Summary
Células S2 de Drosophila y neuronas cultivadas son grandes sistemas de obtención de imágenes de orgánulos de transporte con motor in vivo. Aquí se describen los protocolos detallados para el cultivo de ambos tipos de células, su imagen y el análisis de los transportes.
Abstract
Células S2 de Drosophila sembraron en un cubreobjetos en la presencia de cualquier largos procesos no ramificados forma de fármaco actina-despolimerización de microtúbulos llenas de manera uniforme polarizadas. Orgánulos se mueven a lo largo de estos procesos a través de los motores de microtúbulos. Fácil mantenimiento, alta sensibilidad a la proteína mediada por RNAi knock-down y un procedimiento eficaz para la creación de líneas celulares estables que hacen las células S2 de Drosophila un sistema modelo ideal para estudiar el transporte de carga por la imagen en vivo. Los resultados obtenidos con las células S2 se pueden aplicar además a un fisiológicamente más relevantes del sistema: el transporte axonal en las neuronas primarias cultivadas a partir de embriones de Drosophila disociadas. Neuronas cultivadas crecen neuritas largas llenas de microtúbulos agrupados, muy similares a los procesos de S2. Al igual que en las células S2, orgánulos en neuronas cultivadas pueden ser visualizados por cualquiera de los tintes fluorescentes-orgánulo específico o mediante el uso de marcadores de orgánulos fluorescentes codificadas por ADN inyectado en embriones tempranos o expresado en transgenic vuela. Por lo tanto, el transporte de orgánulos se puede grabar fácilmente en neuronas cultivadas en cubreobjetos de vidrio utilizando imágenes viviente. Aquí se describen los procedimientos para el cultivo y la visualización de transporte de carga en las células S2 de Drosophila y neuronas primarias. Creemos que estos protocolos hacen ambos sistemas accesibles para los laboratorios que estudian el transporte de carga.
Introduction
Células S2 de Drosophila han ganado cada vez más popularidad para el estudio de muchos procesos celulares. Estas células se obtuvieron originalmente de tripsinizadas embriones en fase tardía de OregonR Drosophila melanogaster y mantienen características similares a los macrófagos 1. Células S2 de Drosophila ofrecen muchas ventajas sobre otras líneas celulares. Ellos se cultivan a 25 ° C sin CO 2, y se pueden obtener imágenes para muchas horas a temperatura ambiente sin la necesidad de calefacción o el intercambio de gases. Más importante aún, las células S2 de Drosophila son muy sensibles al tratamiento de RNAi desmontables permitiendo alta eficiencia de proteínas de interés. Células S2 son altamente transfectables y líneas celulares estables se pueden seleccionar en menos de cuatro semanas para permitir la expresión ectópica estable de proteínas de interés. S2 células crecen normalmente bien vagamente unidos pero no se diseminan en un frasco o en suspensión. Ellos pueden ser inducidas a propagarse en cubreobjetos recubiertos previamente con un Conca lectina plantaNavalin A (ConA). La periferia de las células propagadas es especialmente fina y por lo tanto es ideal para microscopia de células vivas. Protocolos detallados para el cultivo las células S2, el tratamiento de RNAi, las imágenes en directo y de inmunotinción se pueden encontrar en la literatura 2,3. Nuestro laboratorio ha adoptado células S2 como un sistema modelo para estudiar el transporte de carga a base de microtúbulos. Células S2 de Drosophila tratados con cualquier fármaco que despolimeriza o corta la F-actina, tales como citocalasina D (CytoD), crecen los procesos largos llenos de microtúbulos uniformemente polarizadas 4 -10, lo que lo convierte en un sistema ideal para estudiar el movimiento de carga a lo largo de los microtúbulos arrays. Diferentes parámetros de transporte en estos procesos (es decir. Trayectorias longitudes, velocidades, direccionalidad, etc) se pueden medir fácilmente utilizando el software de partículas de seguimiento automatizado, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). Estas propiedades hacen que las células S2 un sistema atractivo para el estudio de transporte de carga a lo largo de los microtúbulos en células de cultivo de tejidos.
Los experimentos piloto en células S2 se pueden extender a un modelo fisiológicamente importante de los estudios de transporte de carga en las neuronas primarias de Drosophila. De manera similar a las células S2, neuronas cultivadas a partir de embriones disociadas son permeables a las moléculas pequeñas tales como colorantes y los inhibidores de, y de alta resolución de imágenes en vivo de orgánulos de transporte se pueden realizar en las neuronas a temperatura ambiente. Usando Drosophila con diferentes antecedentes genéticos, podemos examinar la función de genes en las neuronas primarias por nocaut (mutaciones genéticas de pérdida de la función), caída (inyección de dsRNA o expresión) o la expresión ectópica (moscas transgénicas). En concreto, la fragmentación de los filamentos de actina utilizando tratamiento CytoD no impide el crecimiento de neuritas, sino que crecen más rápido, y por lo tanto podemos estudiar microtúbulos Dependeorgánulos de transporte NT en las neuronas tratadas con CytoD sin la influencia de los filamentos de actina 11. Por lo tanto, los cultivos primarios de neuronas combinan las ventajas de las células de cultivo de tejidos y vuelan genética, lo que hace que sea un gran sistema para estudiar el transporte de carga en un sistema fisiológico relevante 10,12. Dado que algunas enfermedades neurodegenerativas familiares podrían ser causados por o asociados con defectos de transporte de carga (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson 13, la enfermedad de Huntington 14, la enfermedad de Alzheimer 15,16, la esclerosis lateral amiotrófica / ALS 17, síndrome HMN7B y Perry 18,19 y el tipo de ataxia espinocerebelosa 5/SCA5 20), cultivos primarios de neuronas pueden ser útiles en el análisis de los efectos de las mutaciones específicas que causan estas enfermedades en el transporte dependiente de microtúbulos.
Por último, las propiedades importantes de transporte dependiente de microtúbulos están bien conservadas entre los mamíferos y las moscas, pero
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Protocol
1. Células S2 de Drosophila
Preparación de cubreobjetos recubiertos de ConA
- Coloque cubreobjetos en un bastidor de cerámica y lavarlos por inmersión en ácido crómico durante 1 hora. [ATENCION: El ácido crómico es corrosivo y puede provocar irritación de los ojos, la nariz, la garganta y la piel].
- Enjuagar a fondo con cubreobjetos en constante funcionamiento dH 2 O durante 30 minutos hasta que el ácido está completamente lavada.
- Deje que entre aire cubreobjetos secos y recubrirlos con ConA (solución de 0,5 mg / ml en dH 2 O) durante 30 min.
- Enjuague cubreobjetos con dH 2 O durante 15 minutos y dejar secar al aire. Cubreobjetos ConA recubiertos pueden ser almacenados hasta por 1 mes.
Plating las células
- Permitir que las células S2 a crecer de forma exponencial en 2 matraces T25 o T75 cm dependiendo del número de células requeridas para el experimento.
- Cuente la densidad de células utilizando un hemocitómetro. Añadir 1 ml de crecimiento medio (por ejemplo Insectos-Xpress) en un 35 mm de placa de cultivo de tejidos con cubreobjetos recubiertos con ConA, y suavemente transferir ~ 1 x 10 5 células a la placa. Esta densidad celular es óptima para la imagen porque los procesos de diferentes células no se superponen.
- Con el fin de inducir la formación de procesos, inmediatamente después de la siembra añadir 1 ml de medio con 5 mM CytoD al plato (a la concentración final de 2,5 M CytoD). Permitir el desarrollo completo de los procesos mediante la incubación de las células por lo menos durante 2 horas a 25 º C antes de formación de imágenes.
2. Drosophila Primaria Neurona Cultura
Preparación para la cultura de las neuronas
- Preparar Drosophila medio de crecimiento neuronal (medio de Schneider suplementado con: suero 20% bovino fetal, inactivado por calor a 55 º C durante 30 min; 5 mg / ml de insulina; 100 g / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina; 10 mg / ml de tetraciclina) . Este apoyomedio de complementado Schneider se puede almacenar a 4 º C durante 6 meses.
- Preparar manzana viales de agar jugo de recogida de embriones de Drosophila (22,5 g de agar, 12,0 g de sacarosa y 750 ml de H 2 O en un matraz de 2 litros; autoclave durante 20-25 minutos, añadir 250 ml de zumo de manzana y verter ~ 10 ml en cada Drosophila vial, después de la solidificación, enchufe viales con bolas de algodón, y envolver los viales con un envoltorio de plástico para alimentos para evitar el exceso de secado de los alimentos). El jugo de manzana en frascos de agar se puede almacenar a 4 º C en bolsas de plástico bien cerrados durante 4 semanas.
- Coat 25 mm cubreobjetos circulares ácido-lavado con ConA (ver detalles en el Protocolo para las células Drosophila S2) y esterilizar bajo luz ultravioleta durante 10 a 15 min. Estos cubreobjetos se pueden almacenar durante un mes.
La cultura de las neuronas embrionarias de Drosophila
- Mantenga joven adulto vuela en manzana viales de agar jugo suplementados con levadura seca durante 1-2 días antes de la recolección de los embriones fo la preparación de la neurona.
- En el día de la recolección, con el fin de sincronizar los embriones recogidos, la transferencia de moscas adultas a una manzana fresca jugo vial agar durante 1 hora precolección a la luz y desechar estos embriones.
- Transferencia vuela a un nuevo vial de agar jugo de manzana, recoger los embriones durante 1 hora, y la transferencia de las moscas a otro vial durante otra hora, tanto en la oscuridad para aumentar el rendimiento de embriones.
- Retire las moscas adultas en circulación vial agar jugo de manzana y dejar que los embriones se desarrollan otras 4 horas para las etapas 9-11 a temperatura ambiente (4-6 embriones-hr de edad son entre la etapa 9-11).
- Retire los embriones por chorros de agua en viales y aflojando los embriones del agar jugo de manzana con un pincel pequeño (al menos 10 embriones son necesarios para una buena preparación de la neurona).
- La transferencia de los embriones a un 100 m de malla de nylon filtro de células con una pipeta de transferencia para drenar el agua (prefregado la pipeta de transferencia en Drosophila tampón de lavado de embriones, el 0,4% de NaCl, 0,03% TritónX-100).
- Recoger los embriones de la coladera usando un pequeño pincel, y transferirlos en un microtubo de 1.5 ml llena con 1 ml de lavado de embriones de Drosophila (Nota: limpiar las fibras de agar o de algodón con el pincel o la punta de la pipeta). En este protocolo, el 1,5 ml microtubos viene con un juego maja pellet desechable.
- Lave los embriones en Drosophila lavado de embriones de 3 aumentos.
- Dechorionate los embriones en una solución fresca 1:01 de lejía comercial y etanol al 95% durante 10 min [PRECAUCIÓN: lejía puede causar irritación en los ojos, la nariz, la garganta y la piel].
- Mover a la campana de cultivo de tejidos, y lavar los embriones 2x en medio de Schneider complementado.
- Deja 200-300 l medio en el tubo con los embriones, y suavemente se disocian mecánicamente embriones dechorionated usando Kimble Chase majas pellets desechables que han sido esterilizadas con etanol al 70% (moler 10-15x).
- Centrifugar la mezcla se homogeneizó a 20 xg durante 2 min, y TRAnsfer el sobrenadante a un tubo nuevo. [Este paso es opcional, sino que ayuda a eliminar los desechos del embrión]
- Centrifugar el sobrenadante a 550 xg durante 2 min para sedimentar las células.
- Resuspender el sedimento en 500 l complementado medianas y centrifugado células de Schneider de nuevo a 550 xg durante 2 min, repetir el ciclo de la resuspensión de hilatura de una vez.
- Finalmente resuspender el precipitado en ~ 100 l complementado medio de Schneider y placa las células sobre un portaobjetos recubierto con ConA 25 mm en un 35 mm placa de Petri estéril. Incubar durante 10 min para permitir la unión celular.
- Añadir 2 ml de medio suplementado de Schneider, con 5 mM CytoD para sumergir el cubreobjetos con células unidas.
- Incubar el plato en un humidificado incubadora de 25 º C durante la noche antes de exponer.
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Representative Results
Células Drosophila S2 adjunta en la propagación cubreobjetos recubiertos de ConA en un plano y redondo en forma de "panqueque" (Figuras 1A y 1C). Sin embargo, cuando las células S2 sembraron en cubreobjetos en la presencia de CytoD y permitir que se extienda durante 2-3 h, forman procesos largos y delgados ocupados por los microtúbulos paralelos (Figuras 1B y 1D). Estos microtúbulos tienen polaridad uniforme con plus-termina a 7. Time-lapse de imágenes de fluorescencia de Drosophila S2 expresan establemente mCherry-tubulina muestra que los procesos son muy dinámicos, sobre todo durante los primeros 60 minutos después de la unión (Figura 2). Después de 1 h de incubación, su crecimiento se ralentiza y 2-3 horas de incubación se asegura de que la mayoría de las células tienen procesos crecido totalmente. Aquí mostramos dos ejemplos representativos de orgánulos de transporte a lo largo de los microtúbulos en las células S2, lisosomas (marcados con LysoTracker, 200 nm; figuras 3A-B 7 (transfección estable con Pac-GFP-SKL; figuras 3D-E). Imágenes Time-lapse de las células fueron tomadas cada 1 s durante 61 fotogramas mediante un microscopio invertido Nikon TU-2000 equipado con un sistema perfecto de enfoque (Nikon) y la cámara Coolsnap CCD (Roper Científico), impulsados por el software Metamorph. Una fuente de luz halógena de 100 W se utiliza para la excitación de fluorescencia para minimizar photobleaching y fototoxicidad. Cada uno de los 61 cuadros en secuencia fue de color codificados según la barra de arriba a la derecha y las imágenes fueron superpuestas para generar pistas codificadas por colores. Así se mueven las partículas generadas pistas del arco iris, mientras que las partículas estacionarias aparecieron blanco 10. ImageJ plug-in temporal Código de color ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) se utilizó para este procesamiento. Para el análisis cuantitativo del movimiento de orgánulos utilizamos software DiaTrack (Semasopht Inc.), sólo seleccionamosorgánulos que se localizan en los procesos, ya que se pueden rastrear fácilmente y la polaridad de pistas de microtúbulos se conoce. Figuras 3C y 3F muestran distribuciones típicas de las velocidades retrógradas y anterógrada obtenidos por los lisosomas y los peroxisomas de seguimiento, respectivamente.
Técnicas similares se utilizan en el laboratorio para el análisis del transporte de orgánulos en las neuronas de cultivo primario. Las neuronas son un tipo de célula predominante en cultivos mixtos obtenidos de la etapa 9-11 embriones. Después del cultivo durante la noche que son fáciles de reconocer por la forma celular característica con neuritas que son más de 50 micras de largo (Figura 4A). Estas células también son positivas para el marcador pan-neuronal, Elav 21 (Figuras 4B y 4B '). Procesos en las neuronas se llenan con los microtúbulos (Figuras 4B y 4B "). Podemos rastrear orgánulos de transporte a lo largo de las neuritas utilizando el techniques descrito anteriormente para las células S2. Las mitocondrias pueden ser etiquetados con las buenas prácticas agrarias mitocondrial (Mito-GFP) bajo el control de un motor específico de neuronas promotor D42 22 (Figuras 5A y 5A), y los peroxisomas se pueden marcar mediante la inyección de ADN que codifica una peroxisomas orientada mCherry 7, en sincitial embriones en estadio de blastodermo (Figuras 5B y 5B ').
Figura 1. Formación de proceso de Drosophila S2 inducida por CytoD. Células (A, C) de Drosophila S2 se unen y se extienden en formas redondas y aplanar cuando chapada en cubreobjetos recubiertos previamente con ConA. Células (B, D) S2 chapados en presencia de 2,5 micras CytoD forman procesos largos llenos de microtúbulos después de 3 horas de incubación. <strong> AB y CD se transmiten luz y las imágenes de tubulina mCherry-etiquetados fluorescentes, respectivamente. La barra de escala, 10 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Lapso de tiempo de crecimiento de los procesos en una célula S2 de Drosophila. Fluorescencia de lapso de tiempo de una célula S2 de Drosophila que expresan mCherry-tubulina en la presencia de 2,5 M CytoD. Los números indican el tiempo después de la célula se unen a la cubreobjetos. La barra de escala, 5 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Movimiento de transporte de orgánulos en células Drosophila S2. (AC) Lisosoma en células Drosophila S2. A 1 de transporte-min lisosoma representante (marcado con 200 nM Lysotracker) en (A, DIC imagen) representado por el temporal-Code artificial (creado por Fiji) (B) de una célula. Velocidades obtenidas a partir del análisis de movimiento lisosoma rastreado en los procesos (DiaTrack; 663 partículas en 23 células) (C). Movimiento (DF) de peroxisomas en células S2 de Drosophila. A 1 de transporte-min peroxisomas representante (marcado con pMT-GFP-SKL) en una celda (D, imagen DIC), representado por el temporal-Code artificial (creado por Fiji) (E). Velocidades obtenidas a partir del análisis de movimiento de peroxisomas rastreado en los procesos (DiaTrack; 228 partículas en 20 células) (F). Tenga en cuenta que los lisosomas se mueven con trayectorias más largas y más rápidas que los peroxisomas. La barra de escala, 5 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. Neuronas de Drosophila primaria de cultivo de una noche. (A) un cultivaron durante la noche neurona de Drosophila tiene características morfología neuronal con neuritas largas. (B) La neurona expresa un marcador pan-neuronal, Elav (rojo en B y blanco en B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) y con neuritas largas llenas con los microtúbulos (en verde en B y blanco en B'', DM1α , 1:1000). Escala Bar, 5 micras. nk "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 5. Orgánulos de transporte en las neuronas cultivadas de Drosophila. (A) Las mitocondrias en una neurona de Drosophila cultivadas marcado por Mito-GFP bajo el control de un promotor específico de neuronas del motor, D42. (A ') 5 min movimiento mitocondrial en (A) está representada por el código temporal-color artificial (creado por Fiji). (B) Los peroxisomas en una neurona de Drosophila cultivadas marcado por Pac-SKL-mCherry, inyectadas en embriones tempranos etapa blastodermo sincitial. (B ') 2 min movimiento de peroxisomas en (B) está representada por el código temporal-color artificial (creado por Fiji). La barra de escala, 5 micras.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
| Orgánulos | Descripción |
| Los peroxisomas | Señal de direccionamiento Peroxisomal 1 tripéptido (SKL) etiquetados con un FP 25 |
| Las mitocondrias | Secuencia de direccionamiento mitocondrial de citocromo c oxidasa subunidad VIII etiquetado con un FP 26 |
| Las mitocondrias | Mitotracker (tinte que se acumula en la mitocondria activa) 27 |
| Los lisosomas | Lysotracker (tinte que se acumula en celularcompartimentos con bajo pH interno) 28 |
Tabla 1. Estrategias de etiquetado orgánulos más comunes.
Esta tabla resume las estrategias de etiquetado orgánulo más comunes en células de cultivo de tejidos, incluido el etiquetado de los peroxisomas, las mitocondrias y los lisosomas.
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Discussion
Aquí presentamos los protocolos detallados para estudiar el transporte de carga dependiente de microtúbulos en las células S2 de Drosophila y la cultura de la neurona primaria. Ambos procesos y neuritas S2 son estructuras llenas de paquetes de microtúbulos arrays que sirven como pistas para el transporte de orgánulos.
Dos estrategias se utilizan típicamente a orgánulos de la etiqueta: la transfección de vectores que codifican una proteína fluorescente con una secuencia de orgánulo-focalización o tinción con colorantes fluorescentes añadidos directamente a los cultivos. Los ejemplos más comunes de etiquetas de carga se listan en la Tabla 1. La transfección transitoria o tratamientos de RNAi de células S2 de Drosophila si es necesario se lleva a cabo en suspensión 4,6,7,9,10 antes de células se extendieron en placas sobre cubreobjetos para formación de imágenes.
Con el fin de obtener resultados fiables en los experimentos de células S2, es importante tener los siguientes puntos en mente:
- Las células de placas a la densidad óptima para la imagen. Alta densidad dará lugar a la superposición de los procesos de diferentes células, mientras que en las células de baja densidad tienen escasa viabilidad y son incapaces de formar procesos.
- Permiten a las células S2 para desarrollar por completo los procesos. Nosotros habitualmente incuban las células durante 2 horas después de la siembra, pero la incubación hasta 24 horas se puede realizar si es necesario.
- S2 células deben ser tratados con CytoD antes que conceden a ConA cubreobjetos recubiertos. Adición de la droga después de células se unen no inducir la formación de procesos.
- Cuando el uso de tintes, muestras de cambio para imágenes de todos los 20-25 min; incubación a largo plazo de las células, ya sea con Mitotracker o Lysotracker es tóxico para las células.
- Por lo general, un seguimiento de transporte de carga en las células S2 por imágenes durante 1 minuto a 1 fotograma / seg. Bajo esta condición, las células no son foto-dañada.
- Sólo analizar el movimiento de orgánulos en los procesos celulares. Orgánulos densidad en el cuerpo de la célula es demasiado alta para el seguimiento fiable y la polaridad del movimiento no se pudieron determinar fácilmente.
En este protocolo, es posible que tenga que pagar atenciones a varios pasos clave que figuran a continuación:
- Embriones correctamente escenario. Los embriones recogidos deben sincronizarse y puesta en escena de las etapas 9-11, cuando se produce neuroblast delaminación del ectodermo. Staging embriones demasiado pronto o demasiado tarde puede resultar en un menor número de neuroblastos en cada embrión y por lo tanto el fracaso de las neuronas de recolección de los embriones disociadas.
- Embriones Dechorionate en la medida correcta (todos los embriones cambien de color de completamente blanco a transparente). Sub-dechorionation podría conducir a la dificultad en la disociación del embrión, mientras que el exceso de dechorionation podría dañar los embriones. Diciembreembriones horionated vuelven muy pegajosa y suave, por lo que tratan de evitar la pipeta o tocar los embriones con puntas de pipeta durante las etapas de lavado antes de la disociación.
- Preste especial atención a los embriones de disociación. Encontramos que las majas de pellets de plástico desechables y microtubos emparejan dan una mejor disociación de un homogeneizador Dounce de vidrio, especialmente para pequeño número de embriones. Sub-disociación dejará grupos de células grandes, mientras que el exceso de disociación será llevar a la ruptura de células y la acumulación masiva de restos celulares. Ajuste el nivel de disociación de acuerdo a los números de embriones.
- Plating neurona en el portaobjetos de vidrio a una densidad razonable. Neuronas Crowded generalmente se desarrollan neuritas muy cortos, mientras que las neuronas dispersas a menudo no logran sobrevivir.
Además, nos dimos cuenta de que los cultivos de células primarias a menudo contienen células musculares y células sanguíneas. El tratamiento durante la noche con CytoD ayuda a reducir el número de las células del músculo y células de la sangre, y promoveres el crecimiento de neuritas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Gelfand que contribuyeron al desarrollo de estos protocolos. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número de concesión R01GM052111 a VIG y por el Departamento del Gobierno Vasco de Educación, Universidades e Investigación con el número premio BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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