Summary
תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.
Abstract
תאי דרוזופילה S2 מצופים על coverslip בנוכחות של כל תהליכי unbranched ארוכי צורת תרופת depolymerizing-אקטין מלאים microtubules אחיד מקוטב. אברונים לנוע לאורך תהליכים אלה על ידי מנועים microtubule. תחזוקה קלה, רגישות גבוהה לחלבון RNAi בתיווך לדפוק למטה והליך יעיל ליצירת שורות תאי יציבות להפוך תאי דרוזופילה S2 מערכת מודל אידיאלי ללמוד הובלת מטענים על ידי הדמיה לחיות. התוצאות שהושגו עם תאי S2 יכולות להיות מיושמות בהמשך ליותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת: תחבורת אקסון בנוירונים העיקרי בתרבית מעוברי דרוזופילה ניתקו. נוירונים בתרבית לגדול neurites הארוכה מלאות microtubules ארוזים, דומה מאוד לתהליכי S2. כמו בתאי S2, האברונים בנוירונים בתרבית ניתן דמיינו ידי שני צבעי ניאון אברון ספציפי או באמצעות סמני אברון ניאון המקודדים על ידי DNA מוזרק לתוך עובריים מוקדם או לידי ביטוי בtransgenic זבובים. לכן, תחבורת אברון ניתן להקליט בקלות בנוירונים בתרבית על coverslips זכוכית באמצעות הדמיה חי. כאן אנו מתארים נהלים לculturing חזותי הובלת מטענים בתאי דרוזופילה S2 ונוירונים עיקרי. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים הללו להפוך את שני המערכות נגישות למעבדות לימוד הובלת מטענים.
Introduction
תאי דרוזופילה S2 צברו פופולריות הולכת וגוברת ללימוד תהליכים תאיים רבים. תאים אלה התקבלו במקור מעוברים בשלב מאוחר trypsinized של OregonR תסיסנית ולשמור על תכונות כמו מקרופאג-1. תאי דרוזופילה S2 מציעים יתרונות רבים על פני שורות תאים אחרות. הם מתורבתים ב25 מעלות צלזיוס בלי CO 2, ויכולים להיות צילמו במשך שעות רבות בטמפרטורת חדר ללא הצורך בחימום או חילוף גזים. חשוב מכך, תאי דרוזופילה S2 רגישים מאוד לטיפול RNAi המאפשר מציאה יעילות גבוהה של חלבונים של עניין. תאי S2 הם transfectable מאוד יכולים להיות שנבחרו שורות תאי יציבות בפחות מארבעה שבועות, כדי לאפשר ביטוי אקטופי היציב של חלבונים של עניין. תאי S2 בדרך כלל גם לגדול מחוברים באופן רופף, אך לא התפשטו בבקבוק או בהשעיה. הם יכולים להיגרם להתפשט על coverslips precoated עם קונקה לקטינים צמחnavalin (ConA). הפריפריה של תאי ההתפשטות היא דקה במיוחד, ולכן הוא אידיאלי למיקרוסקופיה תא חי. ניתן למצוא בפרוטוקולים מפורטים לתרבות תאי S2, טיפול RNAi, הדמיה אור חי וimmunostaining ב2,3 הספרות. המעבדה שלנו אימצה תאי S2 כמערכת מודל ללמוד הובלת מטענים מבוסס microtubule. תאי דרוזופילה S2 שטופלו בכל תרופה שdepolymerizes או קוטעת F-אקטין, כגון cytochalasin D (CytoD), לגדול תהליכים ארוכים מלאים microtubules אחיד המקוטב 4 -10, מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד תנועת מטענים לאורך מערכי microtubule. פרמטרים שונים של הובלה בתהליכים אלו (. כלומר אורכי מסלולים, מהירויות, יווניות וכו ') ניתן למדוד בקלות באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים אוטומטית, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; ד"ר . פסקל אלוטון: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-I# Nformatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx A4). תכונות אלו הופכות את תאי S2 מערכת מושכת ללימוד הובלת מטענים לאורך microtubules בתאים בתרבית רקמה.
ניסויי פיילוט בתאי S2 יכולים להתארך למודל חשוב מבחינה פיזיולוגית של מחקרי הובלת מטענים בנוירונים עיקרי דרוזופילה. בדומה לתאי S2, נוירונים בתרבית מעוברים ניתקו הם חדירים למולקולות קטנות, כגון צבעים ומעכבים, והדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של תחבורת אברון יכולה להתבצע בתאי עצב בטמפרטורת חדר. שימוש בדרוזופילה עם רקע גנטי שונה, אנו יכולים לבחון את תפקוד גן בנוירונים עיקרי בנוקאאוט (מוטציות אובדן של הפונקציה גנטיות), מציאה (הזרקת dsRNA או ביטוי) או ביטוי אקטופי (זבובים מהונדסים). באופן ספציפי, פיצול של סיבי אקטין באמצעות טיפול CytoD אינו מונע תולדת neurite, אלא הם גדלים מהר יותר, ובכך אנו יכולים ללמוד microtubule-dependeתחבורת אברון NT בנוירונים שטופלו CytoD ללא ההשפעה של אקטין חוטי 11. לכן, תרבויות עצביות עיקריות לשלב את היתרונות של תאים בתרבית רקמה ולעוף גנטיקה, מה שהופך את מערכת נהדרת ללמוד הובלת מטענים במערכת רלוונטית פיזיולוגית 10,12. מאז כמה מחלות ניווניות משפחתיות יכולים להיגרם על ידי או קשורה עם מומי הובלת מטענים (למשל מחלת פרקינסון 13, מחלת הנטינגטון 14, מחלת אלצהיימר 15,16, Amyotrophic Lateral Sclerosis / 17 ALS, תסמונת HMN7B ופרי 18,19, וסוג אטקסיה spinocerebellar 5/SCA5 20), תרבויות עצביות עיקריות יכולות להיות שימושיות בניתוח של ההשפעות של מוטציות מסוימות גורמות למחלות אלה בתחבורה microtubule תלוי.
לבסוף, מאפיינים חשובים של תחבורת microtubule תלוי הם נשמרים גם בין יונקים וזבובים, אבל
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי דרוזופילה S2
הכנת coverslips ConA המצופה
- הנח coverslips במעמד קרמיקה ולשטוף אותם על ידי טבילת חומצה כרומית במשך שעה 1. [זהירות: חומצה כרומית היא מאכל ויכולה לגרום לגירוי של עיניים, האף, גרון ועור].
- יש לשטוף ביסודיות עם coverslips פועל כל הזמן DH 2 O למשך 30 דקות עד לחומצה הוא נשטפה לחלוטין.
- תן אוויר coverslips יבש ואת מעיל אותם עם ConA (פתרון 0.5 מ"ג / מיליליטר ב DH 2 O) ל30 דקות.
- יש לשטוף coverslips עם DH 2 O ל15 דקות ולתת להם להתייבש באוויר. ניתן לאחסן את coverslips ConA מצופה חודש 1.
ציפוי התא
- אפשר תאי S2 לגדול באופן אקספוננציאלי ב2 צלוחיות T25 או T75 סנטימטר בהתאם למספרם של תאים הנדרשים לניסוי.
- לספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer. מ 'צמיחת מיליליטר הוסף 1edium (למשל חרקים-Xpress) לתוך צלחת 35 מ"מ רקמת תרבות עם coverslip מצופה ConA, ובעדינות להעביר ~ 1 x 10 5 תאים למנה. צפיפות תא זה היא אופטימלי עבור הדמיה, כי תהליכים מהתאים שונים אינם חופפים.
- על מנת לגרום להיווצרותם של תהליכים, מייד לאחר ציפוי מוסיף בינוני 1ml עם 5 CytoD מיקרומטר למנה (לריכוז הסופי של 2.5 מיקרומטר CytoD). לאפשר פיתוח מלא של תהליכים על ידי דוגרים התאים לפחות לשעה 2 ב C º 25 לפני ההדמיה.
2. דרוזופילה הראשית Neuron תרבות
הכנה לתרבות נוירון
- הכן את מדיום גידול עצבי דרוזופילה (הבינוני של שניידר בתוספת: 20% בסרום שור עוברי, חום מומת ב55 º C למשך 30 דקות; 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין; 10 מיקרוגרם / טטרציקלין מיליליטר) . sup זההמדיום של plemented שניידר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
- הכן בקבוקונים אגר מיץ תפוחים לאיסוף עוברי דרוזופילה (אגר 22.5 גרם, 12.0 סוכרוז גרם ו750 H 2 O מיליליטר בבקבוק 2 ליטר; החיטוי ל20-25 דקות, להוסיף מיץ תפוחי מיליליטר 250 ויוצקים ~ 10 מיליליטר לכל דרוזופילה בקבוקון; לאחר התמצקות, חבר צלוחיות עם כדורי צמר גפן, ולעטוף את צלוחיות עם אריזות פלסטיק של מזון, כדי למנוע על ייבוש של המזון). מיץ התפוחים בצלוחיות אגר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בשקיות פלסטיק אטומות היטב במשך 4 שבועות.
- coverslips מעיל שטף חומצת 25 מ"מ המעגל עם ConA (ראה פירוט בפרוטוקול לתאי דרוזופילה S2) ולעקר אותם תחת אור UV ל10-15 דקות. coverslips אלה יכול להיות מאוחסן במשך חודש.
תרבות נוירון העוברית דרוזופילה
- בוגרים צעירים שמרו עף בצלוחיות אגר מיץ תפוחים בתוספת שמרים יבשים ל1-2 ימים לפני איסוף עוברים ואו הכנת נוירון.
- ביום האיסוף, על מנת לסנכרן את העוברים שנאספו, למבוגרים העברה טס לבקבוקון טרי תפוחי מיץ אגר לprecollection שעה 1 באור וזורקים עוברים אלה.
- העברת זבובים לבקבוקון אגר מיץ תפוחים חדש, לאסוף עובר במשך שעה 1, ולהעביר את הזבובים לבקבוקון נוסף לעוד שעה, גם בחושך כדי להגדיל את תשואת העובר.
- הסר את הזבובים הבוגרים מהבקבוקון אגר מיץ תפוחים ולתת לעוברים להתפתח 4 שעות נוספות לשלבי 9-11 בטמפרטורת חדר (4-6 עוברים HR-ישן הם בין השלב 9-11).
- הסר את העוברים על ידי התזת מים לתוך צלוחיות והתרופפות העוברים מאגרו מיץ התפוחים עם מכחול קטן (לפחות 10 עוברים נדרשים להכנת נוירון אחד טובה).
- מעביר את העוברים למסננת תא רשת ניילון 100 מיקרומטר עם טפטפת העברה לניקוז מים (prerinse טפטפת ההעברה במאגר דרוזופילה לשטוף עובר, 0.4% NaCl, 0.03% טריטוןX-100).
- לאסוף את העוברים מהמסננת באמצעות מכחול קטן, ולהעביר אותם לתוך 1.5 מיליליטר microtube מלא 1 מיליליטר לשטוף דרוזופילה עובר (הערה: לנקות סיבים אגר או כותנה באמצעות המכחול או הטיפים פיפטה). בפרוטוקול זה, microtube 1.5 מיליליטר מגיע עם העלי גלולה חד פעמי תואם.
- שטוף עוברים בשטיפת עובר דרוזופילה 3x.
- Dechorionate העוברים ב1:1 פתרון חדש של אקונומיקה מסחרית ו95% אתנול עבור 10 דקות [זהירות: אקונומיקה יכולה לגרום לגירוי עיניים, האף, גרון ועור].
- מעבר למכסת המנוע בתרבית רקמה, ולשטוף את העוברים 2x במדיום של שניידר בתוספת.
- השאר 200-300 בינוני μl בצינור עם העוברים, ועדינות מכאנית לנתק עובר Dechorionated באמצעות עלי גלולה חד פעמי קימבל צ'ייס כי כבר מעוקר ידי 70% אתנול (לטחון 10-15x).
- צנטריפוגה התערובת הומוגני ב20 XG במשך 2 דקות, וטרהnsfer supernatant לצינור טרי. [שלב זה הוא אופציונלי, זה מסייע להסיר עובר פסולת]
- צנטריפוגה supernatant ב 550 XG במשך 2 דקות עד גלולה תאים.
- Resuspend את הכדור ב500 μl בתוספת למטה התאים בינוניים וספין של שניידר שוב ב550 XG במשך 2 דקות, לחזור על מחזור resuspension מסתובב פעם אחת.
- לבסוף resuspend את הכדור ב~ 100 μl בתוספת הבינוני של שניידר וצלחת התאים על גבי coverslip מצופה ConA 25 מ"מ בצלחת פטרי 35 מ"מ סטרילי. דגירה של 10 דקות כדי לאפשר התקשרות סלולרי.
- הוסף 2 מיליליטר של המדיום של שניידר שיושלם, עם 5 מיקרומטר CytoD להטביע את coverslip עם תאים מצורפים.
- דגירה את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס humidified לילה לפני ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דרוזופילה S2 תאים המצורפים על התפשטות coverslip מצופה ConA לתוך סיבוב צורה "פנקייק" (איורים 1 א ו1C) שטוח. עם זאת, כאשר תאי S2 מצופים על coverslips בנוכחות CytoD ואפשרו להפיץ ל2-3 שעות, הם יוצרים תהליכים דקים וארוכים מולא על ידי microtubules המקביל (איורים 1B ו 1D). יש לי microtubules אלה קוטביות אחידה עם התוספת מסתיים החוצה 7. דימות פלואורסצנטי זמן לשגות של דרוזופילה S2 יציבות להביע mCherry-טובולין מראה כי תהליכים הם מאוד דינמיים, במיוחד בתקופת 60 דקות הראשונות לאחר קובץ מצורף (איור 2). לאחר הדגירה 1 שעות, הצמיחה שלהם מאיטה ו2-3 דגירה שעה מבטיחה כי רוב התאים גדלו באופן מלא את התהליכים. כאן אנו מראים שתי דוגמאות מייצגות של תחבורת אברון יחד microtubules בתאי S2, lysosomes (שכותרתו עם Lysotracker, 200 ננומטר; דמויות 3A-B 7 (transfection היציב עם PAC-GFP-SKL; דמויות 3D-E). זמן לשגות תמונות של התאים נלקחו כל 1 שניות ל61 מסגרות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ניקון TU-2000 מצוידות במערכת מושלמת פוקוס (ניקון) ומצלמה CoolSnap CCD (רופר המדעי) מונעת על ידי תוכנת Metamorph. מקור אור ההלוגן 100-W שימש לעירור הקרינה כדי למזער photobleaching וphototoxicity. כל אחד מ61 המסגרות ברצף היה מסומן בצבעים על פי הסרגל בצד ימין ותמונות היו על גבי זו כדי ליצור מסלולים המסומנים בצבע עליון. חלקיקים וכך נוצרו מסלולים נעו קשת, ואילו חלקיקים נייחים הופיעו לבנים 10. ImageJ התוספת זמני צבע הקוד (http://fiji.sc/Temporal-Color_Code) שימש לעיבוד הזה. ניתוח כמותי של תנועת אברון שהשתמשנו בתוכנת DiaTrack (Semasopht Inc), אנו בוחרים רקאברונים המקומיים בתהליכים כי הם יכולים להיות במעקב בקלות ובקוטביות של השירים microtubule ידועה. איורים 3C ו3F להראות הפצות טיפוסיות של מהירויות מדרדר ואנטרוגרדית מתקבלות על ידי lysosomes ומעקב peroxisomes, בהתאמה.
טכניקות דומות נמצאות בשימוש במעבדה שלנו לניתוח של תחבורת אברון בנוירונים בתרבית ראשונית. נוירונים הם סוג תא דומיננטי בתרבויות מעורבות המתקבלות משלב 9-11 עוברים. לאחר culturing הלילה הם קלים לזיהוי על ידי צורת תא אופיינית עם neurites כי הם מעל 50 מיקרומטר (איור 4 א) ארוך. תאים אלה הם גם חיוביים עבור הסמן פאן עצבי, Elav 21 (4B דמויות ו4B '). תהליכים בתאי העצב מלאים microtubules (4B דמויות ו4B "). אנחנו יכולים לעקוב אחר תחבורת אברון לאורך neurites באמצעות techniques שתואר לעיל עבור תאי S2. יכולה להיות מתויג מיטוכונדריה עם GFP המיטוכונדריה (מיטו-GFP) תחת שליטה של D42 מנוע נוירון ספציפי אמרגן 22 (5A דמויות ו5A '), והוא יכול להיות מסומן peroxisomes על ידי הזרקה של ה-DNA מקודד 7 mCherry ממוקד peroxisome, אליי עוברי עובר שלב blastoderm (5B דמויות ו5B ').
איור 1. היווצרות דרוזופילה S2 תהליך הנגרמת על ידי CytoD. תאים (A, C) דרוזופילה S2 לצרף ולהפיץ לצורות לשטח ועגולים כאשר מצופים בcoverslips precoated-ConA. תאים (B, D) S2 מצופים בנוכחות 2.5 מיקרומטר CytoD יוצרים תהליכים ארוכים מלאים microtubules לאחר 3 דגירה שעה. <strong> AB ו-CD מועברים אור ותמונות טובולין-מתויג mCherry ניאון, בהתאמה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. זמן לשגות של צמיחת תהליכים בתא דרוזופילה S2. הקרינה זמן לשגות של תא דרוזופילה S2 להביע mCherry-טובולין בנוכחות 2.5 מיקרומטר CytoD. המספרים מציינים את הזמן לאחר התא לצרף coverslip. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תנועת תחבורת אברון בתאי דרוזופילה S2. (AC) הליזוזום בתא דרוזופילה S2. תחבורת נציג 1 דקות-הליזוזום (שכותרתו עם 200 ננומטר Lysotracker) בתא אחד (, תמונת DIC) מיוצגת על ידי Temporal-הקוד המלאכותי (שנוצר על ידי פיג'י) (ב). מהירויות המתקבלות מהניתוח של תנועת הליזוזום במעקב בתהליכים (DiaTrack; 663 חלקיקים ב23 תאים) (ג). תנועה (DF) peroxisome בתא דרוזופילה S2. תחבורת נציג 1 דקות-peroxisome (שכותרתו עם PMT-GFP-SKL) בתא אחד (D, תמונת DIC) מיוצג על ידי Temporal-הקוד המלאכותי (שנוצר על ידי פיג'י) (E). מהירויות המתקבלות מהניתוח של תנועת peroxisome מעקב בתהליכים (DiaTrack; 228 חלקיקים ב20 תאים) (F). שימו לב שlysosomes לעבור עם יותר ומהירים יותר מאשר מסלולים peroxisomes. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. נוירונים העיקרי דרוזופילה מתרבות הלילה. () נוירון דרוזופילה תרבית לילה יש מורפולוגיה עצבית אופיינית עם neurites הארוכה. (ב) נוירון הביע סמן פאן עצבי, Elav (אדום בB ולבן בב ', DSHB, 7E8A10, 1:100) ועם neurites הארוכה מלאות microtubules (ירוק בB ולבן בB'', DM1α , 1:1000). סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. nk "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. תחבורת אברון בתאי עצב בתרבית דרוזופילה. () המיטוכונדריה בתא עצב בתרבית דרוזופילה סומן על ידי מיטו-GFP תחת שליטה של אמרגן נוירון הספציפי מוטורי, D42. (א ') 5 תנועת דקות-המיטוכונדריה ב() מיוצגת על ידי הקוד המלאכותי Temporal-הצבע (שנוצר על ידי פיג'י). (ב) peroxisomes בנוירון דרוזופילה תרבותי בסימן PAC-SKL-mCherry, הזריק לעוברי שלב blastoderm לי עובריים מוקדמים. (ב ') 2 תנועת דקות-peroxisome ב( ב') מיוצגת על ידי הקוד המלאכותי Temporal-הצבע (שנוצר על ידי פיג'י). סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר.ig5highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| אברון | תיאור |
| Peroxisomes | אות מיקוד Peroxisomal tripeptide 1 (SKL) מתויג עם FP 25 |
| מיטוכונדריה | רצף מיקוד מיטוכונדריאלי של מקטע מונואמין ציטוכרום C השמיני מתויג עם FP 26 |
| מיטוכונדריה | Mitotracker (דיי שמצטבר במיטוכונדריה הפעילה) 27 |
| Lysosomes | Lysotracker (דיי שמצטבר בסלולריתאים עם pH הפנימי הנמוך) 28 |
טבלת 1. אסטרטגיות תיוג אברון הנפוצות ביותר.
טבלה זו מסכמת את האסטרטגיות הנפוצות ביותר תיוג אברון בתאים בתרבית רקמה, כוללים תיוג של peroxisomes, מיטוכונדריה, וlysosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ללימוד הובלת מטעני microtubule תלוי בתאי דרוזופילה S2 ותרבות הנוירון ראשוני. שני תהליכי S2 וneurites הם מבנים מולא על ידי מערכי microtubules ארוזים המשמשים כמסלולים לתחבורת אברון.
שתי אסטרטגיות משמשות בדרך כלל לאברונים תווית: transfection של וקטורי קידוד חלבון פלואורסצנטי עם רצף מיקוד אברון או כתמים עם צבעי ניאון הוסיפו ישירות לתרבויות. דוגמאות נפוצות של תוויות מטענם מופיעות בטבלה 1. transfection או טיפולי RNAi חולפים של תאי דרוזופילה S2 במידת צורך מתבצע בהשעית 4,6,7,9,10 לפני תאים מצופה על coverslips להדמיה.
על מנת לקבל תוצאות אמינות בניסויי תא S2, חשוב לשמור על הנקודות הבאות בחשבון:
- פלייט תאים בצפיפות אופטימלית להדמיה. דן תיכון sity יגרום חופף של תהליכים מהתאים שונים, ואילו בתאים בצפיפות נמוכים כדאיות עניים ואינם מסוגלים ליצור תהליכים.
- אפשר תאי S2 לפתח תהליכים לחלוטין. אנו שגרתי דגירה תאים עבור שעה 2 לאחר ציפוי אבל דגירה עד 24 שעות יכולה להתבצע במידת צורך.
- יש להתייחס אליהם תאי S2 עם CytoD לפני שהם מייחסים לcoverslips ConA המצופה. הוספת התרופה לאחר התאים מחוברים לא לגרום להיווצרות תהליכים.
- בעת שימוש בצבעים, שינוי דגימות הדמיה בכל דקות 20-25; דגירה ארוכת טווח של תאים עם או Mitotracker או Lysotracker היא רעילה לתאים.
- אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הובלת מטענים בתאי S2 על ידי הדמיה 1 דקות במסגרת 1 / sec. תחת תנאי זה תאים אינם פגוע תמונה.
- רק לנתח תנועת אברון בתהליכים בתא. צפיפות אברון בגוף התא היא גבוהה מדי למעקב וקוטביות של התנועה אמינים לא ניתן לקבוע בקלות.
class = "jove_content"> הליך הכנת דרוזופילה נוירון העיקרי התרבות שונה מהפרוטוקולים על ידי המעבדה Mahowald 23 ומעבדה ליו 24. פרוטוקול זה מאפשר לך לקבל תרבות הנוירון ראשונית בתוך יום ושהוא מוכן להדמיה ומעקב ביום שלמחרת.
בפרוטוקול זה, ייתכן שתצטרך לשלם את תשומת הלב לכמה שלבים עיקריים המפורטים להלן:
- עובר שלב בצורה נכונה. העוברים שנאספו צריכים להיות מסונכרנים ומבוים לשלבים 9-11, כאשר delamination neuroblast מהאאקטודרם מתרחש. Staging עוברים מוקדם מדי או מאוחר מדי עלול לגרום פחות neuroblasts בכל עובר ולכן כישלון של נוירונים קצירה מהעוברים ניתקו.
- עוברי Dechorionate ימינה המידה (כל העוברים משנים את הצבע מלבן לחלוטין לשקופים יותר). תחת dechorionation עלול להוביל לקושי בניתוק עובר, ואילו יכול לגרום נזק מעל dechorionation העוברים. דצמברעוברי horionated להיות מאוד דביקים ורכים, ובכך לנסות למנוע את pipetting או נגיעה העוברים עם טיפים פיפטה במהלך שלבי הכביסה לפני הניתוק.
- להקדיש תשומת לב מיוחדת לעוברי דיסוציאציה. אנו מוצאים כי עלי הפלסטיק חד פעמי גלולה וmicrotubes ההתאמה לתת ניתוק טוב יותר מאשר homogenizer dounce זכוכית, במיוחד עבור מספר קטן של עוברים. מתחת לניתוק יעזוב צבירי תאים גדולים, ואילו יוביל יתר דיסוציאציה להתמוטטות תאים והצטברות מסיבית של תא פסולת. התאם את רמת הניתוק פי מספרי העובר.
- ציפוי נוירון על coverslip הזכוכית לצפיפות סבירה. נוירונים צפופים בדרך כלל לפתח neurites קצרה מאוד, ואילו נוירונים דלילים לעתים קרובות אינם מצליחים לשרוד.
בנוסף, שמו לב שתרביות תאים ראשוניים לעתים קרובות מכילות תאי שריר, ותאי דם. טיפול הלילה עם CytoD עוזר להפחית את מספר תאי שריר ותאים דם, ולקדםזה תולדת neurite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברים במעבדה גלפנד שתרם לפיתוח של פרוטוקולים אלה. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי למדע כללי רפואי של המכון הלאומי לבריאות במספר הפרסים R01GM052111 לVIG ועל ידי הבסקים מחלקה ממשלתית לחינוך, אוניברסיטאות ומחקר תחת BFI-2,011-295 מספר הפרסים לUDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
