Summary
果蝇 S2细胞和培养的神经元是用于体内电机驱动的细胞器运输的成像大的系统。在这里，我们将详细介绍协议进行培养两种细胞类型，它们的成像和运输分析。
Abstract
果蝇 S2细胞中填充有一致极化微管任何肌动蛋白解聚药物形式长直链的过程的存在下接种在盖玻片上。沿着这些过程通过微管马达的细胞器移动。易维护，高灵敏度RNAi介导的蛋白敲除和有效的程序来创建稳定的细胞系使果蝇 S2细胞中一种理想的模型系统，通过实时成像研究货物运输。与S2细胞中获得的结果可被进一步应用到多种生理上相关的系统：在从分离的果蝇胚胎培养的原代神经元的轴突运输。培养神经元长出长突起充满微管捆绑在一起，非常类似于S2的过程。像S2细胞，在培养的神经元细胞器可以通过两种细胞器特异性的荧光染料，或通过使用由DNA编码的荧光标记的细胞器可视化注入到早期胚胎或表达transgenIC苍蝇。因此，细胞器运输可以很容易地记录在神经元上使用生活成像盖玻片培养。在这里，我们描述了在果蝇 S2细胞和原代神经元培养和可视化货物运输手续。我们相信，这些协议使两个系统的实验室研究货物运输方便。
Introduction
果蝇 S2细胞中都获得了学习许多细胞过程日益普及。这些细胞最初是从OregonR 果蝇的胰酶消化后期胚胎获得和维持巨噬细胞样特性1。 果蝇 S2细胞中提供了许多优于其他细胞系。它们被培养于25℃无CO 2，并且可以成像在室温下几个小时，无需加热或气体交换的需要。更重要的是， 果蝇 S2细胞对RNAi的治疗，允许感兴趣的蛋白质的高效率击倒非常敏感。 S2细胞的高效转染和稳定的细胞系可以在不到四周的时间进行选择，以便感兴趣的蛋白的稳定表达。 S2细胞正常生长，无论是松散连接，但不能涂在烧瓶或悬浮状态。它们可以诱导铺展在盖玻片预涂用植物凝集素孔卡navalin A（刀豆）。扩散细胞的周围是特别薄的，因此是理想的活细胞显微镜检查。为S2细胞培养，RNA干扰治疗，现场光成像和免疫组化的详细方案可以在文献2,3中找到。我们的实验室已采用S2细胞作为模型系统来研究微管为基础的货物运输。与任何药物解聚或切断的F-肌动蛋白，如细 胞松弛素D（CytoD）处理过的果蝇 S2细胞，长长的过程充满了均匀极化微管4 -10，这使它成为理想的系统来研究货物运输沿微管阵列。交通工具在这些过程中不同的参数（ 即轨迹长度，速度，方向性等 ）可以使用自动化粒子跟踪软件，DiaTrack（Semasopht很容易地测量：http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423;博士。帕斯卡尔·瓦洛：http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx＃A4）。这些特性使得S2细胞一个有吸引力的制度研究货物运输以及在组织培养细胞中的微管。
在S2细胞试验实验可以扩展到在果蝇原代神经元的货物运输研究的一个重要的生理模型。类似于S2细胞，神经元的解离胚胎培养是可渗透的小分子物质，例如染料和抑制剂，并且可以在神经元中，在室温下进行的细胞器运输的高分辨率实时成像。利用果蝇与不同的遗传背景，我们可以通过基因敲除（丧失功能的基因突变）研究基因功能的初级神经元，击倒（双链RNA注射或表达式）或异位表达（转基因果蝇）。具体来说，使用CytoD治疗肌动蛋白丝的碎片不会阻止轴突生长，相反，他们成长得更快，因此，我们可以研究微管depende在CytoD处理的神经元新台币细胞器运输无肌动蛋白的影响丝11。因此，初级神经元培养结合组织培养细胞的优点和飞遗传学，这使它成为一个伟大的系统来研究货物运输在生理相关的系统10,12。因为几个家族性神经变性疾病可能由以下原因引起或与货物运输的缺陷（ 例如，帕金森氏病13相关联，亨廷顿氏病14，阿尔茨海默氏病15,16，肌萎缩性侧索硬化症/ ALS 17，HMN7B和佩里综合征18,19，和脊髓小脑性共济失调型5/SCA5 20），原代神经元培养物可以是在特定突变对微管依赖性的传输造成这些疾病的影响的分析是有用的。
最后，微管依赖性运输的重要性能哺乳动物和果蝇之间非常保守，但
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Protocol
1， 果蝇 S2细胞
刀豆蛋白A包被盖玻片的制备
- 放置盖玻片在陶瓷机架和用铬酸浸渍冲洗1小时。 [注意：铬酸具有腐蚀性，可引起眼睛发炎，鼻子，喉咙和皮肤。
- 与不断运行DH 2 O 30分钟，直至酸被完全冲洗掉彻底冲洗盖玻片。
- 让盖玻片空气干燥，被毛他们的ConA（0.5毫克/毫升的溶液在DH 2 O）30分钟。
- 冲洗盖玻片与DH 2 O 15分钟，让他们风干。刀豆蛋白A包被盖玻片可以存储长达1个月。
电镀细胞
- 允许S2细胞在T25或T75厘米2烧瓶成倍增长取决于实验所需的细胞数。
- 使用血细胞计数器计数细胞密度。加入1 ml增长米edium（例如昆虫随心）到35毫米组织培养皿用ConA-涂覆的盖玻片，并轻轻〜1×10 5个细胞转移到培养皿中。此细胞密度是最佳的成像，因为从不同的细胞过程中不重叠。
- 为了诱导形成的过程中，电镀加入1ml培养基用5μMCytoD到培养皿（以2.5μMCytoD的终浓度）后立即使用。由成像前25ºC培养细胞至少2小时让流程全面发展。
2， 果蝇初级神经元培养
神经元培养制备
- 制备果蝇神经细胞生长培养基（Schneider的培养基补充有20％胎牛血清，热失活，在55℃，30分钟，5微克/毫升的胰岛素，100微克/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，10微克/毫升四环素） 。这SUP施耐德执行完成的介质可以储存在4℃6个月。
- 制备苹果汁琼脂小瓶中，收集果蝇胚胎（22.5克琼脂，12.0克蔗糖和750毫升水2 O中的2升烧瓶中，高压釜为20-25分钟;添加250毫升苹果汁和倒〜10毫升到每个果蝇小瓶;凝固后，插上小瓶用棉球和小瓶包装用塑料食品包装，避免了对粮食的干燥）。在琼脂瓶苹果汁可以储存在4℃在密封良好的塑料包装袋，共4周。
- 外套酸洗25毫米圈盖玻片经ConA（见议定书果蝇 S2细胞中的细节）和消毒的紫外光下10-15分钟。这些盖玻片可存放一个月。
果蝇胚胎神经元培养
- 保持年轻的成年苍蝇在收集胚胎f前辅以干酵母1-2天苹果汁琼脂小瓶或神经元的准备。
- 在收集日，以同步采集胚胎，转成蝇的新鲜苹果汁琼脂小瓶中光1小时precollection并丢弃这些胚胎。
- 转让苍蝇到一个新的苹果汁琼脂小瓶中，收集的胚胎为1小时，并在果蝇转移到另一个小瓶中一小时，无论是在黑暗中以提高胚胎产量。
- 从苹果汁琼脂小瓶中取出成蝇，让胚胎发育另4小时到9-11级在室温下（4-6小时大的胚胎阶段是9-11之间）。
- 通过水喷到小瓶中，并从松动的苹果汁琼脂用小画笔的胚胎（需要至少10胚胎一个良好的神经元准备）将胚胎。
- 胚胎转移到一个100微米的尼龙网细胞滤网用移液管排出的水（预先清洗吸在果蝇胚胎的洗涤缓冲液，0.4％氯化钠，0.03％的Triton移液管X-100）。
- 从使用小画笔过滤收集胚胎，并把它们转移至1.5 ml微量离心管装入1ml 果蝇胚胎洗涤（注：使用画笔或移液管尖端清洁任何琼脂或棉纤维）。在这个协议中，1.5mL微管带有一个匹配的一次性颗粒杵。
- 在果蝇胚胎洗3次洗胚胎。
- Dechorionate胚胎在一个新的1点01分解决方案的商业漂白剂和95％乙醇10分钟[注意：漂白剂，会刺激眼睛，鼻子，喉咙和皮肤。
- 移动到组织培养罩，并在补充施耐德的媒体洗胚胎2倍。
- 离开200-300微升培养基在管中的胚胎，并使用已灭菌的70％乙醇（碾10-15X）金布尔大通弃沉淀杵轻轻机械解离dechorionated胚胎。
- 在20×g离心离心匀浆混合物，持续2分钟，和TRAnsfer上清至新管。 [这一步是可选的，它有助于消除胚胎碎片]
- 离心的上清液在550×g离心2分钟以沉淀细胞。
- 重悬浮颗粒在500微升，在550×g离心2分钟再补充施耐德的媒体和自旋向下的细胞，重复的再悬浮，动感单车一次。
- 最后悬浮在〜100微升补充施耐德的介质中的颗粒和板上的细胞到25毫米的无菌35毫米培养皿刀豆蛋白A包被的盖玻片。孵育10分钟以使细胞附着。
- 加入2ml补充施耐德的介质，具有5微米CytoD淹没盖玻片与贴壁细胞。
- 成像前孵育菜在湿润的25℃培养箱中过夜。
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Representative Results
果蝇 S2细胞附着在刀豆蛋白A包被的盖玻片蔓延成扁圆形“煎饼”形（ 图1A和1C）。然而，当镀上盖玻片S2细胞中CytoD的存在下，并使其分散为2-3小时，便形成细长的进程填充平行微管（ 图1B和1D）。这些微管具有统一的极性与加结束了7。的果蝇 S2稳定表达的mCherry-微管蛋白的时间推移荧光成像表明，过程是非常动态的，特别是在连接后的第一个60分钟（ 图2）。经过1小时培养，其生长减慢和2-3小时培养，确保大部分细胞已完全成熟的过程。这里，我们表明细胞器运输的两个有代表性的例子，沿着在S2细胞的微管，溶酶体（标有LysoTracker，200nM的; 图3A-B GFP，GFP-SKL）7（稳定转染与PAC-GFP-SKL; 图3D-E）。细胞的延时图像拍摄每1秒为使用尼康TU-2000倒置显微镜配备用MetaMorph软件驱动的完美对焦系统（尼康）和Coolsnap CCD相机（罗珀科学）61帧。一个100瓦卤素光源被用于荧光激发，以减少光漂白和光毒性。根据栏右上角和叠加，以产生彩色编码的音轨的每个图像序列中的61帧是颜色编码。因此，运动粒子产生彩虹的轨道，而静止的粒子出现白色10。 ImageJ的插件时空色码（ http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ）用于该处理。对于我们使用DiaTrack软件（Semasopht Inc。）的细胞器运动的定量分析，我们只选择被定位于处理，因为它们可以很容易地跟踪和微管轨道的极性是已知的细胞器。 图3C和3F显示了由溶酶体和过氧化物酶体跟踪获得逆行及顺行速度典型分布，分别为。
类似的技术用在我们的实验室在原代培养的神经元细胞器运输的分析。神经元是从9-11级胚胎获得的混合培养一个主要的细胞类型。过夜培养后，它们很容易通过特性的细胞形状与突起的超过50微米长（ 图4A）来识别。这些细胞也积极为泛神经元标记，ELAV 21（ 图4B和4B'）。在神经元过程都充满了微管（ 图4B和4B“），我们可以使用特沿轴突追踪细胞器运输上述的S2细胞chniques。线粒体可以下运动神经元特异性启动子D42 22（ 图5A和5A'）的控制来标记线粒体绿色荧光蛋白（美图-GFP）和过氧化物酶体可以通过注射的DNA编码过氧化物酶体定位的mCherry 7，成合胞被标记胚期胚胎（ 图5B和图5B'）。
图1。 果蝇 S2过程形成诱导CytoD（A，C） 果蝇 S2细胞附着并蔓延到扁平和圆形的形状时，刀豆，预涂盖玻片电镀。 （B，D）S2细胞接种于2.5微米CytoD存在形成长流程后3小时培养充满了微管。 <STRONG> AB和CD都透射光和荧光的mCherry标记的微管蛋白的图像，分别。比例尺，10微米。 点击这里查看大图 。
图2。过程生长在果蝇 S2细胞缩时。荧光的时间推移果蝇 S2细胞中表达的mCherry-微管蛋白在2.5μMCytoD的存在。的数字表示后的细胞附着在盖玻片上的时间。比例尺，5微米。 点击这里查看大图 。
图3。在果蝇 S2细胞中的细胞器运输。（AC）溶酶体运动在果蝇 S2细胞中。代表1分钟-溶酶体运输中一个小区（A，DIC图像）由人工颞代码（斐济创建）（B）表示（标记为含有200nM Lysotracker）。从溶酶体运动跟踪的过程的分析得到的速度（DiaTrack; 663颗粒在23个细胞）（℃）。 （DF），过氧化物酶体运动在果蝇 S2细胞中。代表1分钟，过氧化物酶体输送在一个单元（D，DIC图像）由人工颞代码（斐济创建的）（E）表示的（标记的pMT-GFP-SKL）。由过氧化物酶体运动跟踪的过程的分析得到的速度（DiaTrack; 228颗粒在20个细胞）（F）。需要注意的是溶酶体移动与长，快轨迹比过氧化物酶体。比例尺，5微米。 点击这里查看大图 。
图4。初级果蝇神经元过夜培养（A）隔夜培养的果蝇神经元具有特征性神经元形态有长突起。 （B）中的神经元表达的泛神经元标记，ELAV（红色B和白色中B'，DSHB，7E8A10，1:100），并与长突起填充有微管（绿色中B和白色中乙''，DM1α ，1:1000）。比例尺，5微米。 NK“>点击这里查看大图。
图5。细胞器运输在培养果蝇的神经元（A）线粒体在培养的果蝇神经元下运动神经元特异性启动子，D42控制标记美图-GFP。 （A'）5分钟线粒体运动（A）是由人工颞色码（斐济创建）来表示。 （ 二）在培养的果蝇神经元标记PAC-SKL-mCherry的过氧化物酶体，注入到早期的合胞体胚期胚胎。 （B'）2分钟-过氧化物酶体运动（B）是由人工颞色码（斐济创建）来表示。比例尺，5微米。ig5highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
| 细胞器 | 描述 |
| 过氧化物酶体 | 过氧化物酶体定位信号1三肽（SKL）标记一个FP 25 |
| 线粒体 | 细胞色素C氧化酶VIII亚基线粒体定位序列标记一个FP 26 |
| 线粒体 | MITOTRACKER（染料聚集在活跃的线粒体）27 |
| 溶酶体 | Lysotracker（染料聚集在细胞与车厢内部的低pH值）28 |
表1中。最常见的细胞器标记策略。
此表总结在组织培养细胞中最常见的细胞器标记策略，包括过氧化物酶标记的，线粒体和溶酶体。
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Discussion
在这里，我们提出了用于研究微管相关货物运输在果蝇 S2细胞和原代神经元培养的详细协议。既S2流程和突起结构是由充满了作为细胞器运输轨道捆绑微管阵列。
两种策略通常用于标签的细胞器：载体与细胞器靶向序列或染色用直接添加到培养物的荧光染料编码荧光蛋白的转染。的货物标签，常见的例子列于表1中 。 果蝇 S2细胞中瞬时转染或RNAi治疗，如果必要的悬浮4,6,7,9,10进行细胞接种于盖玻片前成像。
为了得到可靠的结果，在S2细胞的实验中，保持以下几点是重要的：
- 板细胞成像最佳密度。高登SITY将导致不同的细胞过程中重叠，而在低浓度细胞有生存力差，不能形成过程。
- 让S2细胞完全开发流程。我们经常电镀但孵育达24小时，可以根据需要进行后孵育细胞2小时。
- S2细胞必须CytoD对待他们重视对ConA涂盖玻片之前。加入药物的细胞附着后不会诱发过程形成。
- 当使用染料，改变样品的成像每隔20-25分钟;细胞长期培养用任一MITOTRACKER或Lysotracker是对细胞有毒。
- 我们通常追踪货物运输的S2细胞成像1分钟1帧/秒。在此条件下细胞不是光致损坏。
- 只分析细胞器运动的细胞过程。在细胞体的细胞器密度过高，可靠跟踪和运动的极性不能被容易地确定。
在这个协议中，您可能需要支付关注下面列出几个关键步骤：
- 期胚胎正常。所收集的胚胎需要同步并上演到9-11级，当来自外胚层神经细胞发生脱层。过早分段胚胎或太晚，可能会导致在每个胚胎的成神经细胞较少，因此失败收获的神经元输出的解离胚胎。
- Dechorionate胚胎向右程度（所有胚胎全白颜色变为更透明）。下dechorionation可能导致难以在胚胎离解，而过度dechorionation可能会破坏胚胎。十二月horionated胚胎变得非常粘软，从而尽量避免或移液过程中解离之前的清洗步骤与接触移液器吸头的胚胎。
- 要特别注意胚胎分离。我们发现，一次性塑料颗粒杵和匹配使微管比玻璃Dounce匀浆更好的解离，特别是对少数胚胎。下解离会留下大量的细胞团，而过度分解会导致细胞破裂和细胞碎片的大量积累。根据胚胎数调整的离解程度。
- 在玻璃盖玻片电镀神经元到一个合理的密度。拥挤的神经元通常开发很短的突起，而神经元稀疏经常无法生存。
此外，我们注意到，原代细胞培养物往往含有肌细胞和血细胞。与CytoD过夜治疗有助于减少肌肉细胞和血细胞的数量，并促进•本轴突生长。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢实验室的Gelfand谁促成了这些协议的开发成员。研究报告本出版物中由美国国立卫生研究院国家普通医学科学根据奖号R01GM052111国家学院VIG和教育巴斯克政府部门，大学和研究下奖号BFI-2011-295 UDC得到了支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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