Summary
Drosophila S2-celler och odlade neuroner är stora system för avbildning av motordriven organelltransport in vivo. Här beskriver vi detaljerade protokoll för odling av båda celltyperna, deras avbildning och analys av transport.
Abstract
Drosophila S2 celler ut på ett täckglas i närvaro av eventuella aktin-depolymerizing drog bildar långa ogrenade processer fyllda med enhetligt polarise mikrotubuli. Organeller förflytta sig längs dessa processer genom mikrotubuli motorer. Enkelt underhåll, hög känslighet för RNAi-medierad protein knock-down och effektivt förfarande för att skapa stabila cellinjer gör Drosophila S2 celler ett perfekt modellsystem för att studera lasttransport av levande avbildning. De resultat som erhölls med S2-celler kan appliceras vidare till ett mer fysiologiskt relevant System: axonal transport i primära neuroner odlade från dissocierade Drosophila embryon. Odlade nervceller växer långa neuriter fyllda med medföljande mikrotubuli, mycket liknar S2 processer. Liksom i S2-celler, kan organeller i odlade nervceller visualiseras genom antingen organell-specifik fluorescerande färger eller med hjälp av fluorescerande organell markörer som kodas av DNA injiceras i tidiga embryon eller uttryckt i transgenic flugor. Därför kan organell transport lätt in i nervceller odlade på täckglas med hjälp av levande avbildning. Här beskriver vi rutiner för odling och visualisera godstransporter i Drosophila S2-celler och primära neuroner. Vi tror att dessa protokoll gör båda systemen tillgängliga för labb studerar godstransporter.
Introduction
Drosophila S2 celler har vunnit allt större popularitet för att studera många cellulära processer. Dessa celler ursprungligen erhölls från trypsinerade sent stadium embryon av OregonR Drosophila melanogaster och upprätthålla makrofager-liknande funktioner 1. Drosophila S2 celler har många fördelar jämfört med andra cellinjer. De odlades vid 25 ° C utan CO2 och kan avbildas under flera timmar vid rumstemperatur utan behov av värme-eller gasutbyte. Ännu viktigare, Drosophila S2-celler är mycket känsliga för RNAi behandling tillåter högeffektiv knockdown av proteiner av intresse. S2-celler är mycket transfekterbara och stabila cellinjer kan väljas på mindre än fyra veckor för att möjliggöra stabil ektopisk uttryck av proteiner av intresse. S2-celler växer normalt antingen löst kopplade men inte spridas på en flaska eller i suspension. De kan induceras att spridas på täckglas förbelagda med en växt-lektin concanavalin A (ConA). Periferin av spridda celler är särskilt tunn och därför är idealisk för levande cell mikroskopi. Detaljerade protokoll för S2 celler kultur, RNAi behandling, levande ljus bildbehandling och immunfärgning kan hittas i litteraturen 2,3. Vårt labb har antagit S2 celler som modellsystem för att studera mikrotubuli-baserade lasttransport. Drosophila S2-celler som behandlats med något läkemedel som depolymeriserar eller bryter F-aktin, såsom cytochalasin D (CytoD), växer långa processer fyllda med enhetligt polarise mikrotubuli 4 -10, vilket gör det till ett idealiskt system för att studera last rörelse längs mikrotubuli matriser. Olika parametrar för transport i dessa processer (. Dvs banor längder, hastigheter rikt etc) kan lätt mätas med hjälp av automatisk partikel-mjukvara, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallottons: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Dessa egenskaper gör S2 celler en tilltalande system för att studera lasttransport längs mikrotubuli i vävnadsodlingsceller.
Pilotverksamhet S2 celler kan utökas till ett fysiologiskt viktig modell för studier godstransport i Drosophila primära nervceller. Liknar S2 celler, neuroner odlade från dissocierade embryon är genomsläppliga för små molekyler såsom färgämnen och hämmare, och högupplösta live-avbildning av organell transporter kan utföras på nervceller i rumstemperatur. Använda Drosophila med olika genetisk bakgrund, kan vi undersöka geners funktion i primära neuroner genom knockout (genetisk förlust-av-funktion mutationer), knockdown (dsRNA injektion eller uttryck) eller ektopisk uttryck (transgena flugor). Specifikt innebär fragmentering av aktin filament med hjälp CytoD behandling inte hindra neuritutväxt, utan de växer snabbare, och på så sätt kan vi studera mikrotubuli-dependent organell transporter i CytoD-behandlade neuroner utan påverkan av aktin filament 11. Därför primära neuronala kulturer kombinera fördelarna med vävnadsodlingsceller och flyga genetik, vilket gör det till ett bra system för att studera lasttransport i ett fysiologiskt relevant systemet 10,12. Eftersom flera familjära neurodegenerativa sjukdomar kan orsakas av eller i samband med defekter godstransport (t.ex. Parkinsons sjukdom 13, Huntingtons sjukdom 14, Alzheimers sjukdom 15,16, amyotrofisk lateralskleros / ALS 17 HMN7B och Perry syndrom 18,19, och Spinocerebellär ataxi typ 5/SCA5 20), kan primära neuronala kulturer vara användbar i analysen av effekterna av specifika mutationer som orsakar dessa sjukdomar på mikrotubuli beroende transportsektorn.
Slutligen är viktiga egenskaper hos mikrotubuli beroende transporter väl bevarad mellan däggdjur och flugor, men
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila S2-celler
Beredning av ConA belagda täckglas
- Placera täckglas i en keramisk rack och tvätta dem med kromsyra nedsänkning under 1 timme. [VARNING: kromsyra är frätande och kan orsaka irritation i ögon, näsa, hals och hud].
- Skölj täck noggrant med ständigt rinnande dH 2 O i 30 min tills syran är helt urblekta.
- Låt täcklufttorka och päls dem med ConA (0,5 mg / ml lösning i dH 2 O) i 30 min.
- Skölj täckglas med dH 2 O under 15 minuter och låt dem lufttorka. ConA belagda täckglas kan lagras upp till 1 månad.
Plätering cellerna
- Tillåt S2-celler att exponentiellt växa i T25-eller T75 cm 2 kolvar beroende på antalet celler som krävs för experimentet.
- Räkna celldensitet med användning av en hemocytometer. Tillsätt 1 ml tillväxt mEDIUM (exempelvis kryp-Xpress) i en 35 mm vävnadsodlingsskål med ConA belagda täckglas, och försiktigt överföra ~ 1 x 10 5 celler till skålen. Denna celltäthet är optimal för avbildning eftersom processer från olika celler som inte överlappar varandra.
- För att inducera bildning av processer, omedelbart efter plätering lägga 1 ml medium med 5 | iM CytoD till skålen (för att den slutliga koncentrationen av 2,5 | iM CytoD). Tillåt fullständig utveckling av processer genom inkubering av cellerna i minst 2 h vid 25 ° C innan avbildning.
2. Drosophila Primär Neuron Kultur
Förberedelse för neuron kultur
- Förbered Drosophila neuronala tillväxtmedium (Schneider-medium kompletterat med: 20% bovint fosterserum, värmeinaktiverades vid 55 ° C under 30 min; 5 ^ g / ml insulin, 100 ^ ig / ml penicillin, 100 | ag / ml streptomycin, 10 pg / ml tetracyklin) . Detta stödpletteras Schneiders medium kan förvaras vid 4 ° C under 6 månader.
- Förbered äppeljuice agar flaskor för att samla in Drosophila embryon (22,5 g agar, 12,0 g sackaros och 750 ml H 2 O i en 2-liters kolv, autoklav för 20-25 minuter, tillsätt 250 ml äppeljuice och häll ~ 10 ml i varje Drosophila injektionsflaska, efter stelning, plug injektionsflaskor med bomullstussar, och linda flaskorna med plast mat wrap att undvika övertorkning av maten). Den äppeljuice i agar flaskor kan lagras vid 4 ° C i väl förslutna plastpåsar för 4 veckor.
- Coat syra-tvättad 25 mm cirkel täckglas med ConA (se detaljer i protokollet för Drosophila S2-celler) och sterilisera dem under UV-ljus i 10-15 min. Dessa täckglas kan lagras i en månad.
Drosophila embryonala neuron kultur
- Håll unga vuxna flugor i äppeljuice agar flaskor kompletteras med torrjäst i 1-2 dagar innan samla embryon feller neuron förberedelse.
- På uppsamlings dag, i syfte att synkronisera de uppsamlade embryona, flugor överföring vuxen till ett färskt äppeljuice agar ampull under 1 timme precollection i ljus och kassera dessa embryon.
- Överför flyger till en ny äppeljuice agar flaska, samla embryon för 1 timme, och föra över flugorna till en annan flaska för en timme, både i mörker för att öka embryot avkastningen.
- Ta bort de vuxna flugorna från äppeljuice agar flaskan och låt embryona utvecklas ytterligare 4 timmar till stegen 9-11 i rumstemperatur (4-6 h gamla embryon är mellan etapp 9-11).
- Ta bort embryon genom att spruta in vatten i flaskor och lossa embryon från äppeljuice agar med en liten pensel (minst 10 embryon krävs för en bra neuron prep).
- Överför embryon till en 100 ìm nylonnät cell sil med en överföringspipett att dränera vatten (försköljning överföringspipetten i Drosophila embryo tvättbuffert, 0,4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Samla embryona från silen genom att använda en liten målarpensel, och överföra dem till ett 1,5 ml mikrorör fyllt med 1 ml Drosophila embryo tvätt (Obs: Rengör alla agar-eller bomullsfibrer med hjälp av pensel eller pipettspetsar). I detta protokoll kommer den 1,5 ml mikrorör med en matchande engångs pellet mortelstöt.
- Tvätta embryon i Drosophila embryo tvätt 3x.
- Dechorionate embryona i en fräsch 1:01 lösning av kommersiellt blekmedel och 95% etanol i 10 min [VARNING: blekmedel kan orsaka irritation i ögon, näsa, hals och hud].
- Flytta till vävnadsodling huva, och tvätta embryon 2x i kompletterat Schneiders medium.
- Lämna 200-300 pl medium i röret med embryona, och försiktigt mekaniskt dissociera dechorionated embryon med hjälp Kimble Chase engångspellets pestles som har steriliserats med 70% etanol (slipa 10-15x).
- Centrifugera den homogeniserade blandningen vid 20 x g under 2 min och transfer supernatanten till ett nytt rör. [Detta steg är valfritt, det hjälper att ta bort embryot skräp]
- Centrifugera supernatanten vid 550 x g under 2 min för att pelletera cellerna.
- Suspendera pelleten i 500 l kompletterat Schneiders medium och snurra celler nedåt igen vid 550 xg under 2 min, upprepa resuspension-spinning cykel en gång.
- Slutligen suspendera pelleten i ~ 100 l kompletteras Schneiders medium och platta cellerna på en 25 mm ConA-belagd täckglas i en steril 35 mm petriskål. Inkubera i 10 minuter för att tillåta cellvidhäftning.
- Tillsätt 2 ml kompletterat Schneiders medium med 5 mikroM CytoD att dränka täckglas med bifogade celler.
- Inkubera skålen i en fuktad 25 ° C inkubator över natt innan avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila S2 celler fästa på ConA-belagda täckglas sprids i en platt rund "pannkaka" form (fig. 1A och 1C). Men när S2 celler pläterade på täckglas i närvaro av CytoD och får spridas under 2-3 timmar, bildar de långa tunna processer fyllda av parallella mikrotubuli (figur 1B och 1D). Dessa mikrotubuli har enhetlig polaritet med plus slutar ut 7. Time-lapse fluorescens avbildning av Drosophila S2 stabilt uttrycker mCherry-tubulin visar att processerna är mycket dynamisk, särskilt under de första 60 min efter infästning (Figur 2). Efter 1 h inkubation, saktar deras tillväxt ner och 2-3 timmars inkubering säkerställer att majoriteten av cellerna har fullvuxen processer. Här visar vi två representativa exempel på organell transporter längs mikrotubuli i S2-celler, lysosomer (märkta med Lysotracker, 200 nM, figurerna 3A-B 7 (stabil transfektion med Pac-GFP-SKL, Siffror 3D-E). Time-lapse bilder av cellerna togs varje 1 sekund för 61 bildrutor med en Nikon TU-2000 inverterat mikroskop utrustat med ett perfekt fokussystem (Nikon) och CoolSnap CCD-kamera (Roper Scientific) drivs av metamorfa programvara. En 100-W halogen ljuskälla användes för fluorescens excitation att minimera fotoblekning och fototoxicitet. Var och en av de 61 bilder i sekvens färgkodade efter baren på övre högra och bilder är överlagrade för att skapa färgkodade låtar. Således rör sig partiklar genererade regnbåge spår, medan stationära partiklar dök vit 10. ImageJ insticksOral Färg-kod ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) användes för denna bearbetning. För kvantitativ analys av organell rörelse vi använde DiaTrack programvara (Semasopht Inc.), vi endast vissaorganeller som är lokaliserade i processer, eftersom de lätt kan spåras och polariteten hos mikrotubuli spår är känd. Figurer 3C och 3F visar typiska distributioner av retrograda och anterohastigheter erhållna genom lysosomer och peroxisomer spårning, respektive.
Liknande tekniker används i vårt labb för analys av organell transporter i primära odlade nervceller. Nervceller är en dominerande celltyp i blandade kulturer som erhållits från steg 9-11 embryon. Efter natten odling de är lätta att känna igen genom karakteristiska cellform med neuriter som är över 50 um långa (Figur 4A). Dessa celler är också positivt för den pan-neuronal markör, elav 21 (figur 4B och 4B). Processer i nervceller är fyllda med mikrotubuli (figur 4B och 4B "). Vi kan spåra organell transporter längs neurites med hjälp av techniques beskrivits ovan för S2-celler. Mitokondrier kan märkas med mitokondriell GFP (Mito-GFP) under kontroll av en motorisk neuronspecifik promotor D42 22 (fig 5A och 5A), och peroxisomer kan markeras genom injektion av DNA som kodar en peroxisom inriktade mCherry 7, in syncytial embryon BLASTODERM stadium (figur 5B och 5B ").
Figur 1. Drosophila S2 process bildning inducerad av CytoD. (A, C) Drosophila S2-celler fästa och spridas i plattas och runda former när de ströks ut i ConA-förbelagda täckglas. (B, D) S2-celler utstrukna i närvaro av 2,5 | im CytoD bildar långa processer fyllda med mikrotubuli efter 3 timmars inkubering. <strong> AB och CD sänds ljus och fluorescerande mCherry-märkt tubulin bilder, respektive. Skala bar, 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Time lapse av processer tillväxt i en Drosophila S2-cell. Fluorescens tidsförlopp av en Drosophila S2-cell som uttrycker mCherry-tubulin i närvaro av 2,5 mikroM CytoD. Siffrorna anger tid efter cellen fäster täckglas. Skala bar, 5 ìm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Organell transporter i Drosophila S2-celler. (AC) Lysosome rörelse i Drosophila S2-cell. Ett representativt 1 min-lysosom transporter (märkt med 200 nM Lysotracker) i en cell (A, DIC bild) representerad av den artificiella Temporal-kod (skapad av FIJI) (B). Hastigheter som erhållits från analysen av lysosom rörelse spåras i processer (DiaTrack, 663 partiklar i 23 celler) (C). (DF) Peroxisome rörelse i Drosophila S2-cell. Ett representativt 1 min-peroxisome transporter (märkt med pMT-GFP-SKL) i en cell (D, DIC bild) representerad av den artificiella Temporal-kod (skapad av FIJI) (E). Hastigheter som erhållits från analysen av peroxisomal rörelse spåras i processer (DiaTrack, 228 partiklar i 20 celler) (F). Observera att lysosomer flytta med längre och snabbare banor än peroxisomer. Skala bar, 5 ìm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Primär Drosophila nervceller från natten kultur. (A) En övernattning odlade Drosophila neuron har karakteristisk neuronal morfologi med långa neuriter. (B) Den neuron uttryckte en pan-neuronal markör, elav (röd i B och vitt i B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) och med långa neurites fyllda med mikrotubuli (gröna i B och vitt i B'', DM1α , 1:1000). Scale Bar, 5 ìm. nk "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Organelle transport i odlade Drosophila nervceller. (A) Mitokondrierna i en odlad Drosophila neuron markeras av Mito-GFP under kontroll av en motorisk neuronspecifik promotor, D42. (A ') 5 min-mitokondrie rörelse i (A) representeras av den artificiella Oral-färgkoden (som skapats av Fiji). (B) Peroxisomer i en kultiverad Drosophila neuron präglas av PAC-SKL-mCherry, injiceras i tidiga syncytial BLASTODERM scenembryon. (B ') 2 min-peroxisome rörelse i (B) representeras av den artificiella Temporal-Färgkod (skapad av FIJI). Skala bar, 5 ìm.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
| Organelle | Beskrivning |
| Peroxisomer | Peroxisomal inriktning signal 1 tripeptid (SKL) märkta med en FP 25 |
| Mitokondrier | Mitokondriell inriktning sekvens av cytokrom c oxidas subenhet VIII taggade med en FP 26 |
| Mitokondrier | Mitotracker (Dye som ackumuleras i aktiva mitokondrier) 27 |
| Lysosomes | Lysotracker (Dye, som ackumuleras i cellfack med låg inre pH) 28 |
Tabell 1. Vanligaste märkningsstrategier organell.
I tabellen sammanfattas de vanligaste strategierna organell märkning i vävnadsodlingsceller, inklusive märkning av peroxisomer, mitokondrier och lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi detaljerade protokoll för att studera mikrotubuli beroende godstransporter i Drosophila S2-celler och primära neuron kultur. Både S2 processer och neuriter är strukturer fyllda av buntade mikrotubuli matriser som fungerar som spår för organell transporter.
Två strategier användes typiskt för att märka organeller: transfektion av vektorer som kodar för ett fluorescerande protein med en organell-målsökningssekvensen eller färgning med fluorescerande färgämnen tillsättas direkt till kulturerna. Vanliga exempel på fraktetiketter är listade i tabell 1. Transient transfektion eller RNAi behandlingar av Drosophila S2-celler vid behov utförs i suspension 4,6,7,9,10 innan cellerna stryks ut på täckglas för avbildning.
För att få tillförlitliga resultat i S2 cellförsök, är det viktigt att hålla följande i åtanke:
- Plate cellerna vid optimal täthet för avbildning. Hög hålasitet kommer att resultera i överlappande processer från olika celler, medan vid låga densitetscellerna har dålig livskraft och är oförmögna att bilda processer.
- Låt S2 celler att helt utveckla processer. Vi inkubera rutinmässigt celler för 2 timmar efter bordläggning men inkubationstid på upp till 24 timmar kan utföras vid behov.
- S2-celler måste behandlas med CytoD innan de fäster ConA belagda täckglas. Lägga drogen efter celler är fästa kommer inte framkalla processer bildas.
- Vid användning av färgämnen, ändra prover för att avbilda varje 20-25 min, långvarig inkubation av celler med antingen Mitotracker eller Lysotracker är giftigt för cellerna.
- Vi spårar brukar godstransporter i S2-celler med bildhantering för 1 min vid 1 bild / sek. Under detta tillstånd celler inte är fotoskadad.
- Endast analysera organell rörelse i cellprocesser. Organelle tätheten i cellkroppen är för hög för pålitlig spårning och polariteten av rörelsen inte lätt skulle kunna bestämmas.
I detta protokoll, kan du behöva betala uppmärksamhet till flera viktiga steg som anges nedan:
- Stage embryon korrekt. De insamlade embryon måste synkroniseras och iscensatt för att stegen 9-11, när neuroblast delaminering från ektoderm inträffar. Staging embryon för tidigt eller för sent kan leda till färre neuroblaster i varje embryo och därmed fel på avverknings nervceller av de dissocierade embryon.
- Dechorionate embryon till höger utsträckning (alla embryon ändra färg från helt vit till öppnare). Under-dechorionation kan leda till svårigheter att embryot dissociation, medan över dechorionation kan skada embryona. Decemberhorionated embryon blir mycket klibbig och mjuk, och därmed försöka undvika pipettering eller röra vid embryon med pipettspetsar under tvättsteg före dissociation.
- Var särskilt uppmärksam på embryon dissociation. Vi finner att plast engångspellets pestles och matchande mikrorör ger bättre dissociation än ett glas Dounce homogenisator, särskilt för mindre antal embryon. Under-dissociation kommer att lämna stora cellkluster, medan över-dissociation leder till celler sammanbrott och massiv ansamling av cellrester. Justera dissociation nivån enligt embryonumren.
- Bordläggningen neuron på glaset täckglas till en rimlig täthet. Trångt nervceller utvecklas vanligtvis mycket korta neuriter, medan glesa nervceller misslyckas ofta med att överleva.
Dessutom märkte vi att det primära cellkulturer ofta innehåller muskelceller, och blodkroppar. Overnight behandling med CytoD hjälper till att minska antalet muskelceller och blodkroppar, och främjas neuritutväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar ledamöterna i Gelfand labbet som bidragit till utvecklingen av dessa protokoll. Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Science of the National Institutes of Health i utmärkelsen nummer R01GM052111 till VIG och baskiska regeringen Institutionen för utbildning, universitet och forskning inom utmärkelsen nummer BFI-2011-295 till UDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
