Summary
خلايا ذبابة الفاكهة S2 والخلايا العصبية مثقف هي أنظمة كبيرة للتصوير النقل عضية بالمحركات في الجسم الحي. نحن هنا تصف بروتوكولات مفصلة لزراعة كل من أنواع الخلايا، والتصوير، وتحليل النقل.
Abstract
خلايا ذبابة الفاكهة S2 مطلي على ساترة في وجود أي شكل من المخدرات depolymerizing الأكتين العمليات غير متفرعة طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة الاستقطاب بشكل موحد. العضيات تتحرك هذه العمليات من قبل محركات أنيبيب. سهولة الصيانة، وحساسية عالية لبروتين رني بوساطة تدق إلى أسفل وإجراءات فعالة لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة تجعل خلايا ذبابة الفاكهة S2 نظام نموذج مثالي لدراسة نقل البضائع عن طريق التصوير الحي. النتائج التي تم الحصول عليها مع الخلايا S2 يمكن تطبيقها إضافية لنظام أكثر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية: نقل محور عصبي في الخلايا العصبية الأولية مثقف من أجنة ذبابة الفاكهة فصلها. تنمو الخلايا العصبية مثقف neurites التي طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة المجمعة، تشبه الى حد بعيد عمليات S2. كما هو الحال في خلايا S2، العضيات في الخلايا العصبية مثقف يمكن تصور من قبل أي عضية محددة الأصباغ الفلورية أو باستخدام علامات عضية الفلورسنت المشفرة بواسطة الحمض النووي حقنها في أجنة مبكرة أو المعبر عنها في transgenجيم الذباب. وبالتالي، النقل عضية يمكن تسجيلها بسهولة في الخلايا العصبية مثقف على coverslips الزجاج باستخدام التصوير الحي. نحن هنا وصف الإجراءات لزراعة وتصور نقل البضائع في خلايا ذبابة الفاكهة S2 والخلايا العصبية الأولية. ونحن نعتقد أن هذه البروتوكولات جعل كلا النظامين للوصول للمختبرات دراسة نقل البضائع.
Introduction
اكتسبت خلايا ذبابة الفاكهة S2 شعبية متزايدة لدراسة العديد من العمليات الخلوية. وقد تم الحصول على هذه الخلايا في الأصل من trypsinized الأجنة مرحلة متأخرة من OregonR ذبابة الفاكهة السوداء البطن والحفاظ على ميزات مثل بلعم 1. خلايا ذبابة الفاكهة S2 توفر العديد من المزايا أكثر من خطوط الخلايا الأخرى. هم مثقف عند 25 درجة مئوية دون CO 2، ويمكن تصوير لساعات طويلة في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة للتدفئة أو تبادل الغاز. الأهم من ذلك، خلايا ذبابة الفاكهة S2 حساسة للغاية للعلاج رني السماح كفاءة عالية من البروتينات ضربة قاضية من الفائدة. خلايا S2 هي transfectable للغاية وخطوط الخلايا مستقرة يمكن تحديدها في أقل من أربعة أسابيع للسماح للتعبير خارج الرحم مستقرة البروتينات المثيرة للاهتمام. خلايا S2 عادة تنمو إما فضفاضة يعلق ولكن لم ينتشر على قارورة أو في التعليق. أنها يمكن أن يتسبب في نشر coverslips على precoated مع كونكا كتين النباتnavalin A (كونا). هامش انتشار خلايا رقيقة خاصة، وبالتالي يعتبر مثاليا للفحص المجهري الخلية الحية. بروتوكولات مفصلة للثقافة الخلايا S2، العلاج رني، والتصوير ضوء الحية والمناعية ويمكن العثور عليها في 2،3 الأدب. وقد اعتمدت لدينا مختبر الخلايا S2 كنظام نموذج لدراسة نقل البضائع على أساس أنيبيب. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تعامل مع أي نوع من المخدرات التي depolymerizes أو يقطع F-الأكتين، مثل مثبط حركة الخلايا D (CytoD)، وتنمو عمليات طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة الاستقطاب بشكل موحد 4 -10، مما يجعله نظام مثالي لدراسة حركة نقل البضائع على طول صفائف أنيبيب. المعلمات النقل المختلفة في هذه العمليات (. أي أطوال المسارات، السرعات، الاتجاهية الخ) يمكن قياسها بسهولة باستخدام البرمجيات الآلي لتتبع الجسيمات، DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423، والدكتور باسكال Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). هذه الخصائص تجعل الخلايا S2 نظام جذابة لدراسة نقل البضائع على طول الأنابيب الدقيقة في الخلايا زراعة الأنسجة.
التجارب الرائدة في الخلايا S2 يمكن أن تمتد إلى نموذج مهمة من الناحية الفسيولوجية للدراسات نقل البضائع في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الأولية. مماثلة لخلايا S2، الخلايا العصبية مثقف من أجنة فصلها هي قابلة للاختراق إلى جزيئات صغيرة مثل الأصباغ ومثبطات، وعالية الدقة التصوير الحي النقل عضية لا يمكن أن يؤديها في الخلايا العصبية في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ذبابة الفاكهة مع خلفيات وراثية مختلفة، ونحن يمكن دراسة وظائف الجينات في الخلايا العصبية الأولية بالضربة القاضية (الجينية الخسارة من وظيفة الطفرات)، ضربة قاضية (الرنا المزدوج الجديلة حقن أو التعبير) أو التعبير خارج الرحم (الذباب المعدلة وراثيا). على وجه التحديد، تفتيت خيوط الأكتين باستخدام العلاج CytoD لا يمنع ثمرة neurite، بدلا من ذلك أنها تنمو بشكل أسرع، وبالتالي يمكننا دراسة أنيبيب-dependeالإقليم الشمالي النقل عضية في الخلايا العصبية CytoD المعاملة دون تأثير الأكتين خيوط 11. وبالتالي، الثقافات العصبية الأولية الجمع بين مزايا الخلايا زراعة الأنسجة وتطير الوراثة، مما يجعل من نظام كبير لدراسة نقل البضائع في نظام الفسيولوجية ذات الصلة 10،12. منذ قد يكون السبب العديد من الأمراض العصبية العائلية من قبل أو المرتبطة العيوب نقل البضائع (مثل مرض باركنسون 13، مرض هنتنغتون 14، 15،16 مرض الزهايمر، التصلب الجانبي الضموري / 17 ALS، وHMN7B بيري متلازمة 18،19، ومخيخي شوكي نوع ترنح 5/SCA5 20)، ويمكن الثقافات العصبية الأولية أن تكون مفيدة في تحليل آثار الطفرات محددة تسبب هذه الأمراض في وسائل النقل التي تعتمد على أنيبيب.
أخيرا، الخصائص الهامة النقل التي تعتمد على أنيبيب يتم حفظها جيدا بين الثدييات والذباب، ولكن
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلايا ذبابة الفاكهة S2
إعداد coverslips كونا المغلفة
- وضع coverslips في رفوف السيراميك وغسلها عن طريق الغمر حامض الكروم لمدة 1 ساعة. [تحذير: حامض الكروم هو تآكل ويمكن أن يسبب تهيج العينين والأنف والحلق والجلد].
- شطف coverslips تماما مع تشغيل باستمرار DH 2 O لمدة 30 دقيقة حتى يتم غسلها تماما من حامض.
- اسمحوا الهواء coverslips الجافة ومعطف لهم مع CONA (محلول 0.5 ملغ / مل في DH 2 O) لمدة 30 دقيقة.
- شطف coverslips مع DH 2 O لمدة 15 دقيقة والسماح لهم الهواء الجاف. ويمكن تخزين coverslips كونا المغلفة يصل إلى 1 في الشهر.
طلاء الخلايا
- تسمح للخلايا S2 لتنمو باطراد في T25 T75 أو سم 2 قوارير اعتمادا على عدد من الخلايا المطلوبة للتجربة.
- عد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة 1 مل نمو مedium (على سبيل المثال الحشرات-إكسبرس) إلى 35 مم الأنسجة طبق الثقافة مع ساترة كونا المغلفة، وبلطف نقل ~ 1 × 10 5 خلايا إلى الطبق. هذا كثافة الخلية هو الأمثل للتصوير بسبب العمليات من خلايا مختلفة لا تتداخل.
- من أجل حمل تشكيل العمليات، وعلى الفور بعد الطلاء إضافة المتوسطة 1ML مع 5 ميكرومتر CytoD إلى الطبق (إلى تركيز النهائي من 2.5 ميكرومتر CytoD). تسمح التنمية الكاملة للعمليات التي يحتضنها الخلايا على الأقل لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية قبل التصوير.
2. ذبابة الفاكهة الابتدائية العصبية الثقافة
استعدادا للثقافة العصبية
- إعداد ذبابة الفاكهة المتوسطة نمو الخلايا العصبية (وسط شنايدر تستكمل مع: 20٪ مصل بقري جنيني، والحرارة المعطل في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 5 ميكروغرام / الانسولين مل و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 10 ميكروغرام / التتراسيكلين مل) . هذا سوبويمكن تخزين المتوسطة plemented شنايدر في 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
- إعداد قارورة عصير التفاح أغار لجمع أجنة ذبابة الفاكهة (22.5 ز آغار، 12.0 غرام السكروز و 750 مل H 2 O في قارورة 2 لتر؛ الأوتوكلاف لمدة 20-25 دقيقة، ويضاف 250 مل عصير التفاح وتصب ~ 10 مل في كل ذبابة الفاكهة قنينة، وبعد التصلب، والمكونات قارورة مع كرات من القطن، والتفاف قارورة مع التفاف البلاستيك الغذائي لتجنب ما يزيد على تجفيف الطعام). يمكن تخزين عصير التفاح في قارورة أجار في 4 درجة مئوية في أكياس من البلاستيك مختوم بشكل جيد لمدة 4 أسابيع.
- غسلها حمض معطف 25 ملم coverslips دائرة مع CONA (انظر التفاصيل في البروتوكول لخلايا ذبابة الفاكهة S2) وتعقيم منهم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10-15 دقيقة. ويمكن تخزين هذه coverslips لمدة شهر.
ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الجنينية الثقافة
- الذباب حفاظ على الشباب البالغين في قارورة عصير التفاح أجار تستكمل مع الخميرة الجافة لمدة 1-2 أيام قبل جمع الأجنة وأو إعداد الخلايا العصبية.
- في يوم جمع، من أجل مزامنة الأجنة التي تم جمعها، والذباب نقل الكبار إلى عصير التفاح أغار قارورة جديدة لمدة 1 ساعة precollection في ضوء وتجاهل هذه الأجنة.
- نقل الذباب لعصير التفاح أغار جديدة القارورة، وجمع الأجنة لمدة 1 ساعة، ونقل الذباب إلى قارورة أخرى لمدة ساعة أخرى، سواء في الظلام لزيادة الغلة الجنين.
- إزالة الذباب الكبار من عصير التفاح أغار قارورة والسماح للأجنة تطوير ساعة أخرى 4 إلى مراحل 9-11 في درجة حرارة الغرفة (4-6 الأجنة ساعة قديمة ما بين مرحلة 9-11).
- إزالة الأجنة من خلال دفق الماء في قارورة وتخفيف الأجنة من عصير التفاح أغار مع الفرشاة الصغيرة (مطلوبة لا يقل عن 10 أجنة واحدة جيدة الخلايا العصبية الإعدادية).
- نقل الأجنة إلى 100 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة الخلية مع ماصة نقل لتصريف المياه (prerinse ماصة نقل في ذبابة الفاكهة غسل العازلة الجنين، 0.4٪ كلوريد الصوديوم، 0.03٪ تريتونX-100).
- جمع الأجنة من مصفاة باستخدام الفرشاة الصغيرة، ونقلها إلى 1.5 مل microtube مليئة 1 مل ذبابة الفاكهة غسل الجنين (ملاحظة: تنظيف أي ألياف القطن أجار أو باستخدام الفرشاة أو نصائح ماصة). في هذا البروتوكول، وmicrotube 1.5 مل يأتي مع مطابقة المتاح بيليه مدقة.
- غسل الأجنة في ذبابة الفاكهة غسل 3X الجنين.
- Dechorionate الأجنة في حل 1:1 جديدة من التبييض التجارية والايثانول 95٪ لمدة 10 دقيقة [تحذير: التبييض يمكن أن تسبب تهيج للعيون والأنف والحنجرة، والجلد].
- الانتقال إلى نسيج الثقافة هود، وغسل الأجنة في 2X تستكمل المتوسطة شنايدر.
- ترك 200-300 ميكرولتر المتوسطة في أنبوب مع الأجنة، وبلطف فصل ميكانيكيا باستخدام أجنة dechorionated كيمبل تشيس المطاحن بيليه القابل للتصرف التي تم تعقيمها بواسطة الايثانول 70٪ (طحن 10-15X).
- أجهزة الطرد المركزي الخليط المتجانس في 20 x ج لمدة 2 دقيقة، وهيئة تنظيم الاتصالاتnsfer طاف لأنبوب جديد. [هذه الخطوة اختيارية، بل يساعد على إزالة الحطام الجنين]
- أجهزة الطرد المركزي لطاف في 550 x ج لمدة 2 دقيقة لتكوير الخلايا.
- resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر تستكمل الخلايا المتوسطة وتدور شنايدر إلى أسفل مرة أخرى في 550 x ج لمدة 2 دقيقة، كرر دورة إعادة تعليق الغزل مرة واحدة.
- أخيرا resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر ~ تستكمل المتوسطة شنايدر ولوحة الخلايا في الصعود إلى 25 ملم ساترة كونا المغلفة في العقيمة 35 ملم طبق بيتري. احتضان لمدة 10 دقيقة للسماح مرفق الخلية.
- إضافة 2 مل من المتوسط تستكمل شنايدر، مع 5 ميكرومتر CytoD لغمر ساترة مع الخلايا المرفقة.
- احتضان الطبق في ترطيب 25 º C حاضنة بين عشية وضحاها قبل التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا ذبابة الفاكهة S2 تعلق على انتشار ساترة كونا المغلفة في جولة شقة "فطيرة" شكل (أرقام 1A و 1C). ومع ذلك، عندما الخلايا S2 مطلي coverslips على في وجود CytoD وسمح لنشر لمدة 2-3 ساعة، أنها تشكل عمليات طويلة رقيقة يشغلها الأنابيب الدقيقة موازية (الأرقام 1B و 1D). هذه الأنابيب الدقيقة لديها قطبية موحدة مع زائد ينتهي من 7. الوقت الفاصل بين التصوير مضان من ذبابة الفاكهة S2 التعبير عن ثابت mCherry-تويولين يدل على أن العمليات هي ديناميكية للغاية، وخصوصا خلال أول 60 دقيقة بعد التعلق (الشكل 2). بعد 1 ساعة الحضانة، يؤدي إلى إبطاء نموها أسفل ويضمن 2-3 ساعة الحضانة أن الغالبية العظمى من الخلايا قد نمت بشكل كامل العمليات. نحن هنا تظهر مثالين ممثل النقل عضية على طول الأنابيب الدقيقة في الخلايا S2، الجسيمات الحالة (المسمى مع LysoTracker، 200 نانومتر؛ أرقام 3A-B 7 (ترنسفكأيشن مستقرة مع باك GFP-SKL؛ أرقام 3D-E). وقد أخذت صور الوقت الفاصل بين الخلايا كل 1 ثانية لمدة 61 لقطة باستخدام مجهر مقلوب نيكون TU-2000 مزودة بنظام التركيز الكمال (نيكون) وCoolsnap كاميرا CCD (روبر العلمية) مدفوعا البرمجيات Metamorph. تم استخدام مصدر ضوء الهالوجين 100-W لمضان الإثارة لتقليل photobleaching من والضيائية. كل من إطارات 61 في تسلسل ومرمزة وفقا لشريط في الجزء العلوي الأيمن والصور تم فرضه لتوليد المسارات مرمزة. جسيمات تتحرك بالتالي تتولد المسارات قوس قزح، في حين ظهرت جزيئات ثابتة أبيض 10. يماغيج المكونات في الزمانية لون الرمز ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) كان يستخدم لهذه المعالجة. للتحليل الكمي للحركة عضية كنا البرمجيات DiaTrack (Semasopht شركة)، ونحن فقط تحديدالعضيات أن تكون مترجمة في العمليات لأنها يمكن تعقبها بسهولة وكما هو معروف قطبية من المسارات أنيبيب. أرقام 3C و3F تظهر التوزيعات نموذجية من سرعات إلى الوراء وتقدمي الجسيمات الحالة التي حصلت عليها وperoxisomes تتبع، على التوالي.
وتستخدم تقنيات مشابهة في المختبر للتحليل النقل عضية في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي. الخلايا العصبية هي نوع من الخلايا السائدة في الثقافات المختلطة التي تم الحصول عليها من المرحلة 9-11 الأجنة. بعد زراعة بين عشية وضحاها لأنها سهلة للاعتراف من قبل شكل الخلية مميزة مع neurites التي التي هي أكثر من 50 ميكرومتر طويلة (الشكل 4A). هذه الخلايا هي أيضا إيجابية للعلامة عموم العصبية، Elav 21 (أرقام 4B و 4B). تمتلئ العمليات في الخلايا العصبية مع الأنابيب الدقيقة (أرقام 4B و 4B ")، ونحن يمكن أن تتبع النقل عضية على طول neurites التي تستخدم الشركة المصرية للاتصالاتchniques الشركة المذكورة أعلاه للخلايا S2. يمكن أن يكون المسمى الميتوكوندريا مع GFP الميتوكوندريا (ميتو-GFP) تحت سيطرة العصبون الحركي محددة المروج D42 22 (أرقام 5A 5A و')، ويمكن أن تكون علامة peroxisomes عن طريق الحقن من الحمض النووي ترميز استهداف بيروكسية mCherry 7، في المخلوي الأجنة مرحلة الأريمة (أرقام 5B 5B و').
الشكل 1. تشكيل عملية ذبابة الفاكهة S2 الناجمة عن CytoD. الخلايا (A، C) ذبابة الفاكهة S2 نعلق وتنتشر في الأشكال وتتسطح الجولة عندما مطلي في coverslips CONA precoated. خلايا (B، D) S2 مطلي في وجود 2.5 ميكرون CytoD تشكيل عمليات طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة 3 بعد ساعة الحضانة. <وتنتقل قوية> AB CD وضوء الفلورسنت والصور تويولين الموسومة mCherry، على التوالي. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. الفاصل الزمني للنمو العمليات في خلية ذبابة الفاكهة S2. الإسفار الوقت الفاصل بين خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن mCherry-تويولين في وجود 2.5 ميكرومتر CytoD. الأرقام تشير إلى وقت بعد الخلية نعلق على ساترة. شريط النطاق، 5 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. حركة النقل عضية في خلايا ذبابة الفاكهة S2. (AC) يحلول في الخلية ذبابة الفاكهة S2. ممثل 1 مين يحلول النقل (المسمى مع 200 نيوتن متر Lysotracker) في خلية واحدة (A، مدينة دبي للإنترنت صورة) ممثلة الاصطناعي الزمانية-رمز (التي أنشأتها في فيجي) (B). السرعات التي تم الحصول عليها من تحليل حركة يحلول تتبع في عمليات (DiaTrack؛ 663 الجزيئات في خلايا 23) (C). حركة (DF) بيروكسية في الخلية ذبابة الفاكهة S2. ممثل 1 مين بيروكسية النقل (المسمى مع PMT-GFP-SKL) في خلية واحدة (D، مدينة دبي للإنترنت صورة) ممثلة الاصطناعي الزمانية-رمز (التي أنشأتها في فيجي) (E). السرعات التي تم الحصول عليها من تحليل حركة بيروكسية تتبع في عمليات (DiaTrack؛ 228 الجزيئات في خلايا 20) (F). نلاحظ أن الجسيمات الحالة التحرك مع مسارات أطول وأسرع من peroxisomes. شريط النطاق، 5 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الأولية من الثقافة بين عشية وضحاها. (أ) بين عشية وضحاها مثقف ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية لديها مورفولوجيا الخلايا العصبية مميزة مع neurites التي طويلة. (ب) أعرب الخلايا العصبية علامة عموم العصبية، Elav (الأحمر والأبيض في B في B '، DSHB، 7E8A10، 1:100) ومع neurites التي طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة (الأخضر والأبيض في B في B''، DM1α ، 1:1000). بار الحجم، 5 ميكرون. NK "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 5. النقل عضية في الخلايا العصبية مثقف ذبابة الفاكهة. (A) الميتوكوندريا في الخلايا العصبية مثقف ذبابة الفاكهة التي تميزت ميتو-GFP تحت سيطرة العصبون الحركي محددة المروج، D42. (A ') يتم تمثيل 5 دقائق الميتوكوندريا في حركة (A) من قبل الاصطناعي كود الزمانية اللون (التي أنشأتها في فيجي). (B) Peroxisomes في الخلايا العصبية مثقف ذبابة الفاكهة التي تميزت PAC-SKL-mCherry، حقنها في وقت مبكر المخلوي الأجنة مرحلة الأريمة. (B ') ويمثل 2 مين بيروكسية الحركة في (B) من قبل الاصطناعي كود الزمانية اللون (التي أنشأتها في فيجي). شريط النطاق، 5 ميكرون.ig5highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| عضية | وصف |
| Peroxisomes | Peroxisomal إشارة استهداف ثلاثي الببتيد 1 (SKL) الموسومة مع FP 25 |
| الميتوكوندريا | تسلسل استهداف الميتوكوندريا من السيتوكروم أوكسيديز ج الوحيدات الثامن الموسومة مع FP 26 |
| الميتوكوندريا | Mitotracker (صبغ الذي يتراكم في الميتوكوندريا النشطة) 27 |
| الجسيمات الحالة | Lysotracker (صبغ التي تتراكم في الخلاياالمقصورات الداخلية مع انخفاض درجة الحموضة) 28 |
الجدول 1. استراتيجيات التوسيم عضية الأكثر شيوعا.
يلخص هذا الجدول استراتيجيات التوسيم عضية الأكثر شيوعا في الخلايا زراعة الأنسجة، بما في ذلك وضع العلامات من peroxisomes، الميتوكوندريا، والجسيمات الحالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لدراسة نقل البضائع تعتمد على أنيبيب في الخلايا ذبابة الفاكهة S2 والثقافة الخلايا العصبية الأولية. كلتا العمليتين S2 وneurites التي هي هياكل يشغلها المجمعة الأنابيب الدقيقة المصفوفات التي تكون بمثابة مسارات للنقل عضية.
وعادة ما تستخدم استراتيجيتين لالعضيات التسمية: ترنسفكأيشن ناقلات ترميز بروتين فلوري مع تسلسل استهداف عضية أو تلطيخ مع الأصباغ الفلورية إضافتها مباشرة إلى الثقافات. يتم سرد الأمثلة الشائعة للتسميات البضائع في الجدول 1. ترنسفكأيشن عابرة أو العلاجات رني من خلايا ذبابة الفاكهة S2 إذا لزم الأمر تتم في التعليق 4،6،7،9،10 قبل ومطلي الخلايا coverslips على للتصوير.
من أجل الحصول على نتائج موثوقة في تجارب الخلايا S2، فمن المهم للحفاظ على النقاط التالية في الاعتبار:
- خلايا لوحة في كثافة الأمثل للتصوير. عالية دن سوف SITY يؤدي إلى تداخل العمليات من خلايا مختلفة، بينما في الخلايا منخفض الكثافة لديهم سوء الجدوى وغير قادرين على تشكيل العمليات.
- تسمح للخلايا S2 لتطوير العمليات تماما. نحن بشكل روتيني احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة بعد الطلاء ولكن الحضانة تصل إلى 24 ساعة يمكن أن يؤديها إذا لزم الأمر.
- يجب أن يعامل الخلايا S2 مع CytoD قبل أن نعلق على coverslips كونا المغلفة. واضاف ان المخدرات بعد تعلق الخلايا لا تحفز تشكيل العمليات.
- عند استخدام الأصباغ، وعينات التغيير لتصوير كل 20-25 دقيقة؛ حضانة طويلة الأجل من الخلايا مع إما Mitotracker أو Lysotracker هي سامة بالنسبة للخلايا.
- نحن عادة ما تعقب نقل البضائع في الخلايا S2 عن طريق التصوير لمدة 1 دقيقة في 1 إطار / ثانية. تحت هذا الشرط الخلايا ليست الصورة التي تضررت.
- فقط تحليل حركة عضية في عمليات الخلية. الكثافة عضية في خلايا الجسم مرتفعة جدا لتتبع موثوق بها والاستقطاب للحركة لا يمكن تحديد بسهولة.
الطبقة = "jove_content"> تم تعديل الخلايا العصبية الأولية الثقافة الإجراء إعداد ذبابة الفاكهة من البروتوكولات التي كتبها المختبر Mahowald 23 و 24 مختبر ليو. هذا البروتوكول يسمح لك للحصول على الثقافة الخلايا العصبية الأولية في غضون يوم وانها مستعدة للتصوير وتتبع في اليوم التالي.
في هذا البروتوكول، قد تحتاج إلى دفع الانتباه إلى عدة خطوات أساسية المدرجة أدناه:
- الأجنة المرحلة بشكل صحيح. تحتاج الأجنة التي تم جمعها لتكون متزامنة ونظموا لمراحل 9-11، عندما يحدث أرومة عصبية التبطين من الأديم الظاهر. تنظيم الأجنة في وقت مبكر جدا أو متأخرا جدا قد يؤدي إلى عدد أقل من neuroblasts في كل الجنين وبالتالي فشل الخلايا العصبية الحصاد من الأجنة فصلها.
- الأجنة Dechorionate إلى حد الحق (جميع الأجنة تغيير اللون من الأبيض تماما لأكثر شفافية). تحت dechorionation يمكن أن يؤدي إلى صعوبة في الجنين التفكك، في حين الإفراط dechorionation قد يضر الأجنة. ديسمبرالأجنة horionated تصبح لزجة جدا وناعمة، وبالتالي محاولة تجنب pipetting لأو لمس الأجنة مع نصائح ماصة خلال خطوات الغسيل قبل التفكك.
- إيلاء اهتمام خاص لأجنة التفكك. نجد أن المطاحن بيليه البلاستيك القابل للتصرف وmicrotubes مطابقة إعطاء التفكك أفضل من الخالط الزجاج dounce، خاصة بالنسبة للعدد صغير من الأجنة. تحت تفارق سيترك مجموعات الخلايا الكبيرة، في حين أن الإفراط في التفكك سيؤدي الى انهيار الخلايا وتراكم هائل من حطام خلية. ضبط مستوى التفكك وفقا لأرقام الجنين.
- طلاء الخلايا العصبية على ساترة الزجاج لكثافة معقولة. الخلايا العصبية المزدحمة عادة ما تتطور neurites التي قصيرة جدا، في حين غالبا ما تفشل الخلايا العصبية متناثر من أجل البقاء.
بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن الثقافات الخلية الأولية غالبا ما تحتوي على خلايا العضلات، وخلايا الدم. العلاج بين عشية وضحاها مع CytoD يساعد على تقليل عدد خلايا العضلات وخلايا الدم، وتعزيزق ثمرة neurite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر أعضاء المختبر غيلفاند الذين ساهموا في تطوير هذه البروتوكولات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01GM052111 لVIG والباسك وزارة التربية والتعليم الحكومة والجامعات والبحوث تحت رقم الجائزة BFI-2011-295 إلى الشركة المتحدة للتنمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
