Summary
ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं और सभ्य न्यूरॉन्स विवो में मोटर चालित organelle परिवहन की इमेजिंग के लिए महान व्यवस्था कर रहे हैं. यहाँ हम, दोनों प्रकार की कोशिकाओं के संवर्धन के लिए उनके इमेजिंग और परिवहन का विश्लेषण विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं समान रूप से ध्रुवीकृत सूक्ष्मनलिकाएं से भर किसी भी actin-depolymerizing दवा फॉर्म लंबे unbranched प्रक्रियाओं की उपस्थिति में एक coverslip पर चढ़ाया. Organelles microtubule मोटर्स द्वारा इन प्रक्रियाओं के साथ कदम. आसान रखरखाव, आरएनएआई की मध्यस्थता प्रोटीन तोड़े नीचे और स्थिर सेल लाइनों बनाने के लिए कुशल प्रक्रिया के लिए उच्च संवेदनशीलता ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं रहते इमेजिंग द्वारा माल परिवहन अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाते हैं. अलग ड्रोसोफिला भ्रूण से सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स में axonal परिवहन: S2 कोशिकाओं के साथ प्राप्त परिणामों के आगे एक अधिक physiologically प्रासंगिक प्रणाली को लागू किया जा सकता है. सभ्य न्यूरॉन्स S2 प्रक्रियाओं के बहुत समान बंडल सूक्ष्मनलिकाएं से भरा लंबे neurites हो जाना. जैसा S2 कोशिकाओं में, सभ्य न्यूरॉन्स में organelles या तो organelle विशेष फ्लोरोसेंट रंगों से या डीएनए द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट organelle मार्कर का उपयोग करके देखे जा सकते हैं जल्दी भ्रूण में इंजेक्ट या transgen में व्यक्तआईसी मक्खियों. इसलिए, organelle परिवहन आसानी से रह इमेजिंग का उपयोग कांच coverslips पर सभ्य न्यूरॉन्स में दर्ज किया जा सकता है. यहाँ हम ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं और प्राथमिक न्यूरॉन्स में माल परिवहन संवर्धन और दृश्यमान करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. हम इन प्रोटोकॉल माल परिवहन का अध्ययन प्रयोगशालाओं के लिए दोनों प्रणालियों सुलभ बनाने का मानना है कि.
Introduction
ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं कई सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए बढ़ती लोकप्रियता हासिल की है. इन कोशिकाओं को मूल रूप से OregonR ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की trypsinized देर चरण भ्रूण से प्राप्त की है और 1. ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं अन्य सेल लाइनों पर कई लाभ प्रदान बृहतभक्षककोशिका जैसी सुविधाओं को बनाए रखने के थे. वे सीओ 2 के बिना 25 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धित कर रहे हैं, और हीटिंग या गैस विनिमय की आवश्यकता के बिना कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए imaged किया जा सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं ब्याज की प्रोटीन का उच्च दक्षता पछाड़ना की अनुमति आरएनएआई उपचार के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं. S2 कोशिकाओं अत्यधिक transfectable हैं और स्थिर सेल लाइनों ब्याज की प्रोटीन की स्थिर अस्थानिक अभिव्यक्ति अनुमति देने के लिए कम से कम चार सप्ताह में चुना जा सकता है. S2 कोशिकाओं सामान्य रूप से या तो बढ़ने शिथिल संलग्न लेकिन एक कुप्पी पर या निलंबन में फैल नहीं. वे एक संयंत्र लेक्टिन Conca साथ precoated coverslips पर प्रसार करने के लिए प्रेरित किया जा सकता हैnavalin ए (Cona). प्रसार कोशिकाओं की परिधि विशेष रूप से पतली है और इसलिए जीवित सेल माइक्रोस्कोपी के लिए आदर्श है. S2 कोशिकाओं संस्कृति, आरएनएआई उपचार, लाइव प्रकाश इमेजिंग और immunostaining के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल साहित्य 2,3 में पाया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला. ऐसे cytochalasin डी के रूप में एफ actin depolymerizes या severs कि किसी भी दवा, (CytoD) के साथ इलाज ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं, समान रूप से ध्रुवीकृत सूक्ष्मनलिकाएं 4 से भर लंबी प्रक्रियाओं बढ़ने microtubule आधारित कार्गो परिवहन अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप S2 कोशिकाओं को अपनाया है -10, यह microtubule सरणियों साथ कार्गो आंदोलन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है जो बनाता है. इन प्रक्रियाओं में परिवहन के विभिन्न मापदंडों (. यानी प्रक्षेप पथ लंबाई, वेग, दिशात्मकता आदि) आसानी से स्वचालित कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर, DiaTrack (Semasopht का उपयोग करके मापा जा सकता है: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, डॉ. . पास्कल Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). इन गुणों S2 कोशिकाओं ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं साथ कार्गो परिवहन के अध्ययन के लिए एक अपील प्रणाली बनाते हैं.
S2 कोशिकाओं में पायलट प्रयोगों ड्रोसोफिला प्राथमिक न्यूरॉन्स में माल परिवहन के अध्ययन की एक physiologically महत्वपूर्ण मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है. S2 कोशिकाओं के समान, अलग भ्रूण से सभ्य न्यूरॉन्स ऐसे रंगों और inhibitors के रूप में छोटे अणुओं को प्रवेश के योग्य हैं, और organelle परिवहन की उच्च संकल्प रहते इमेजिंग कमरे के तापमान पर न्यूरॉन्स में प्रदर्शन किया जा सकता है. विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ ड्रोसोफिला का उपयोग करना, हम नॉकआउट (आनुवंशिक नुकसान के समारोह म्यूटेशन) द्वारा प्राथमिक न्यूरॉन्स में जीन समारोह की जांच कर सकते हैं, पछाड़ना (dsRNA इंजेक्शन या अभिव्यक्ति) या अस्थानिक अभिव्यक्ति (ट्रांसजेनिक मक्खियों). विशेष रूप से, CytoD उपचार का उपयोग actin filaments के विखंडन neurite परिणाम नहीं रोकता है, बजाय वे तेजी से बढ़ती है, और इस तरह हम microtubule-depende अध्ययन कर सकते हैंactin के प्रभाव के बिना CytoD इलाज न्यूरॉन्स में NT organelle परिवहन 11 फिलामेंट्स. इसलिए, प्राथमिक neuronal संस्कृतियों यह एक शारीरिक प्रासंगिक प्रणाली 10,12 में माल परिवहन अध्ययन करने के लिए एक महान प्रणाली है, जो टिशू कल्चर कोशिकाओं के फायदे गठबंधन और आनुवंशिकी उड़. कई पारिवारिक neurodegenerative रोगों की वजह से या माल परिवहन दोष (जैसे पार्किंसंस रोग 13 के साथ संबद्ध किया जा सकता है, हंटिंगटन बीमारी 14, अल्जाइमर रोग 15,16, Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस / ए एल एस 17, HMN7B और पेरी सिंड्रोम 18,19, और spinocerebellar गतिभंग प्रकार 5/SCA5 20), प्राथमिक neuronal संस्कृतियों microtubule निर्भर परिवहन पर इन रोगों के कारण विशिष्ट परिवर्तन के प्रभावों का विश्लेषण करने में उपयोगी हो सकता है.
अंत में, microtubule निर्भर परिवहन का महत्वपूर्ण गुण अच्छी तरह से स्तनधारियों और मक्खियों के बीच संरक्षित, लेकिन कर रहे हैं
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं
Cona लेपित coverslips की तैयारी
- एक चीनी मिट्टी के रैक में coverslips प्लेस और 1 घंटे के लिए क्रोमिक एसिड विसर्जन द्वारा उन्हें धो लो. [चेतावनी: क्रोमिक एसिड संक्षारक है और आंखों की जलन, नाक, गले और त्वचा पैदा कर सकता है].
- एसिड पूरी तरह से बाहर धोया जाता है जब तक लगातार 30 मिनट के लिए DH 2 हे चलाने के साथ अच्छी तरह से coverslips कुल्ला.
- चलो coverslips शुष्क हवा और Cona 30 मिनट के लिए (DH 2 हे में 0.5 मिलीग्राम / एमएल समाधान) के साथ उन्हें कोट.
- 15 मिनट के लिए DH 2 हे के साथ coverslips कुल्ला और उन्हें शुष्क हवा हैं. Cona लेपित coverslips 1 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
कोशिकाओं चढ़ाना
- S2 कोशिकाओं तेजी से प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार T25 या T75 सेमी 2 बोतल में विकसित करने की अनुमति.
- एक hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व की गणना. जोड़ें 1 मिलीलीटर विकास Mधीरे एक 35 मिमी टिशू कल्चर Cona लेपित coverslip के साथ पकवान, और में edium (उदाहरण के लिए कीट-Xpress) पकवान ~ 1 x 10 5 कोशिकाओं हस्तांतरण. विभिन्न कक्षों से प्रक्रियाओं ओवरलैप नहीं है क्योंकि यह सेल घनत्व इमेजिंग के लिए इष्टतम है.
- तुरंत (2.5 माइक्रोन CytoD के अंतिम एकाग्रता के लिए) डिश के लिए 5 माइक्रोन CytoD साथ 1ml मध्यम जोड़ने चढ़ाना के बाद, प्रक्रियाओं के गठन को प्रेरित करने के लिए. इमेजिंग से पहले 25 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating द्वारा प्रक्रियाओं के पूर्ण विकास की अनुमति दें.
2. ड्रोसोफिला प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति
न्यूरॉन संस्कृति के लिए तैयार
- (:, 5 ग्राम / एमएल इंसुलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन 20% भ्रूण गोजातीय सीरम, 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गर्मी श्नाइडर मध्यम के साथ पूरक) ड्रोसोफिला neuronal विकास मध्यम तैयार . यह समर्थनplemented श्नाइडर मध्यम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- भ्रूण ड्रोसोफिला (22.5 ग्राम अगर, 12.0 ग्राम sucrose और 750 मिलीलीटर एच 2 लीटर फ्लास्क में 2 हे इकट्ठा करने के लिए सेब का रस अगर शीशियों तैयार, 20-25 मिनट के लिए आटोक्लेव, 250 मिलीलीटर सेब का रस जोड़ सकते हैं और प्रत्येक ड्रोसोफिला में ~ 10 मिलीलीटर डालना शीशी;) solidification के बाद, कपास गेंदों के साथ शीशियों प्लग, और भोजन के सूखने से बचने के लिए प्लास्टिक भोजन की चादर के साथ शीशियों लपेटो. अगर शीशियों में सेब का रस 4 सप्ताह के लिए अच्छी तरह से सील प्लास्टिक की थैलियों में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- Cona के साथ कोट एसिड धोया 25 मिमी चक्र coverslips (ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल में विवरण देखें) और 10-15 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत उन्हें बाँझ. ये coverslips एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
ड्रोसोफिला भ्रूण न्यूरॉन संस्कृति
- रखें युवा वयस्क भ्रूण च एकत्रित पहले 1-2 दिनों के लिए सूखी खमीर के साथ पूरक सेब का रस अगर शीशियों में मक्खियोंया न्यूरॉन तैयारी.
- एकत्रित दिन, एकत्र भ्रूण सिंक्रनाइज़ करने के क्रम में, स्थानांतरण वयस्क प्रकाश में 1 घंटा precollection के लिए एक ताजा सेब का रस अगर शीशी के लिए मक्खियों और इन भ्रूण को त्यागें.
- स्थानांतरण 1 घंटे के लिए भ्रूण लीजिए, और भ्रूण पैदावार बढ़ाने के अंधेरे में दोनों, एक घंटे के लिए एक और शीशी मक्खियों स्थानांतरण, एक नए सेब का रस अगर शीशी के लिए मक्खियों.
- सेब का रस अगर शीशी से वयस्क मक्खियों निकालें और भ्रूण कमरे के तापमान (4-6 घंटा पुराने भ्रूण चरण 9-11 के बीच कर रहे हैं) पर चरणों के लिए किसी अन्य 4 घंटा 9-11 विकसित करते हैं.
- शीशियों में पानी squirting और (कम से कम 10 भ्रूण एक अच्छा न्यूरॉन प्रस्तुत करने के लिए आवश्यक हैं) एक छोटे तूलिका के साथ सेब का रस अगर से भ्रूण ढीला द्वारा भ्रूण निकालें.
- पानी के निकास के लिए एक हस्तांतरण विंदुक के साथ एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल झरनी भ्रूण स्थानांतरण (ड्रोसोफिला भ्रूण धोने बफर, 0.4% NaCl, 0.03% ट्राइटन में हस्तांतरण विंदुक prerinseX-100).
- एक छोटे तूलिका का उपयोग झरनी से भ्रूण लीजिए, और 1 मिलीलीटर ड्रोसोफिला भ्रूण धोने (नोट: तूलिका या पिपेट सुझावों का उपयोग कर किसी भी अगर या कपास फाइबर साफ) से भरा एक 1.5 एमएल microtube में उन्हें स्थानांतरण. इस प्रोटोकॉल में, 1.5 एमएल microtube एक मेल डिस्पोजेबल गोली मूसल के साथ आता है.
- ड्रोसोफिला भ्रूण 3X धो में भ्रूण धो लें.
- 10 मिनट के लिए एक ताजा 01:01 वाणिज्यिक ब्लीच का समाधान और 95% इथेनॉल में भ्रूण dechorionate [चेतावनी: ब्लीच जलन आंखों को, नाक, गले और त्वचा पैदा कर सकता है].
- टिशू कल्चर हुड में ले जाएँ, और पूरक श्नाइडर के मध्यम में भ्रूण 2x धो लो.
- भ्रूण के साथ ट्यूब में 200-300 μl मध्यम छोड़ दो, और धीरे यंत्रवत् (10-15x पीस) 70% इथेनॉल द्वारा निष्फल किया गया है कि Kimble चेस डिस्पोजेबल गोली pestles का उपयोग dechorionated भ्रूण को अलग कर देना.
- 2 मिनट, और टीआरए के लिए 20 XG पर homogenized मिश्रण अपकेंद्रित्रएक ताजा ट्यूब पर तैरनेवाला nsfer. [यह कदम वैकल्पिक है, यह भ्रूण मलबे को हटाने में मदद करता है]
- गोली कोशिकाओं के लिए 2 मिनट के लिए 550 XG पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र.
- 2 मिनट के लिए 550 XG पर फिर श्नाइडर मध्यम और स्पिन कोशिकाओं नीचे पूरक 500 μl में गोली Resuspend, एक बार मेजबान कताई चक्र को दोहराएँ.
- अंत में श्नाइडर मध्यम पूरक ~ 100 μl में गोली resuspend और एक बाँझ 35 मिमी पेट्री डिश में एक 25 मिमी Cona लेपित coverslip पर कोशिकाओं थाली. सेल लगाव अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- संलग्न कोशिकाओं के साथ coverslip डूब 5 माइक्रोन CytoD के साथ पूरक श्नाइडर के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें.
- इमेजिंग से पहले रात भर एक humidified 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान सेते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक फ्लैट दौर "पैनकेक" आकार (आंकड़े 1 ए और 1 सी) में Cona लेपित coverslip प्रसार पर संलग्न ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं. S2 कोशिकाओं CytoD की उपस्थिति में coverslips पर चढ़ाया और 2-3 घंटे के लिए प्रसार करने के लिए अनुमति दी हालांकि, जब वे समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं (आंकड़े 1 बी और 1 डी) से भरा लंबे पतले प्रक्रियाओं के रूप में. 7 प्लस समाप्त होता है के साथ ये सूक्ष्मनलिकाएं वर्दी polarity है. ड्रोसोफिला S2 stably mCherry ट्यूबिलिन व्यक्त करने का समय चूक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रक्रियाओं विशेष रूप से लगाव के बाद पहले 60 मिनट (चित्रा 2) के दौरान, बहुत गतिशील हैं कि पता चलता है. 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, उनके विकास को धीमा कर देती है और 2-3 घंटे ऊष्मायन कोशिकाओं के बहुमत पूरी तरह से प्रक्रियाओं हो गए हैं कि यह सुनिश्चित करता है. यहाँ हम S2 कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं साथ organelle परिवहन के दो प्रतिनिधि उदाहरण दिखा, LysoTracker, 200 एनएम के साथ लेबल लाइसोसोम (; आंकड़े 3a-B 7 (स्थिर अभिकर्मक के साथ लेबल पेरोक्सिज़ोम (; आंकड़े 3 डी ई). कोशिकाओं के समय चूक छवियों Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित एक संपूर्ण ध्यान प्रणाली (Nikon) और CoolSNAP सीसीडी कैमरा (नट वैज्ञानिक) से सुसज्जित एक Nikon टीयू-2000 उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग 61 फ्रेम के लिए हर 1 सेकंड ले जाया गया. एक 100 डब्ल्यू हलोजन प्रकाश स्रोत photobleaching और phototoxicity कम करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस क्रम में 61 फ्रेम के हर रंग ऊपरी सही और छवियों रंग कोडित पटरियों उत्पन्न करने के लिए आरोपित किया गया पर पट्टी के अनुसार कोडित था. स्थिर कणों 10 सफेद दिखाई दिया, जबकि इस प्रकार चलती कणों, इंद्रधनुष पटरियों उत्पन्न. प्लग में ImageJ टेम्पोरल कलर कोड ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) इस प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम DiaTrack सॉफ्टवेयर (Semasopht इंक) का इस्तेमाल किया organelle आंदोलन की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, हम केवल चयनवे आसानी से लगाया जा सकता है और microtubule पटरियों के polarity में जाना जाता है क्योंकि प्रक्रियाओं में अनुवादित हैं कि organelles. -3 सी और 3F क्रमशः, लाइसोसोम और पेरोक्सिज़ोम ट्रैकिंग द्वारा प्राप्त प्रतिगामी और अग्रगामी वेग के विशिष्ट वितरण दिखाने के आंकड़े.
इसी तरह की तकनीक प्राथमिक सभ्य न्यूरॉन्स में organelle परिवहन के विश्लेषण के लिए हमारी प्रयोगशाला में किया जाता है. न्यूरॉन्स चरण 9-11 भ्रूण से प्राप्त की मिश्रित संस्कृतियों में एक प्रमुख सेल प्रकार के होते हैं. रात भर संवर्धन के बाद वे माइक्रोन 50 से अधिक लंबी (चित्रा -4 ए) कर रहे हैं कि neurites साथ विशेषता सेल आकार से पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं. इन कोशिकाओं को भी अखिल neuronal मार्कर, ELAV 21 (आंकड़े 4 बी और 4 बी ') के लिए सकारात्मक हैं. न्यूरॉन्स में प्रक्रियाओं सूक्ष्मनलिकाएं (आंकड़े 4 बी और 4 बी ") के साथ भर रहे हैं. हम ते का उपयोग neurites साथ organelle परिवहन ट्रैक कर सकते हैंchniques S2 कोशिकाओं के लिए ऊपर वर्णित है. Mitochondria एक मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर D42 22 (आंकड़े 5 ए और 5 ए ') के नियंत्रण में mitochondrial GFP (Mito-GFP) के साथ लेबल किया जा सकता है, और पेरोक्सिज़ोम syncytial में, एक peroxisome लक्षित mCherry 7 एन्कोडिंग डीएनए इंजेक्शन द्वारा चिह्नित किया जा सकता है निषिक्त चरण भ्रूण (आंकड़े 5 ब और 5 ब ').
CytoD से प्रेरित चित्रा 1. ड्रोसोफिला S2 प्रक्रिया गठन. Cona-precoated coverslips में चढ़ाया जब (ए, सी) ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं देते हैं और समतल और गोल आकार में फैल गया. 2.5 माइक्रोन CytoD की उपस्थिति में चढ़ाया (बी, डी) S2 कोशिकाओं 3 घंटा ऊष्मायन के बाद सूक्ष्मनलिकाएं से भर लंबी प्रक्रियाओं के रूप में. <मजबूत> एबी और सीडी क्रमशः, प्रकाश और फ्लोरोसेंट mCherry टैग ट्यूबिलिन छवियों प्रेषित कर रहे हैं. स्केल बार, 10 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. एक ड्रोसोफिला S2 सेल में प्रक्रियाओं के विकास का समय व्यतीत हो. 2.5 माइक्रोन CytoD की उपस्थिति में mCherry ट्यूबिलिन व्यक्त ड्रोसोफिला S2 सेल के प्रतिदीप्ति समय व्यतीत हो. संख्या सेल coverslip के लिए देते हैं के बाद समय से संकेत मिलता है. स्केल बार, 5 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. ड्रोसोफिला S2 सेल में ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में organelle परिवहन. (एसी) lysosome आंदोलन. एक सेल (फिजी के द्वारा बनाई गई) कृत्रिम लौकिक कोड (बी) के प्रतिनिधित्व वाले (ए, डीआईसी छवि) में (200 एनएम Lysotracker के साथ लेबल) एक प्रतिनिधि 1 मिनट लाइसोसोम परिवहन. प्रक्रियाओं में ट्रैक लाइसोसोम आंदोलन के विश्लेषण से प्राप्त वेग (DiaTrack, 23 कक्षों में 663 कणों) (सी). ड्रोसोफिला S2 सेल में (डीएफ) peroxisome आंदोलन. (फिजी के द्वारा बनाई गई) कृत्रिम लौकिक कोड (ई) के प्रतिनिधित्व वाले एक कक्ष (डी, डीआईसी छवि) में (पी एम टी GFP-SKL के साथ लेबल) एक प्रतिनिधि 1 मिनट peroxisome परिवहन. प्रक्रियाओं में ट्रैक peroxisome आंदोलन के विश्लेषण से प्राप्त वेग (DiaTrack, 20 कक्षों में 228 कणों) (एफ). लाइसोसोम कदम है कि नोट पेरोक्सिज़ोम की तुलना में अब और तेजी से trajectories के साथ. स्केल बार, 5 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. रातोंरात संस्कृति से प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स. (ए) एक रात में सुसंस्कृत ड्रोसोफिला न्यूरॉन लंबे neurites साथ विशेषता neuronal आकारिकी है. (बी) के न्यूरॉन एक अखिल neuronal मार्कर, ELAV (बी में लाल और बी में सफेद ', DSHB, 7E8A10, 1:100) व्यक्त और बी में सूक्ष्मनलिकाएं (हरे और बी में सफेद रंग के साथ भरा लंबे neurites के साथ'', DM1α , 1:1000). स्केलपट्टी, 5 माइक्रोन. एन.के. "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. सुसंस्कृत ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स में organelle परिवहन. एक मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर, D42 के नियंत्रण में Mito-GFP द्वारा चिह्नित एक सुसंस्कृत ड्रोसोफिला न्यूरॉन में (ए) Mitochondria. (ए) (ए) में 5 मिनट mitochondrial आंदोलन (फिजी के द्वारा बनाई गई) कृत्रिम टेम्पोरल रंग कोड द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. (बी) पीएसी SKL-mCherry द्वारा चिह्नित एक सुसंस्कृत ड्रोसोफिला न्यूरॉन में पेरोक्सिज़ोम, जल्दी syncytial निषिक्त चरण भ्रूण में इंजेक्ट किया. (बी) (बी) में 2 मिनट peroxisome आंदोलन (फिजी के द्वारा बनाई गई) कृत्रिम टेम्पोरल रंग कोड द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. स्केल बार, 5 माइक्रोन.ig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| Organelle | विवरण |
| पेरोक्सिज़ोम | Peroxisomal लक्ष्यीकरण संकेत 1 त्रिपेपटाइड (SKL) एक एफ पी 25 के साथ टैग |
| Mitochondria | साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट आठवीं की mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम एक एफ पी 26 के साथ टैग |
| Mitochondria | Mitotracker (सक्रिय mitochondria में जम जाता है जो डाई) 27 |
| लाइसोसोम | सेलुलर में जम जाता है, जो Lysotracker (डाईकम आंतरिक पीएच के साथ डिब्बों) 28 |
तालिका 1. सबसे आम organelle लेबलिंग रणनीतियों.
इस तालिका पेरोक्सिज़ोम की लेबलिंग, mitochondria, और लाइसोसोम सहित टिशू कल्चर कोशिकाओं में सबसे आम organelle लेबलिंग रणनीतियों, सार.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ हम ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं और प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति में microtubule निर्भर कार्गो परिवहन के अध्ययन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. दोनों S2 प्रक्रियाओं और neurites organelle परिवहन के लिए पटरियों के रूप में सेवा है कि बंडल सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों से भरा संरचनाओं हैं.
दो रणनीतियों आमतौर पर लेबल organelles के लिए उपयोग किया जाता है: संस्कृतियों को सीधे जोड़ा फ्लोरोसेंट रंगों के साथ एक organelle लक्ष्य अनुक्रम या धुंधला के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग वैक्टर के अभिकर्मक. कार्गो लेबल के सामान्य उदाहरण 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं. कोशिकाओं इमेजिंग के लिए coverslips पर चढ़ाया जाता है पहले ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक या आरएनएआई उपचार आवश्यक हो तो निलंबन 4,6,7,9,10 में किया जाता है.
S2 सेल प्रयोगों में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह निम्नलिखित बातों का ध्यान रखना जरूरी है:
- इमेजिंग के लिए इष्टतम घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं. उच्च मांदकम घनत्व कोशिकाओं गरीब व्यवहार्यता है और प्रक्रियाओं के लिए फार्म में असमर्थ हैं, जबकि sity, विभिन्न कक्षों से प्रक्रियाओं की ओवरलैपिंग का परिणाम देगा.
- S2 कोशिकाओं को पूरी तरह प्रक्रियाओं को विकसित करने की अनुमति दें. हम नियमित तौर पर चढ़ाना लेकिन यदि आवश्यक हो तो 24 घंटे के लिए ऊष्मायन अप किया जा सकता है के बाद 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- वे Cona लेपित coverslips को देते पहले S2 कोशिकाओं CytoD के साथ इलाज किया जाना चाहिए. कोशिकाओं जुड़े होते हैं के बाद दवा जोड़ने प्रक्रियाओं गठन को प्रेरित नहीं करेगा.
- Mitotracker या Lysotracker के साथ या तो कोशिकाओं की लंबी अवधि के ऊष्मायन कोशिकाओं को विषाक्त है, रंग, हर 20-25 मिनट के लिए इमेजिंग परिवर्तन के नमूनों का प्रयोग करते हैं.
- हम आम तौर पर 1 फ्रेम / सेकंड में 1 मिनट के लिए इमेजिंग द्वारा S2 कोशिकाओं में माल परिवहन को ट्रैक. इस शर्त के तहत कोशिकाओं फोटो क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं.
- केवल सेल प्रक्रियाओं में organelle आंदोलन का विश्लेषण. सेल शरीर में organelle घनत्व विश्वसनीय ट्रैकिंग और आंदोलन के polarity आसानी से निर्धारित नहीं किया जा सकता है के लिए बहुत अधिक है.
इस प्रोटोकॉल में, आप नीचे दिए गए कई महत्वपूर्ण कदम के लिए ध्यान देने की जरूरत है हो सकता है:
- सही ढंग चरण भ्रूण. बाहरी झिल्ली से Neuroblast delamination तब होता है जब एकत्र भ्रूण, सिंक्रनाइज़ और चरणों 9-11 तक का मंचन करने की आवश्यकता है. बहुत जल्दी भ्रूण मचान या बहुत देर से प्रत्येक भ्रूण में कम neuroblasts में हो सकता है और अलग भ्रूण के बाहर कटाई न्यूरॉन्स की इस प्रकार की विफलता.
- सही हद तक dechorionate भ्रूण (सभी भ्रूण अधिक पारदर्शी पूरी तरह से सफेद रंग से रंग बदल). पर-dechorionation भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि अंडर dechorionation, भ्रूण हदबंदी में कठिनाई हो सकती. दिस.horionated भ्रूण बहुत चिपचिपा और मुलायम हो जाते हैं, इस प्रकार pipetting या हदबंदी से पहले धोने चरणों के दौरान पिपेट सुझावों के साथ भ्रूण को छू से बचने के लिए प्रयास करें.
- हदबंदी भ्रूण के लिए विशेष ध्यान दे. हम प्लास्टिक डिस्पोजेबल गोली pestles और मिलान microtubes विशेष रूप से भ्रूण की छोटी संख्या के लिए, एक गिलास Dounce homogenizer से बेहतर हदबंदी दे पाते हैं. पर-हदबंदी कोशिकाओं के टूटने और सेल मलबे का असीम और संचय को बढ़ावा मिलेगा, जबकि अंडर हदबंदी, बड़े सेल समूहों छोड़ देंगे. भ्रूण संख्या के अनुसार हदबंदी स्तर समायोजित करें.
- एक उचित घनत्व को कांच coverslip पर न्यूरॉन चढ़ाना. विरल न्यूरॉन्स अक्सर जीवित करने में विफल है, जबकि भीड़ न्यूरॉन्स आमतौर पर बहुत ही कम neurites विकास.
इसके अतिरिक्त, हम प्राथमिक सेल संस्कृतियों अक्सर मांसपेशियों की कोशिकाओं होते देखा है कि, और रक्त कोशिकाओं. CytoD के साथ रात भर उपचार पेशी सेल और रक्त कोशिका की संख्या कम है, और बढ़ावा देने के लिए मदद करता हैneurite परिणाम है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम इन प्रोटोकॉल के विकास के लिए जो योगदान दिया Gelfand प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. इस प्रकाशन में सूचना दी अनुसंधान पुरस्कार संख्या बीएफआई-2011-295 UDC के तहत VIG को पुरस्कार संख्या R01GM052111 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंस के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा और बास्क सरकार शिक्षा विभाग, विश्वविद्यालयों और अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
