Summary
Drosophila S2-Zellen und kultivierten Neuronen sind große Systeme für die Bildgebung von motorbetriebenen Organellentransport in vivo. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Kultivierung beider Zelltypen, die Abbildung und Analyse des Verkehrs.
Abstract
Drosophila-S2-Zellen auf einem Deckglas überzogen in das Vorhandensein von Aktin-Depolymerisation Arzneiform lange unverzweigte Prozesse einheitlich polarisiert Mikrotubuli gefüllt. Organellen bewegen sich entlang dieser Prozesse durch Mikrotubuli-Motoren. Einfache Wartung, hohe Empfindlichkeit für RNAi-vermittelten Protein-knock-down und effiziente Verfahren für die Erstellung von stabilen Zelllinien machen Drosophila S2-Zellen ein ideales Modellsystem für Frachttransport durch Live-Bildgebung zu untersuchen. Axonalen Transport in primären Neuronen von Drosophila-Embryonen kultiviert dissoziiert: Die mit S2-Zellen erhaltenen Ergebnisse weiter zu einer physiologisch relevanten System angewendet werden. Kultivierten Neuronen wachsen lange Neuriten mit gebündelten Mikrotubuli, sehr ähnlich S2 Prozesse gefüllt. Wie in S2-Zellen, Organellen kann in kultivierten Neuronen entweder durch Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen oder durch Verwendung von fluoreszierenden Organellen-Marker von DNA kodiert visualisiert werden in frühen Embryonen injiziert oder in transgen exprimiertic fliegt. Daher kann Organelltransport leicht in Neuronen auf Deckgläser mit lebendigen Bild kultiviert aufgezeichnet werden. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung und Visualisierung Frachtverkehr in Drosophila S2-Zellen und primäre Neuronen. Wir glauben, dass diese Protokolle beide Systeme zugänglich für Labore Studium Frachtverkehr zu machen.
Introduction
Drosophila S2-Zellen haben sich zunehmender Beliebtheit für das Studium vieler zellulärer Prozesse gewonnen. Diese Zellen wurden ursprünglich aus Trypsin späten Stadium Embryonen von Drosophila melanogaster OregonR erhalten und zu pflegen Makrophagen-ähnliche Funktionen ein. Drosophila S2-Zellen bieten viele Vorteile gegenüber anderen Zelllinien. Sie kultiviert bei 25 ° C ohne CO 2, und kann für viele Stunden bei Raumtemperatur abgebildet werden, ohne die Notwendigkeit einer Erwärmung oder Gasaustausch. Noch wichtiger ist, Drosophila S2-Zellen sind sehr empfindlich auf RNAi-Behandlung ermöglicht hohe Effizienz Knockdown von Proteinen von Interesse. S2-Zellen sind sehr transfizierbar und stabile Zelllinien können in weniger als vier Wochen gewählt werden, um stabile ektopische Expression von Proteinen von Interesse zu ermöglichen. S2-Zellen normal wachsen entweder lose befestigt, aber nicht auf einen Kolben oder in Suspension zu verbreiten. Sie können bewogen, auf Deckgläsern mit einer Pflanze Lektin conca schwemmt verteilt werdennavalin A (ConA). Der Umfang der ausgebreiteten Zellen ist besonders dünn und ist somit ideal für Lebendzellmikroskopie. Detaillierte Protokolle für die S2-Zellen Kultur, RNAi-Behandlung, Live-Licht-Bildgebung und Immunfärbung in der Literatur 2,3 gefunden werden. Unser Labor hat S2-Zellen als Modellsystem, um Mikrotubuli-basierte Frachtverkehr zu studieren. Drosophila S2-Zellen mit jedem Medikament, das depolymerisiert oder trennt F-Actin, wie Cytochalasin D (CytoD) behandelt, wachsen lange Prozesse einheitlich polarisiert Mikrotubuli 4 gefüllt angenommen -10, die es zu einem idealen System für Fracht Bewegung entlang Mikrotubuli studieren. Verschiedene Parameter des Verkehrs in diesen Prozessen (. Dh Trajektorien Längen, Geschwindigkeiten, Richtungs etc) leicht mit automatisierten Partikel-Tracking-Software, DiaTrack (Semasopht gemessen werden: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Diese Eigenschaften machen S2-Zellen eine ansprechende System für die Untersuchung Frachtverkehr entlang von Mikrotubuli in Gewebekulturzellen.
Pilotversuche in S2-Zellen kann zu einer physiologisch wichtigen Modell der Frachttransportstudien in Drosophila primären Neuronen erweitert werden. Ähnlich S2-Zellen sind Neuronen aus dissoziierten Embryonen kultiviert durchlässig für kleine Moleküle wie Farbstoffe und Inhibitoren und hochauflösende Live-Darstellung von Organellen-Transport in Nervenzellen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Mit Drosophila mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen können wir Gen-Funktion in primären Neuronen untersuchen, durch Knockout (genetische loss-of-function Mutationen), Zuschlag (dsRNA Injektion oder Ausdruck) oder ektopische Expression (transgene Linie). Insbesondere ist die Fragmentierung von Aktin-Filamenten mit CytoD Behandlung nicht verhindert Neuritenwachstum, sondern sie schneller wachsen und somit können wir Mikrotubuli-depende studierennt Organellentransport in CytoD behandelten Neuronen ohne den Einfluss von Aktin-Filamenten 11. Daher primären neuronalen Kulturen verbinden die Vorteile von Gewebekulturzellen und fliegen Genetik, das es ein großartiges System für Frachttransport in einem physiologisch relevanten System 10,12 studieren. Da mehrere familiäre neurodegenerative Erkrankungen durch verursacht werden oder mit Frachttransportdefekte (zB Parkinson-Krankheit 13 in Verbindung gebracht werden, Huntington-Krankheit 14, Alzheimer-Krankheit 15,16, Amyotrophe Lateralsklerose / ALS 17, HMN7B und Perry-Syndrom 18,19 und Spinocerebellar Ataxie Typ 5/SCA5 20) können primären neuronalen Kulturen nützlich bei der Analyse der Wirkungen von bestimmten Mutationen, die diese Krankheiten auf Mikrotubuli-abhängigen Transport sein.
Schließlich werden wichtige Eigenschaften der Mikrotubuli-abhängigen Transport auch zwischen Säugetieren und Fliegen erhalten, aber
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Protocol
1. Drosophila S2-Zellen
Herstellung von ConA beschichtete Deck
- Zeigen Deckgläser in einem Keramik-Zahnstange und waschen Sie sie durch Chromsäure Eintauchen für 1 Stunde. [ACHTUNG: Chromsäure ist ätzend und kann zu Reizungen von Augen, Nase, Rachen und Haut verursachen].
- Deckgläser gründlich mit ständig laufenden dH 2 O für 30 Minuten, bis die Säure vollständig ausgewaschen.
- Lassen Deckgläser der Luft trocknen und überziehen sie mit ConA (0,5 mg / ml Lösung in dH 2 O) für 30 min.
- Spülen Deckgläser mit dH 2 O für 15 Minuten und lassen Sie sie an der Luft trocknen. ConA-beschichtete Deckgläser bis zu 1 Monat gelagert werden.
Ausplattieren der Zellen
- S2-Zellen zu ermöglichen, exponentiell in Abhängigkeit von der Anzahl von Zellen für das Experiment erforderlich wachsen T25 oder T75-cm 2-Kolben.
- Zählen Sie die Zelldichte mit einer Zählkammer. 1 ml Wachstums medium (zB Insect-Xpress) in eine 35-mm-Gewebekulturschale mit ConA-beschichtete Deckglas, und sanft über ~ 1 x 10 5 Zellen in die Schale. Diese Zelldichte ist optimal für Abbildungsverfahren, weil aus verschiedenen Zellen nicht überlappen.
- Um die Bildung von Prozessen zu veranlassen, unmittelbar nach dem Plattieren 1ml Medium mit 5 uM CytoD zu der Schale (bis zu einer Endkonzentration von 2,5 uM CytoD). Ermöglichen eine vollständige Entwicklung von Verfahren durch Inkubation der Zellen mindestens 2 h bei 25 º C vor der Bilderzeugung.
2. Drosophila Primär Neuron Kultur
Vorbereitung für Neuronenkultur
- Vorbereitung Drosophila neuronalen Wachstumsmedium (Schneider-Medium, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, Wärme bei 55 º C für 30 min inaktiviert, 5 ug / ml Insulin, 100 ug / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 ug / ml Tetracyclin) . Diese supergänzt Schneider Medium kann bei 4 º C für 6 Monate gelagert werden.
- Bereiten Apfelsaft-Agar Fläschchen für das Sammeln von Drosophila-Embryonen (22,5 g Agar-Agar, 12,0 g Saccharose und 750 ml H 2 O in einem 2-Liter-Kolben, Autoklaven für 20-25 Minuten, fügen Sie 250 ml Apfelsaft und gießen ~ 10 ml in jede Drosophila Fläschchen, nach der Erstarrung, stecken Fläschchen mit Watte, und wickeln Sie Flaschen mit Plastikfolie über dem Trocknen der Lebensmittel zu vermeiden). Der Apfelsaft in Agar Fläschchen können bei 4 º C in gut verschlossenen Plastikbeutel für 4 Wochen gelagert werden.
- Coat säuregewaschen 25 mm Kreis Deckgläser mit ConA (siehe Details im Protokoll für die Drosophila-S2-Zellen) und sterilisieren sie unter UV-Licht für 10-15 min. Diese Deck kann für einen Monat gelagert werden.
Drosophila embryonalen Neuronenkultur
- Halten junger Erwachsener fliegt in Apfelsaft-Agar-Röhrchen mit Trockenhefe ergänzt für 1-2 Tage vor dem Sammeln Embryonen foder Neuron Vorbereitung.
- Am Tag sammeln, um die gesammelten Embryonen zu synchronisieren, fliegt Transfer Erwachsenen zu einem frischen Apfelsaft-Agar Fläschchen für 1 Stunde in Precollection Licht und entsorgen diese Embryonen.
- Über fliegt zu einer neuen Flasche Apfelsaft-Agar, sammeln Embryonen für 1 Stunde, und übertragen die Fliegen zu einem anderen Fläschchen für eine weitere Stunde, sowohl in dunklen, um den Embryo Ausbeute zu erhöhen.
- Entfernen Sie die erwachsenen Fliegen aus der Apfelsaft-Agar-Röhrchen und lasse die Embryonen entwickeln, weitere 4 h bis 11.09 Stufen bei Raumtemperatur (4-6 h alten Embryonen sind zwischen Bühne 9-11).
- Entfernen Sie die Embryonen durch Spritzen von Wasser in Flaschen und Lösen der Embryonen aus der Apfelsaft-Agar mit einem kleinen Pinsel (mindestens 10 Embryonen werden für eine gute Vorbereitung Neuron erforderlich).
- Übertragen Sie die Embryonen auf einen 100 um Nylon-Mesh Zellsieb mit einer Transferpipette Wasser abzulassen (Vorspülen die Transferpipette in Drosophila-Embryo Waschpuffer, 0,4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Sammeln Sie die Embryonen aus dem Sieb mit einem kleinen Pinsel, und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Mikroröhrchen mit 1 ml Wasch Drosophila-Embryo (Hinweis: Reinigen keine Agar-oder Baumwollfasern mit dem Pinsel oder Pipettenspitzen) gefüllt. In diesem Protokoll wird das 1,5 ml-Mikroröhrchen mit einem passenden Einweg Pellets zerstoßen.
- In Drosophila-Embryo Wasch 3x waschen Embryonen.
- Dechorionate die Embryonen in einer frischen 1:1-Lösung von Handelsbleichmittel und 95% Ethanol für 10 min [ACHTUNG: Bleichmittel kann zu Reizungen von Augen, Nase, Rachen und Haut verursachen].
- Gehen Sie zur Gewebekultur Kapuze, und waschen Embryonen in 2x ergänzt Schneider Medium.
- Lassen 200-300 ul Medium in der Röhre mit den Embryonen, und sanft mechanisch distanzieren dechorionated Embryonen mit Kimble Chase Einweg-Pellet Stößel, die von 70% Ethanol sterilisiert worden sind (schleifen 10-15x).
- Zentrifugieren der homogenisierten Mischung bei 20 × g für 2 min und transfer der Überstand in ein frisches Röhrchen. [Dieser Schritt ist optional, es hilft, um Schmutz zu entfernen Embryo]
- Zentrifugieren des Überstandes bei 550 g für 2 min Zellen zu pelletieren.
- Das Pellet in 500 ul wieder ergänzt Schneider mittel-und Spin-Zellen nach unten bei 550 g für 2 min; wiederholen Sie die Aufwirbelung Spinnzyklus einmal.
- Schließlich das Pellet in 100 ul ~ ergänzt Schneider-Medium und der Platte der Zellen auf einer 25 mm ConA-beschichtete Deckglas in einem sterilen 35 mm Petrischale. Inkubation für 10 min auf die Zellhaftung zu ermöglichen.
- 2 ml ergänzt Schneider-Medium, mit 5 &mgr; M CytoD auf das Deckglas mit anhaftenden Zellen einzutauchen.
- Inkubieren Sie die Schale in einem befeuchteten 25 ° C Inkubator über Nacht vor der Bildgebung.
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Representative Results
Drosophila-S2-Zellen auf der ConA-beschichtete Deckglas Ausbreitung in eine flache runde "Pfannkuchen"-Form (1A und 1C) angebracht. Wenn jedoch S2-Zellen auf Deckgläsern ausplattiert in Gegenwart CytoD und für 2-3 Stunden verteilt, bilden sie lange dünne Prozesse parallel Mikrotubuli (Fig. 1B und 1D) gefüllt. Diese Mikrotubuli einheitliche Polarität mit Plus-Enden aus 7. Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Drosophila S2 stabil mCherry-Tubulin exprimieren, zeigt, dass die Prozesse sehr dynamisch, vor allem während der ersten 60 Minuten nach der Befestigung (Abbildung 2). Nach 1 Stunde Inkubation, verlangsamt sich ihr Wachstum nach unten und 2-3 Stunden Inkubation sorgt dafür, dass die Mehrheit der Zellen ausgewachsen Prozesse. Hier zeigen wir zwei repräsentative Beispiele von Organellen Transport entlang von Mikrotubuli in S2-Zellen, Lysosomen (mit LysoTracker, 200 nM beschriftet; den 3A-B 7 (stabile Transfektion mit Pac-GFP-markierten SKL, Fig. 3D-E). Zeitraffer-Aufnahmen der Zellen wurden alle 1 Sek. für 61 Frames mit einer Nikon TU-2000 mit einem inversen Mikroskop Perfect Focus System (Nikon) und Coolsnap CCD-Kamera (Roper Scientific) von Metamorph-Software angetrieben ausgestattet übernommen. Ein 100-Watt-Halogenlichtquelle wurde für die Fluoreszenzanregung zur Minimierung Bleichen und Phototoxizität. Jede der 61 Frames in der Sequenz wurde nach der Farbleiste am oberen rechten und Bilder wurden überlagert, um farbcodierte Spuren erzeugen codiert. So bewegten Teilchen erzeugt Regenbogen-Tracks, während stationäre Teilchen erschien weiß 10. ImageJ Plug-in-Temporal-Farbcode ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) wurde für diese Verarbeitung verwendet. Für die quantitative Analyse von Organellen Bewegung, die wir verwendet DiaTrack Software (Semasopht Inc.), wählen wir nurOrganellen, die in Prozessen lokalisiert sind, weil sie leicht verfolgt werden und die Polarität der Mikrotubuli-Tracks bekannt ist. 3C und 3F zeigen typische Verteilungen der retrograde und anterograde Geschwindigkeiten von Lysosomen und Peroxisomen Tracking erhalten wurden.
Ähnliche Techniken werden in unserem Labor zur Analyse von Organellen-Transport in primären kultivierten Neuronen verwendet. Neuronen sind eine vorherrschende Zelltyp in Mischkulturen von Stufe 9-11 Embryonen gewonnen. Nach Kultivierung über Nacht sind sie leicht zu durch charakteristische Zellform mit Neuriten, die über 50 um lang (4A) sind zu erkennen. Diese Zellen sind auch positiv für die pan-neuronalen Marker, Elav 21 (Fig. 4B und 4B). Prozesse in den Neuronen sind mit Mikrotubuli (4B und 4B ") gefüllt. Wir können Organellen-Transport entlang der Neuriten verfolgen mit der teoben für S2-Zellen beschrieben chniques. Mitochondrien mit mitochondrialen GFP (Mito-GFP) unter der Kontrolle eines Motor Neuron-spezifische Promotor D42 22 (5A und 5A ') gekennzeichnet werden und Peroxisomen kann durch Injektion von DNA markiert werden Peroxisomen eine gezielte mCherry 7 kodiert, in Syncytial Blastodermstadium Embryonen (5B und 5B).
Abbildung 1. Drosophila-S2-Verfahren Bildung durch CytoD induziert. (A, C) Drosophila S2-Zellen anlagern und ausbreiten zu glätten und runden Formen, wenn in ConA-schwemmt Deckgläser plattiert. (B, D) S2-Zellen in Gegenwart von 2,5 um plattiert CytoD bilden lange Prozesse mit Mikrotubuli nach 3 h Inkubation gefüllt. <strong> AB und CD sind Durchlicht-und Fluoreszenz mCherry-markierten Tubulin-Bilder auf. Maßstabsbalken, 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Zeitraffer von Prozessen Wachstum in einem Drosophila S2 Zellen. Fluoreszenz Zeitraffer eines Drosophila S2 Zellen mCherry-Tubulin exprimieren, in Gegenwart von 2,5 uM CytoD. Die Zahlen geben die Zeit, nachdem die Zelle zu befestigen, um das Deckglas. Maßstabsbalken, 5 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Organellentransport in Drosophila S2-Zellen. (AC) Lysosom Bewegung in Drosophila-S2-Zelle. Ein Vertreter 1 min-Lysosom Transport in einer Zelle (A, DIC-Bild) durch die künstliche Temporal-Kodex (erstellt von Fidschi) (B) vertreten (mit 200 nM Lysotracker beschriftet). Geschwindigkeiten von der Analyse der Bewegung in Lysosomen Verfahren verfolgt erhalten (DiaTrack; 663 Teilchen in 23 Zellen) (C). (DF) Peroxisomen-Bewegung in Drosophila-S2-Zelle. Ein Vertreter 1 min-Peroxisomen-Transport in einer Zelle (D, DIC-Bild) durch die künstliche Temporal-Kodex (erstellt von Fidschi) (E) vertreten (mit pMT-GFP-SKL beschriftet). Geschwindigkeiten von der Analyse der Bewegung in Peroxisomen Verfahren verfolgt erhalten (DiaTrack; 228 Teilchen in 20 Zellen) (F). Beachten Sie, dass Lysosomen bewegen mit mehr und schneller als Trajektorien Peroxisomen. Maßstabsbalken, 5 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. Primäre Neuronen aus Drosophila-Nacht-Kultur. (A) Eine Übernachtung kultivierten Drosophila Neuron hat charakteristische neuronale Morphologie mit langen Neuriten. (B) Das Neuron ausgedrückt eine pan-neuronalen Marker, Elav (rot und weiß in B in B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) und mit langen Neuriten mit Mikrotubuli (grün und weiß in B in B gefüllt'', DM1α , 1:1000). Scale-Bar, 5 um. nk "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
5. Organellentransport in kultivierten Drosophila-Neuronen. (A) Mitochondrien in einer kultivierten Drosophila-Neuron von Mito-GFP unter der Kontrolle eines Motorneuronenspezifische Promotor, D42 gekennzeichnet. (A ') 5 min-mitochondriale Bewegung in (A) wird durch die künstliche Temporal-Farbcode (erstellt von Fidschi) vertreten. (B) Peroxisomen in einer kultivierten Drosophila Neuron von Pac-SKL-mCherry markiert, injiziert in frühe-Syncytial Blastodermstadium Embryonen. (B ') 2-min-Peroxisomen-Bewegung in (B) wird von der künstlichen Temporal-Farbcode (erstellt von Fidschi) vertreten. Maßstabsbalken, 5 um.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Organell | Beschreibung |
| Peroxisomen | Peroxisomale Targeting-Signal ein Tripeptid (SKL) mit einer FP 25 getaggt |
| Mitochondrien | Mitochondriale Targeting-Sequenz von Cytochrom-c-Oxidase Untereinheit VIII markiert mit einem FP 26 |
| Mitochondrien | Mitotracker (Dye, die in aktiven Mitochondrien akkumuliert) 27 |
| Lysosomen | Lysotracker (Dye, die in zellulären sammeltFächer mit geringen internen pH-Wert) 28 |
Tabelle 1. Die häufigsten Organelle Markierungsstrategien.
In dieser Tabelle sind die häufigsten Organelle Markierungsstrategien in Gewebekulturzellen, einschließlich der Kennzeichnung von Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen.
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Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle für die Untersuchung der Mikrotubuli-abhängige Frachtverkehr in Drosophila S2-Zellen und primäre Neuronenkultur. Beide S2 Prozesse und Neuriten sind Strukturen von gebündelten Mikrotubuli-Arrays, die als Spuren für Organellentransport dienen gefüllt.
Zwei Strategien werden in der Regel Label Organellen verwendet: Transfektion von Vektoren ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Organell-Targeting-Sequenz oder Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen direkt an Kulturen aufgenommen. Übliche Beispiele von Ladungs Etiketten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die transiente Transfektion oder RNAi-Behandlungen von Drosophila S2-Zellen bei Bedarf in Suspension 4,6,7,9,10 durchgeführt, bevor Zellen auf Deckgläser für die Bildgebung plattiert.
Um zuverlässige Ergebnisse in S2 Zellexperimenten zu bekommen, ist es wichtig, die folgenden Punkte zu beachten:
- Teller Zellen bei optimalen Dichte für die Bildgebung. Hohe Höhlesität in Überlappung der Prozesse von verschiedenen Zellen führen, während bei geringer Dichte Zellen haben eine schlechte Lebensfähigkeit und sind nicht in der Lage, Prozesse zu bilden.
- Lassen S2-Zellen vollständig zu entwickeln Prozesse. Wir routinemäßig inkubieren Zellen für 2 Stunden nach dem Ausstreichen aber Inkubationszeit von bis zu 24 Stunden können bei Bedarf durchgeführt werden.
- S2 Zellen müssen mit CytoD behandelt werden, bevor sie an ConA beschichtete Deckgläser befestigen. Hinzufügen das Medikament nach Zellen angebracht sind, werden nicht Prozesse induzieren.
- Bei der Verwendung von Farbstoffen, ändern Proben für Untersuchungen alle 20-25 min; Langzeit-Inkubation von Zellen mit entweder Mitotracker oder Lysotracker ist für die Zellen toxisch.
- Wir verfolgen in der Regel Frachtverkehr in S2-Zellen durch Abbildung 1 min bei 1 Bild / Sek. Unter dieser Bedingung Zellen sind nicht foto beschädigt.
- Organellen Bewegung nur in Zellprozesse zu analysieren. Organell Dichte im Zellkörper zu hoch ist für eine zuverlässige Verfolgung und Polarität der Bewegung nicht ohne weiteres bestimmt werden.
In diesem Protokoll müssen Sie Aufmerksamkeit auf einige wichtige Schritte aufgeführt zahlen:
- Embryonen richtig. Die gesammelten Embryonen müssen synchronisiert und inszeniert, um Stufen 9-11 werden, wenn Neuroblast Delamination aus dem Ektoderm auftritt. Staging Embryonen zu früh oder zu spät kommt, kann in weniger Neuroblasten in jedem Embryo führen und somit zum Ausfall der Ernte Neuronen aus den Embryonen gespalten.
- Dechorionate Embryonen im richtigen Maß (alle Embryonen verfärben sich von ganz weiß mehr transparent). Unter-dechorionation zu Schwierigkeiten bei der Dissoziation Embryo führen können, während Über dechorionation konnte die Embryonen schädigen. Dezemberhorionated Embryonen werden sehr klebrig und weich, so versuchen Sie, Pipettieren oder Berühren der Embryonen mit Pipettenspitzen während der Waschschritte vor der Dissoziation zu vermeiden.
- Achten Sie besonders auf die Dissoziation Embryonen. Wir finden, dass Kunststoff-Einweg-Pellet Stößel und passenden Mikroröhrchen bessere Dissoziation als ein Glas Dounce Homogenisator, vor allem für kleine Anzahl von Embryonen. Unter-Dissoziation großen Zellhaufen hinterlassen wird, während über-Dissoziation wird, um Zellen zu Zusammenbruch und massive Anhäufung von Zelltrümmern führen. Einstellen der Spaltebene nach den Embryo Zahlen.
- Plating Neuron auf das Deckglas auf einen angemessenen Dichte. Crowded Neuronen entwickeln sich meist sehr kurzen Neuriten, während spärlich Neuronen oft nicht überleben.
Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die primäre Zellkulturen enthalten oft Muskelzellen und Blutzellen. Übernachtung Behandlung mit CytoD hilft, die Anzahl der Muskelzelle und Blutzellen zu reduzieren und förderns Neuritenwachstum.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Gelfand Labor, die zur Entwicklung dieser Protokolle beigetragen. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde durch das National Institute of General Medical Science der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer R01GM052111 an die VIG und baskischen Regierung Ministerium für Bildung, Hochschulen und Forschung unter Verleihungsnummer BFI-2011-295 bis UDC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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