Summary
Drosophila S2 клетки и культивируемые нейроны большие системы для визуализации с приводом от двигателя органелл транспорта в естественных условиях. Здесь мы опишем подробные протоколы для культивирования клеток обоих видов, их визуализации и анализа транспорта.
Abstract
Drosophila S2 клетки высевали на покровное в присутствии любых актин-деполимеризации лекарственной формы длинных неразветвленных процессов, заполненных равномерно поляризованных микротрубочек. Органеллы двигаться вдоль этих процессов микротрубочек двигателей. Простота обслуживания, высокая чувствительность к РНК-интерференции-опосредованной белка нокдаун и эффективной процедуры для создания стабильных клеточных линий сделать дрозофилы S2 клетках идеальную модель системы для изучения Грузовой живого изображения. Результаты, полученные с S2 клетках может быть дополнительно применен к более физиологически соответствующие системы: аксонального транспорта в первичных нейронах, культивированных из диссоциированных эмбрионов Drosophila. Искусственный нейроны растут длинные нейриты наполненные комплекте микротрубочек, очень похожих на S2 процессов. Как и в S2 клетках, органеллы в культуре нейронов могут быть визуализированы либо органеллоспецифичными флуоресцентных красителей или с помощью флуоресцентных маркеров органелл, кодируемые ДНК вводят в ранних эмбрионов или выражается в трансгеннойМикросхема летит. Поэтому органелл транспорт может быть легко записаны в нейронах, культивируемых на покровные стекла с использованием живого изображения. Здесь мы опишем процедуры культивирования и визуализации грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичных нейронов. Мы считаем, что эти протоколы сделать обе системы доступны для лабораторий, изучающих грузовых перевозок.
Introduction
Drosophila S2 клетки приобрели большую популярность для изучения многих клеточных процессов. Эти клетки были первоначально получены из трипсинизировали конце эмбрионов стадии OregonR дрозофилы и поддерживать макрофагов-подобные функции 1. Дрозофилы S2 клетки имеют много преимуществ по сравнению с другими клеточными линиями. Они культивировали при 25 ° С без CO 2, и может быть отображены в течение многих часов при комнатной температуре без необходимости нагрева или газообмена. Что еще более важно, Drosophila S2 клетки очень чувствительны к лечению RNAi, позволяя высокой эффективности нокдаун интерес белков. S2 клетки очень transfectable и стабильные клеточные линии могут быть выбраны менее чем за четыре недели, чтобы позволить стабильную эктопическую экспрессию белков, представляющих интерес. S2 клетки обычно растут либо косвенное отношение, но не распространяются на колбе или в суспензии. Они могут быть вызваны для распространения на покровных предварительно покрытых с завода лектинов Конкаnavalin (КонА). Периферии распространенных клеток особенно тонкими и поэтому идеально подходит для живых клеток микроскопии. Подробные протоколы для S2 культуре клеток, лечения РНК-интерференции, живого изображения света и иммуноокрашивания можно найти в литературе 2,3. Наша лаборатория приняла S2 клетки в качестве модельной системы для изучения микротрубочек на основе грузовых перевозок. Дрозофилы S2 клетки, обработанные любой препарат, который depolymerizes или разрывает F-актин, например, цитохалазина D (CytoD), отращивать длинные процессы, заполненные равномерно поляризованных микротрубочек 4 -10, что делает его идеальной системой для изучения перемещения грузов по микротрубочек. Различные параметры транспорта в этих процессах (. Т.е. длины траектории, скорости, направленности и т.д.) может быть легко измерено с помощью автоматизированного программного обеспечения частиц отслеживания, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, д-р . Паскаль Валлотон: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # а4). Эти свойства делают S2 клетках привлекательный систему для изучения грузового транспорта вдоль микротрубочек в клетках тканевой культуры.
Пилотные эксперименты в S2 клетках может быть продлен до физиологически важных модели грузовых транспортных исследований в дрозофилы первичных нейронов. Как и в S2 клетках, нейроны культивировали от диссоциированных эмбрионов проницаемы для малых молекул, таких как красители и ингибиторы, и с высоким разрешением живой визуализации органелл транспорта может быть выполнена в нейронах при комнатной температуре. Использование дрозофилы с различными генетическим фоном, мы можем исследовать функции генов в первичных нейронов нокаутом (генетические с потерей функции мутации), нокдаун (дсРНК инъекции или выражение) или эктопическая экспрессия (трансгенные мухи). В частности, фрагментация нитей актина с использованием лечение CytoD не мешает рост аксонов, вместо этого они растут быстрее, и, таким образом мы можем изучать микротрубочек-зависимнт органелл транспорт в CytoD обработанных нейронов без влияния нитей актина 11. Таким образом, первичные нейронные культуры объединить преимущества тканевых культур клеток и летать генетику, что делает его отличным системой для изучения грузовых перевозок в физиологическом соответствующей системы 10,12. Поскольку несколько семейные нейродегенеративные заболевания могут быть вызваны или связаны с грузовых транспортных дефектов (например, болезнь Паркинсона 13, болезнь Хантингтона 14, болезнь Альцгеймера 15,16, боковой амиотрофический склероз / ALS 17, HMN7B и Перри синдром 18,19, и спиноцеребеллярной Тип атаксия 5/SCA5 20), первичных нейронов культур может быть полезным при анализе эффектов специфических мутаций, вызывающих эти заболевания на микротрубочек в зависимости от транспорта.
Наконец, важные свойства микротрубочек в зависимости от транспорта хорошо сохраняется между млекопитающих и мух, но
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дрозофилы S2 клетки
Подготовка покровные КонА покрытием
- Поместите покровные в керамической стойки и промыть их погружением хромовой кислоты в течение 1 часа. [ВНИМАНИЕ: хромовая кислота вызывает коррозию и может вызвать раздражение глаз, носа, горла и кожи].
- Промыть покровные тщательно постоянно работает дН 2 O в течение 30 мин, пока кислота не будет полностью размыты.
- Пусть покровные воздух сухой и покрыть их ConA (0,5 мг / мл раствора в дН 2 O) в течение 30 мин.
- Промыть покровные с дН 2 O в течение 15 мин, и пусть они высохнуть на воздухе. Покровные КонА покрытием можно хранить до 1 месяца.
Покрытие клетки
- Разрешить S2 клеток экспоненциально растет в Т25 или Т75 см 2 колбах в зависимости от числа клеток, необходимых для эксперимента.
- Подсчитайте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Добавить 1 рост мл мedium (например насекомых-Xpress) в 35 мм блюдо культуры ткани с покровным КонА покрытием, и аккуратно перенести ~ 1 х 10 5 клеток на блюдо. Эта плотность клеток является оптимальным для визуализации потому что процессы из различных клеток не перекрываются.
- Для того, чтобы вызвать образование процессов, сразу после посева добавить 1 мл среды с 5 мкМ CytoD на блюдо (до конечной концентрации 2,5 мкМ CytoD). Разрешить полное развитие процессов путем инкубации клеток по крайней мере в течение 2 часов при 25 º С до визуализации.
2. Дрозофилы Первичная Нейрон Культура
Подготовка к нейрона культуры
- Подготовка Drosophila среду роста нейронов (средний Шнайдера с добавлением: 20% эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием при 55 ° С в течение 30 мин, 5 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мкг / мл тетрациклина) . Эта поддержкасреднего дополненной Шнайдера можно хранить при температуре 4 ° С в течение 6 месяцев.
- Подготовка яблочный сок агар флаконов для сбора Drosophila эмбрионов (22,5 г агар, 12,0 г сахарозы и 750 мл H 2 O в 2-литровую колбу; автоклав на 20-25 мин, добавить 250 мл яблочного сока и залить ~ 10 мл в каждую дрозофилы флаконе; после затвердевания, подключите флаконы с ватными шариками, и оберните флаконов с пластиковой пищевой пленкой, чтобы избежать чрезмерной высыхание пищи). Яблочный сок в агар флаконах можно хранить при температуре 4 ° С в плотно закрытых пластиковых мешках в течение 4 недель.
- Пальто кислоты промывают 25 мм покровные окружности с ConA (подробности см. в Протоколе для дрозофилы S2 клетках) и стерилизовать их под УФ-светом в течение 10-15 мин. Эти покровные могут храниться в течение месяца.
Drosophila эмбриональных нейронов культуры
- Держите молодых взрослых летит в яблочный сок агара флаконах с добавлением сухих дрожжей в течение 1-2 дней перед сбором эмбрионов еили препарат нейрон.
- На сбора день, с целью синхронизации собранные эмбрионов, перенос взрослых мух в свежую агаровую яблочный сок флаконе в течение 1 часа precollection в свете и отбросить эти эмбрионы.
- Передача летит к новому яблочный сок агар флакона, собирать эмбрионов в течение 1 часа, и передавать мух в другую пробирку еще в течение часа, и в темно увеличить выход эмбриона.
- Удалите взрослых мух от агара флаконе яблочного сока и пусть эмбрионы развиваются еще 4 ч до стадии 9-11 при комнатной температуре (4-6 час-старый эмбрионы между стадии 9-11).
- Удалить эмбрионов, впрыскивая воду во флаконы и ослабив эмбрионов из яблочного сока агар с небольшим кистью (не менее 10 эмбрионов необходимы для одной хорошей нейрона подготовки).
- Перенесите эмбрионы в нейлон сито петли клеток 100 мкм с пипетки для слива воды (prerinse на пипетки передачи в Drosophila эмбрион промывочного буфера, 0,4% NaCl, 0,03% TritonХ-100).
- Сбор эмбрионов от сетчатого фильтра с помощью маленькую кисть, и передавать их в микропробирку 1,5 мл, наполненный 1 мл Drosophila стирки эмбриона (Примечание: очистить любые агар или хлопковые волокна, используя кисть или наконечники). В этом протоколе микропробирку 1,5 мл приходит с соответствующим одноразового гранул пестиком.
- Вымойте эмбрионов в дрозофилы эмбрионов промыть 3 раза.
- Dechorionate эмбрионов в свежем 1:01 решения коммерческого отбеливателя и 95% этанола в течение 10 мин [ВНИМАНИЕ: отбеливатель может вызвать раздражение глаз, носа, горла и кожи].
- Переход к капот культуры ткани, и мыть эмбрионов 2x в обогащенной среде Шнайдера.
- Оставьте 200-300 мкл среды в трубке с эмбрионами, и осторожно механически отделить dechorionated эмбрионов с помощью Кимбл Chase одноразовые гранул пестики, которые были стерилизованы 70% этанола (измельчить 10-15x).
- Центрифуга гомогенизированной смеси при 20 мкг в течение 2 мин и TRAnsfer супернатанта в свежую пробирку. [Этот шаг является необязательным, это помогает удалить эмбриона мусора]
- Центрифуга супернатант при 550 мкг в течение 2 мин для осаждения клеток.
- Ресуспендируют гранул в 500 мкл дополненной среде и спин клетки Шнайдера снова при 550 мкг в течение 2 мин; повторить цикл ресуспендирование-спиннинг один раз.
- Наконец ресуспендируют осадок в ~ 100 мкл дополненной среде Шнейдера и пластины клеток на 25 мм КонА покрытием покровное в стерильной 35 мм чашки Петри с. Инкубировать в течение 10 мин, чтобы позволить прикрепление клеток.
- Добавить 2 мл среде, дополненной Шнайдера, с 5 мкМ CytoD погружаться покровное с прикрепленными клетками.
- Выдержите блюдо в увлажненной 25 ° С инкубатор ночь перед визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila S2 клетки, прикрепленные на КонА покрытием покровное распространения в плоской туре «блин» формы (1А и 1С). Однако, когда S2 клетки высевали на покровные стекла в присутствии CytoD и давали возможность распространяться в течение 2-3 ч, они образуют длинные тонкие процессы, заполненные параллельными микротрубочек (фиг.1В и 1D). Эти микротрубочки имеют равномерное полярность с плюс заканчивается из 7. Покадровый флуоресцентной визуализации дрозофилы S2 стабильно экспрессирующие mCherry-тубулина показывает, что процессы очень динамичны, особенно в течение первого 60 минут после присоединения (рис. 2). После 1 ч инкубации, их рост замедляется и 2-3 ч инкубации гарантирует, что большинство клеток уже окреп процессы. Здесь мы показываем два типичных примеров органелл транспорта вдоль микротрубочек в S2 клетках, лизосом (меченные Lysotracker, 200 нМ; 3А-B 7 (стабильный трансфекции с Pac-GFP-SKL; Цифры 3D-Е). Замедленной образы клеток были взяты раз в 1 сек для 61 кадров с помощью Nikon ТУ-2000 инвертированного микроскопа оснащен совершенной системой фокусировки (Nikon) и Coolsnap ПЗС-камеры (Ропер научного) обусловлен программного обеспечения Metamorph. 100-W галогеновый источник света был использован для возбуждения флуоресценции, чтобы минимизировать фотообесцвечивания и фототоксичность. Каждый из 61 кадров в последовательности был цветом в зависимости от бара в верхнем правом углу и изображений были наложенных генерировать цветные следы. Таким образом движущиеся частицы генерируются радуги треков, в то время как стационарные частицы появились белый 10. ImageJ плагин височной Color-Code ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) был использован для этой обработки. Для количественного анализа движения органелл мы использовали DiaTrack программное обеспечение (Semasopht Инк), мы только выбратьорганеллы, которые локализованы в процессах, поскольку они могут быть легко отследить и полярность микротрубочек дорожек известно. На фиг 3C и 3F показаны типичные распределения ретроградных и антероградная скоростей, полученных лизосом и пероксисом отслеживания, соответственно.
Подобные методы используются в нашей лаборатории для анализа органелл транспорта в первичных культивируемых нейронов. Нейроны являются преобладающим типом клеток в смешанных культурах, полученных из стадии 9-11 эмбрионов. После ночного культивирования они легко увидеть по характерной формы клеток с невриты, которые более 50 мкм длиной (рис. 4А). Эти клетки также положительны для пан-нейронов маркер, Elav 21 (рис. 4В и 4В "). Процессы в нейронах заполнены микротрубочек (рис. 4В и 4В "). Мы можем отслеживать органелл транспорт вдоль невриты, используя теchniques описано выше для S2 клетках. Митохондрии могут быть помечены митохондриальной GFP (Мито-GFP) под контролем моторного нейрона конкретных промоутер D42 22 (рис. 5A и 5A '), и пероксисомы могут быть отмечены путем инъекции ДНК, кодирующей пероксисом таргетингом mCherry 7, в синцитиальный эмбрионов на стадии бластодерма (рис. 5B и 5B »).
Формирование Рисунок 1. Дрозофилы S2 процесс индуцируется CytoD. (А, С) дрозофилы S2 клетки приложить и распространяться в сплющивающихся и круглой формы при посеве в КонА предварительно покрытых покровные. (B, D) S2 клетки высевали в присутствии 2,5 мкм CytoD образуют длинные процессы, наполненные микротрубочек после 3 ч инкубации. <сильный> AB и CD передаются свет и флуоресцентные mCherry с метками тубулина изображения, соответственно. Шкала бар, 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Временной интервал роста процессов в клетке дрозофилы S2. Флуоресценции покадровой клетки Drosophila S2, выражающей mCherry-тубулина в присутствии 2,5 мкМ CytoD. Цифры указывают на время после клетка придают покровного стекла. Шкала бар, 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Движение органелл транспорт в дрозофилы S2 клетках. (AC) Лизосома в дрозофилы S2 клетки. Представитель 1 мин-лизосом транспорт (помечены 200 нМ Lysotracker) в одной ячейке (, ДВС изображения) в лице искусственного височно-кодекса (созданной Фиджи) (B). Скорости, полученные из анализа лизосом движения гусеничной в процессах (DiaTrack; 663 частиц в 23 клеток) (C). Движение (DF) Пероксисома в дрозофилы S2 клетки. Представитель 1 мин-пероксисомы транспорт (помечены ПМТ-GFP-СКЛ) в одной ячейке (D, DIC изображение) в лице искусственного височно-кодекса (созданной Фиджи) (E). Скорости, полученные из анализа пероксисомы движения гусеничной в процессах (DiaTrack; 228 частиц в 20 клеток) (F). Обратите внимание, что лизосомы двигаться с более длинными и более быстрых траекторий чем пероксисомах. Шкала бар, 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Первичная Drosophila нейроны из ночной культуры. (А) культивировали в течение ночи дрозофилы нейрон имеет характерный нейронов морфологию с длинными невриты. (В) Нейрон выразил пан-нейронов маркер, Elav (красный в B-белый в B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) и с длинными невриты, заполненных микротрубочек (зеленый в B и белого B'', DM1α , 1:1000). Масштабная линейка, 5 мкм. НК "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Органелл транспорт в культивируемых нейронов дрозофилы. (А) Митохондрии культурно Drosophila нейрона отмечен Mito-GFP под контролем нейрон конкретных промоутер двигателя, D42. (А ') 5 мин-митохондриальная движение в (А) представлена искусственного Временная-код цвета (созданной Фиджи). (В) Пероксисом в культурно Drosophila нейрона отмечен Pac-SKL-mCherry, вводят в начале синцитиальных эмбрионов на стадии бластодерма. (B ') 2 мин пероксисом движение в (В) представлена искусственного Temporal-код цвета (созданной Фиджи). Шкала бар, 5 мкм.ig5highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| Органелл | Описание |
| Пероксисом | Peroxisomal таргетинг сигнал 1 трипептид (СКЛ) помечены с помощью FP 25 |
| Митохондрии | Митохондриальная последовательность нападения на цитохром с оксидазы субъединицы VIII помечены с помощью FP 26 |
| Митохондрии | Mitotracker (краска, которая накапливается в активной митохондрий) 27 |
| Лизосомы | Lysotracker (краска, которая накапливается в сотовойотсеки с низким внутренним рН) 28 |
Таблица 1. Наиболее распространенные стратегии маркировки органеллы.
Эта таблица посвящена наиболее общие стратегии органелл маркировки в клетках тканевой культуры, в том числе маркировки пероксисомах, митохондрий и лизосом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем подробные протоколы для изучения микротрубочек в зависимости от грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичной культуре нейронов. Оба процесса S2 и невриты являются структуры, заполненные комплекте микротрубочек массивов, которые служат треков для органелл транспорта.
Две стратегии обычно используются для органелл Label: трансфекции векторов, кодирующих флуоресцентный белок с последовательностью органелл-таргетинга или окрашивание с флуоресцентными красителями добавляют непосредственно в культурах. Типичные примеры грузовых этикеток приведены в таблице 1. Временной трансфекции или RNAi лечения из Drosophila S2 клетках при необходимости выполняется в виде суспензии 4,6,7,9,10 до клетки высевают на покровных для визуализации.
Для того чтобы получить надежные результаты в экспериментах S2 клеток, важно держать в виду следующее:
- Пластина клеток в оптимальной плотности для работы с изображениями. Высокая денплотность приведет к перекрытию процессов из различных клеток, в то время как при низких клетки плотности имеют плохую жизнеспособность и не способны образовывать процессов.
- Разрешить S2 клетки полностью развить процессы. Мы регулярно инкубировать клетки в течение 2 часов после посева, но инкубационный до 24 часов могут быть выполнены, если это необходимо.
- S2 клетки должны быть обработаны CytoD, прежде чем они придают покровные КонА покрытием. Добавление препарат после клетки прикрепляются не будет вызывать образование процессы.
- При использовании красителей, образцы изменений для визуализации каждые 20-25 мин; долгосрочная инкубации клеток с обеих Mitotracker или Lysotracker является токсичным для клеток.
- Мы обычно отслеживать грузовых перевозок в S2 клетках по визуализации в течение 1 мин на 1 кадра / сек. При этом условии клетки не фото-повреждения.
- Только анализа движения органелл в клеточных процессах. Плотность органелл в теле клетки слишком высока для надежной отслеживания и полярность движения не может быть легко определено.
В этом протоколе, вы можете оплатить внимание на несколько ключевых шагов, перечисленных ниже:
- Сценическое эмбрионы правильно. Собранные эмбрионы должны быть синхронизированы и поставил на этапах 9-11, когда нейробластов отслаиваться от эктодермы происходит. Постановка эмбрионов слишком рано или слишком поздно, может привести к уменьшению числа нейробластах в каждого эмбриона и, следовательно, выход из строя нейронов уборки из диссоциированных эмбрионов.
- Dechorionate эмбрионы в правой степени (все эмбрионы менять цвет от абсолютно белого до более прозрачным). Под-dechorionation может привести к затруднению в эмбриона диссоциации, в то время как более-dechorionation может привести к повреждению эмбрионов. Декабрьhorionated эмбрионы стать очень липким и мягким, таким образом пытаются избежать пипетирование или касаясь эмбрионов с наконечников пипеток Во время промывки до диссоциации.
- Обратите особое внимание на эмбрионов диссоциации. Мы считаем, что пластиковые одноразовые пеллетах пестики и соответствующие микропробирки дать лучшее диссоциации, чем стекло Dounce гомогенизатор, особенно для небольшого числа эмбрионов. Под-диссоциации оставит большие кластеры клеток, в то время как более-диссоциации приведет к пробою клеток и массивным накоплением остатков клеток. Отрегулируйте уровень диссоциации в соответствии с номерами эмбриона.
- Покрытие нейрон на стекло покровное до разумного плотности. Переполненные нейроны обычно развиваются очень короткие нейриты, в то время как редкие нейроны часто не в состоянии выжить.
Кроме того, мы заметили, что основная клеточные культуры часто содержат мышечных клеток, и клетки крови. Быстро лечение с CytoD помогает уменьшить количество мышечной клетки и клетки крови, а также способствоватьы нейритов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Гельфанда которые внесли вклад в развитие этих протоколов. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института Генеральной медицинских наук из Национального института здоровья в рамках премии числа R01GM052111 к VIG и Постановлением Правительства департамента Басков образования, университетов и исследований при награда числа BFI-2011-295, чтобы УДК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
