandığın Schneider ortamı 6 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Drosophila embriyolar (22.5 g ağar, 12.0 g sükroz ve 750 ml H, 2 litrelik bir şişe içinde 2 O toplanması için elma suyu agar şişeler hazırlanması; 20-25 dakika için otoklav, 250 ml elma suyu ekleyin ve her Drosophila içine ~ 10 ml dökün flakon;) katılaşma sonrasında, pamuk topları ile şişeleri fiş ve gıda kurutma üzerinden önlemek için plastik gıda şal ile şişeleri sarın. Agar şişelere elma suyu 4 hafta içinde çok iyi sızdırmaz plastik torbalarda 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- ConA ile Coat asitle yıkanmış 25 mm daire lamelleri (Drosophila S2 hücreleri Protokolde detaylarını görmek) ve 10-15 dakika boyunca UV ışık altında sterilize. Bu lamelleri bir ay boyunca saklanabilir.
Drosophila embriyonik nöron kültürü
- Keep genç erişkin embriyolar f toplama önce 1-2 gün boyunca kuru maya ile takviye elma suyu agar şişelere uçarNöron hazırlanması.
- Toplama gününde, toplanan embriyoların senkronize etmek amacıyla, transfer yetişkin ışığında 1 saat precollection için taze elma suyu agar flakon uçar ve bu embriyolar atın.
- Aktarım, 1 saat boyunca toplamak embriyolar ve embriyo verimini artırmak için karanlık hem de bir saat daha başka bir şişeye aktarın sinekler, yeni bir elma suyu agar şişesine uçar.
- Elma suyu agar şişesinden yetişkin sinekler çıkarın ve embriyolar oda sıcaklığında (4-6 saat yaşındaki embriyolar evre 9-11 arasında) Evrelere başka bir 4 saat 9-11 geliştirmeye izin.
- Viyallere fışkırmayı ve (en az 10 embriyolar iyi bir nöron hazırlık için gerekli olan) küçük bir fırça ile elma suyu agar embriyolar gevşeterek embriyolar çıkarın.
- Suyu tahliye etmek için bir transfer pipet ile 100 mikron naylon örgü hücre süzgeç embriyolar transfer (Drosophila embriyo yıkama tamponu,% 0.4 NaCl,% 0.03 Triton transfer pipet Ön yıkamaX-100).
- Küçük bir fırça ile süzgeçten embriyoların toplayın ve 1 ml Drosophila embriyo yıkaması (Not: fırça veya pipet uçları kullanılarak bir agar ya da pamuk lifleri temiz) ile dolu bir 1.5 ml mikrotüp içine aktarın. Bu protokolde, 1.5 ml Mikrotüp eşleşen tek pelet havan tokmağı ile birlikte gelir.
- Drosophila embriyo yıkama 3x embriyolar yıkayın.
- 10 dakika boyunca taze 01:01 ticari çamaşır suyu çözeltisi ve% 95 etanol içinde embriyolar Dechorionate [DİKKAT: ağartma tahriş Gözleri, burun, boğaz ve deriyi neden olabilir].
- Doku kültürü kaputu taşı ve desteklenmiş Schneider orta embriyolar 2x yıkayın.
- Embriyolar ile tüp 200-300 ul orta bırakın ve yavaşça mekanik (10-15x eziyet)% 70 etanol ile sterilize edilmiştir Kimble Chase tek pelet pestles kullanarak dechorionated embriyolar ayrışır.
- 2 dakika ve 20 tra xg'de homojenleştirilmiş karışım santrifüj, yeni bir tüpe yüzer nsfer. [Bu adım isteğe bağlıdır, bu embriyo enkaz kaldırmak için yardımcı olur]
- Hücreler pellet haline getirmek için 2 dakika boyunca 550 x g'de santrifüje süpernatan.
- 2 dakika boyunca 550 x g hızında tekrar Schneider orta ve spin hücreleri aşağı desteklenmiş 500 ul pelletini, bir kez resüspansiyon-iplik döngüsü tekrarlayın.
- Son olarak Schneider ortamı ilave ~ 100 ul pelet tekrar süspansiyon ve steril bir 35 mm Petri kabı, bir 25 mm ConA kaplı lamel üzerine hücreleri plaka. Hücre bağlanmasına olanak sağlamak için 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Bağlı hücreleri ile lamel daldırın 5 uM CytoD ile takviye Schneider ortamı 2 ml ekleyin.
- Görüntüleme gecede önce nemlendirilmiş bir 25 º C inkübatör inkübe çanak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Düz yuvarlak "pancake" şekli (Şekil 1A ve 1C) içine ConA'nın kaplı lamel formada bağlı Drosophila S2 hücreleri. S2 hücreleri CytoD mevcudiyetinde lamelleri kaplama ve 2-3 saat boyunca yayılmasına izin verilir, ancak, bunlar paralel mikrotübül (Şekil 1 B ve 1 D) ile doldurulmuş ince uzun bir süreç oluştururlar. 7 out artı-biter bu mikrotübülüsleri üniforma kutba sahip. Drosophila S2 stabil MCherry tübüline ifade Time-lapse floresan görüntüleme yöntemleri özellikle eki sonra ilk 60 dakika (Şekil 2) sırasında, çok dinamik olduğunu göstermektedir. 1 saat inkübasyondan sonra, büyüme yavaşlar ve 2-3 saat kuluçka hücrelerinin çoğunluğu tam süreçlerini büyüdü sağlar. Burada S2 hücrelerinde mikrotübüller boyunca organel taşıma iki temsili örneklerini göstermektedir, Lysotracker, 200 nM ile etiketlenmiş lizozom (, Şekil 3A-B 7 (stabil transfeksiyon ile etiketlenmiş peroksizomlar (; Şekil 3D-E). Hücrelerin Time-lapse görüntüleri Metamorph yazılım tarafından yönlendirilen Perfect Odak sistemi (Nikon) ve CoolSnap CCD kamera (Roper Scientific) ile donatılmış bir Nikon TU-2000 ters bir mikroskop kullanılarak 61 kare için her 1 sn alınmıştır. A-100-W halojen ışık kaynağı ve ışıkla ağartma fototoksisite en aza indirmek için floresans uyarma için kullanılmıştır. Sırayla 61 kare her renk üst sağ ve görüntülerin renk kodlu parçaları üretmek için bindirilmiş barda göre kodlandı. Sabit parçacıklar 10 beyaz çıktı iken Böylece hareketli parçacıkları, gökkuşağı parçaları oluşturulur. Plug-in İmageJ Temporal Color-Code ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) bu işlem için kullanıldı. Biz DiaTrack yazılımı (Semasopht A.Ş.) kullanılan organelidir hareketinin kantitatif analiz için, biz sadece belirlikolayca izlenebilir ve mikrotübül parça polarite bilinir çünkü süreçlerinde lokalize organeller. 3C ve 3F sırasıyla, lizozomlar ve peroksizomlar takibi ile elde retrograd ve anterograd hızlar tipik dağılımlarını göstermektedir.
Benzer teknikler primer kültürlenmiş nöronlar içinde organel taşıma analizi için laboratuarımızda kullanılmıştır. Nöronlar aşamada embriyolar 9-11 elde edilen karışık kültürlerinde bir baskın hücre türüdür. Gece kültürden sonra onlar mikron 50 üzerinde uzun (Şekil 4A) nöritleri olan karakteristik hücre şekli ile tanımak kolaydır. Bu hücreler ayrıca, pan-nöronal işaretleyici Elav 21 (Şekiller 4B ve 4B ') için pozitiftir. Nöronlarda işlemler mikrotübüllerin (Şekiller 4B ve 4B ") ile doldurulur. Biz te kullanarak nöritlere boyunca organel taşıma izleyebilirchniques S2 hücreleri için yukarıda tarif edildiği. Mitokondri bir motor nöron-özel promoter D42 22 (Şekiller 5A ve 5A ') kontrolü altında mitokondrial GFP (Mito-GFP) ile etiketlenebilir ve peroksizomlar sinsityal içine, bir peroksizom hedefli mCherry 7 kodlayan DNA enjeksiyonu ile işaretlenebilir blastoderm aşamada embriyolar (Şekil 5B ve 5B ').
CytoD tarafından uyarılan Şekil 1.. Drosophila S2 işlem oluşumu. ConA'nın-precoated lamelleri kaplanmıştır zaman (A, C) Drosophila S2 hücreleri eklemek ve dümdüz ve yuvarlak şekiller içine yayıldı. 2.5 um CytoD varlığında, kaplama (B, D) S2 hücreleri 3 saat inkübasyondan sonra, mikrotübül ile doldurulmuş uzun bir süreç oluştururlar. <strong> AB ve CD sırasıyla, ışık ve floresan MCherry etiketli tubulin görüntüleri iletilir. Ölçeği bar, 10 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Bir Drosophila S2 hücrede süreçleri büyüme Zaman atlamalı. 2.5 mcM CytoD varlığında MCherry tübüline ifade eden Drosophila S2 hücrenin Floresans time-lapse. Sayılar hücre lamel eklendikten sonra zamanı gösterir. Ölçek çubuğu, 5 um. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Drosophila S2 hücre içinde Drosophila S2 hücrelerinde organel nakliye. (AC) Lizozom hareketi. Bir hücrede (FIJI tarafından oluşturulan) yapay Temporal-Kodu (B) ile temsil edilen (A, DIC resim) (200 nM Lysotracker etiketli) bir temsilci 1 dk lizozom ulaşım. Işlemlerinde izlenen lizozom hareketinin analizinden elde edilen Hızları (DiaTrack, 23 hücrelerinde 663 partiküller) (C). Drosophila S2 hücre içinde (DF) Peroksizom hareketi. (FIJI tarafından oluşturulan) yapay Temporal-Code (E) ile temsil edilen bir hücre (D, DIC görüntü) in (pMT-GFP-SKL ile etiketlenmiş) bir Örnek 1 dk-peroksizom taşıma. Süreçlerinde izlenen peroksisom hareket analizinden elde Hızları (DiaTrack; 20 hücrelerinde 228 parçacıklar) (F). Lizozomlar hareket unutmayın peroksizom daha uzun ve daha hızlı yörüngeleri ile. Ölçek çubuğu, 5 um. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Gecelik kültürden birincil nöronlar Drosophila. (A) bir gece boyunca kültürlendi Drosophila nöron uzun nöritleri olan karakteristik nöronal morfolojiye sahiptir. (B) nöron, bir Pan-nöronal işaretleyici, ELAV (B kırmızı ve beyaz B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) olarak ifade edilmiştir ve Yatak mikrotübüllerin (yeşil ve Yatak beyaz dolu uzun nöritleri olan'' DM1α , 1:1000). Ölçek Bar, 5 um. nk "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Kültür Drosophila nöronlarda organel nakliye. Motor nörona özgü bir promotör, D42 kontrolü altında Mito-GFP ile işaretlenmiş bir kültürlü Drosophila nöron içinde (A) Mitokondri. (A '), (A) 5 min-mitokondriyal hareketleri (FIJI tarafından oluşturulan) yapay Temporal Renk kodla temsil edilir. (B) pAC-SKL-mCherry tarafından işaretlenmiş bir kültür Drosophila nöron Peroksizomlar, erken sinsisyal blastoderm evre embriyolar enjekte. (B ') (B)' de 2 dakika içinde peroksizom hareketleri (FIJI tarafından oluşturulan) yapay Temporal Renk kodla temsil edilir. Ölçek çubuğu, 5 um.ig5highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
| Organelle | Tanım |
| Peroksizomlar | Peroksizomal hedefleme sinyali 1 tripeptide (SKL) bir FP 25 ile etiketlendi |
| Mitokondri | Sitokrom C oksidaz alt-birimi VIII'in mitokondriyal hedefleme sekansı bir FP 26 ile etiketlendi |
| Mitokondri | Mitotracker (aktif mitokondri birikir Boya) 27 |
| Lizozomlar | Hücresel birikir Lysotracker (BoyaDüşük iç pH bölmeler) 28 |
Tablo 1. En yaygın organel etiketleme stratejileri.
Bu tablo, peroksi etiketlenmesi, mitokondri, lizozomlar ve da dahil olmak üzere doku kültür hücrelerinde en sık organel etiketleme stratejileri, özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada Drosophila S2 hücreleri ve primer nöron kültürü mikrotübül bağımlı kargo taşımacılığı eğitimi için ayrıntılı protokoller mevcut. Hem S2 süreçler ve nevrotiler organel ulaşım için parça olarak hizmet bohça mikrotübülüsleri diziler tarafından doldurulur yapılardır.
Iki strateji genellikle etiket organellere kullanılır: kültürlere doğrudan ilave floresan boyalar ile bir organel-hedefleyen dizisi ya da boyama ile bir floresan proteini kodlayan vektörlerin transfeksiyon. Yük etiket yaygın örnekleri, Tablo 1 'de listelenmiştir. Hücreler görüntüleme için lamelleri kaplama önce Drosophila S2 hücrelerinin geçici transfeksiyon veya RNAi tedavi gerektiğinde süspansiyon 4,6,7,9,10 gerçekleştirilir.
S2 hücre deneylerinde güvenilir sonuçlar elde etmek için, bu akılda aşağıdaki noktaları tutmak için önemlidir:
- Görüntüleme için uygun yoğunlukta Plate hücreleri. Yüksek dendüşük yoğunluklu hücreleri zayıf canlılığı ve süreçleri oluşturamamaktadırlar iken versitesi, farklı hücrelerden süreçlerin üstüste neden olacaktır.
- S2 hücreleri tamamen süreçlerini geliştirmeye olanak sağlar. Biz rutin kaplama ama gerekirse 24 saat inkübasyon kadar yapılabilir sonra 2 saat süreyle inkübe hücreleri.
- Onlar ConA'nın kaplı lamelleri eklemeden önce S2 hücreleri CytoD ile tedavi edilmelidir. Hücreler bağlandıkları sonra ilaç ekleme işlemleri oluşumuna neden olmaz.
- Mitotracker veya Lysotracker ya da hücrelerin uzun süreli inkübasyon hücrelerine toksik olan, boyalar, her 20-25 dakikada görüntülenmesi için değiştirme örnekleri kullanılırken.
- Biz genellikle 1 kare / sn, 1 dakika boyunca görüntüleme S2 hücrelerinde kargo taşımacılığı izleyebilirsiniz. Bu şartlar altında hücreleri foto hasarlı değildir.
- Sadece hücre süreçlerinin organel hareketini analiz. Hücre gövdesinde Organeli yoğunluğu güvenilir izleme ve hareketin polarite kolayca tespit edilemedi için çok yüksek.
Bu protokol, aşağıda listelenen birçok önemli adımlara dikkat ödemek gerekebilir:
- Doğru Sahne embriyolar. Ektodermden neuroblast delaminleştirme oluştuğunda toplanan embriyolar, senkronize ve aşamaları 9-11 sahnelenen gerekir. Çok erken embriyo Sahneleme ya da geç, her embriyonun daha az nöroblast neden olabilir ve ayrışmış embriyolardan hasat nöronların dolayısıyla başarısızlık.
- Doğru ölçüde dechorionate embriyolar (bütün embriyolar daha şeffaf tamamen beyaz renk değiştirmeye). Over-Dechorionation embriyoların zarar verebilecek ise altında Dechorionation, embriyo ayrışma zorluk yol açabilir. Aralıkhorionated embriyolar çok yapışkan ve yumuşak hale böylece pipetlenmesini veya kesilmeden önce yıkama adımları sırasında pipet uçları ile embriyolar dokunmaktan kaçınıyorum.
- Ayrışmasını embriyolar özel dikkat. Biz plastik tek pelet havan ve eşleştirme mikrotüpler özellikle embriyo küçük bir sayı için, bir cam dounce homojenleştirici daha iyi ayrışma sağladığını görebilirsiniz. Aşırı ayrışma hücreleri arıza ve hücre enkaz büyük birikimine neden olurken altında ayrışma, büyük hücre kümeleri bırakacaktır. Embriyo numaralarına göre ayrılma seviyesini ayarlayın.
- Makul bir yoğunluğa cam lamel üzerinde nöron kaplama. Seyrek nöronlar genellikle hayatta başarısız ise kalabalık nöronlar genellikle, çok kısa nevritlerle gelişir.
Ayrıca, primer hücre kültürleri sık sık kas hücreleri içeren fark ve kan hücreleri. CytoD gecede tedavi kas hücresi ve kan hücre sayısını azaltmak ve geliştirmek için yardımcı olurnörit akıbet var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz bu protokollerin gelişmesine katkıda Gelfand laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası BFI-2011-295 Udc için altında VIG ödül sayısı R01GM052111 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü tarafından ve Bask Devlet Eğitimi Bölümü, Üniversiteler ve Araştırma tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
