Summary
Cellule di Drosophila S2 e neuroni in coltura sono grandi sistemi per l'imaging dei trasporti organello motorizzata in vivo. Qui si descrive protocolli dettagliati per la coltura di entrambi i tipi di cellule, la loro rappresentazione e analisi di trasporto.
Abstract
Cellule di Drosophila S2 placcato su un vetrino in presenza di lunghi processi ramificati forma farmaco-actina depolimerizzante pieni di microtubuli uniformemente polarizzati. Organelli si muovono lungo questi processi da motori microtubuli. Facilità di manutenzione, elevata sensibilità alla proteina RNAi mediato knock-down e procedure efficienti per la creazione di linee cellulari stabili rendere le cellule di Drosophila S2 un sistema modello ideale per studiare il trasporto merci con immagini dal vivo. I risultati ottenuti con le cellule S2 possono essere ulteriormente applicate a un sistema più fisiologicamente rilevanti: trasporto assonale nei neuroni primari in coltura da embrioni dissociate Drosophila. Neuroni in coltura crescono lunghi neuriti piene di microtubuli in bundle, molto simili ai processi S2. Come in cellule S2, organelli in neuroni in coltura possono essere visualizzate da entrambi i coloranti fluorescenti specifici per organelli o utilizzando marcatori fluorescenti organelli codificate dal DNA iniettato in embrioni precoci o espresse in transgenderic vola. Pertanto, il trasporto degli organelli può essere facilmente registrato in neuroni coltivati su vetrini utilizzando immagini viventi. Qui si descrivono le procedure per la coltura e la visualizzazione di trasporto merci in cellule di Drosophila S2 e neuroni primari. Noi crediamo che questi protocolli rendono entrambi i sistemi accessibili per i laboratori che studiano il trasporto merci.
Introduction
Cellule di Drosophila S2 hanno guadagnato crescente popolarità per studiare molti processi cellulari. Queste cellule sono stati originariamente ottenuti da trypsinized embrioni fase tardiva della OregonR Drosophila melanogaster e mantengono le caratteristiche macrofagi-like 1. Cellule di Drosophila S2 offrono molti vantaggi rispetto ad altre linee cellulari. Essi sono coltivate a 25 ° C senza CO 2, e possono essere esposte per molte ore a temperatura ambiente senza la necessità di riscaldamento o scambio di gas. Ancora più importante, le cellule di Drosophila S2 sono molto sensibili al trattamento RNAi permettendo alta efficienza knockdown di proteine di interesse. Cellule S2 sono altamente transfectable e linee cellulari stabili possono essere selezionati in meno di quattro settimane per permettere l'espressione ectopica stabile di proteine di interesse. Cellule S2 normalmente crescono sia liberamente associate, ma non si diffondono su un pallone o in sospensione. Essi possono essere indotti a diffondersi su vetrini rivestiti con una conca impianto lectinanavalin A (ConA). La periferia delle cellule spread è particolarmente sottile e quindi ideale per microscopia cellule vive. Protocolli dettagliati per coltura cellule S2, trattamento RNAi, imaging luce diretta e immunostaining possono essere trovati nel 2,3 letteratura. Il nostro laboratorio ha adottato le cellule S2 come sistema modello per studiare il trasporto merci basato microtubuli. Cellule di Drosophila S2 trattate con farmaci che depolimerizza o recide F-actina, come citocalasina D (CytoD), crescono lunghi processi pieni di microtubuli uniformemente polarizzati 4 -10, che lo rende un sistema ideale per studiare il movimento del carico lungo array microtubuli. Diversi parametri di trasporto in questi processi. (Cioè traiettorie lunghezze, velocità, direzionalità ecc) possono essere facilmente misurate utilizzando software particella di monitoraggio automatico, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Queste caratteristiche rendono le cellule S2 di un sistema interessante per studiare il trasporto di merci lungo i microtubuli in cellule di coltura di tessuti.
Esperienze pilota in cellule S2 può essere esteso ad un modello fisiologicamente importante di studi trasporto merci in Drosophila neuroni primari. Simili alle cellule S2, colture di neuroni da embrioni dissociate sono permeabili a piccole molecole come coloranti e inibitori, e immagini ad alta risoluzione in tempo reale di trasporto organello possono essere eseguite in neuroni a temperatura ambiente. Utilizzo di Drosophila con differenti background genetico, possiamo esaminare la funzione dei geni nei neuroni primari per KO (mutazioni genetiche perdita-di-funzione), knockdown (dsRNA iniezione o espressione) o espressione ectopica (mosche transgeniche). In particolare, la frammentazione dei filamenti di actina mediante trattamento CytoD non impedisce crescita dei neuriti, invece crescono più velocemente, e quindi possiamo studiare microtubuli dependent trasporto organello nei neuroni CytoD trattati senza l'influenza di actina Filamenti 11. Pertanto, colture neuronali primarie uniscono i vantaggi delle cellule di coltura di tessuti e volano genetica, che lo rende un ottimo sistema per studiare il trasporto di merci in un sistema fisiologico rilevante 10,12. Dal momento che diverse malattie neurodegenerative familiari potrebbero essere causati da o associate a difetti di trasporto merci (ad esempio, malattia di Parkinson 13, la malattia di Huntington 14, Morbo di Alzheimer 15,16, la Sclerosi Laterale Amiotrofica / ALS 17, HMN7B e Perry sindrome 18,19, e atassia spinocerebellare di tipo 5/SCA5 20), colture neuronali primarie possono essere utili per l'analisi degli effetti di mutazioni specifiche che causano queste malattie sul trasporto microtubuli-dipendente.
Infine, importanti proprietà di trasporto microtubuli-dipendente sono ben conservati tra i mammiferi e le mosche, ma
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Protocol
1. Cellule di Drosophila S2
Preparazione di vetrini ConA rivestiti
- Mettere coprioggetto in un rack ceramica e lavarli per immersione acido cromico per 1 ora. [ATTENZIONE: acido cromico è corrosivo e può causare irritazione di occhi, naso, gola e pelle].
- Sciacquare accuratamente con coprioggetto costantemente in esecuzione dH 2 O per 30 minuti fino a quando l'acido è completamente lavato fuori.
- Lasciare asciugare all'aria coprioggetto e cappotto con ConA (soluzione 0,5 mg / ml di dH 2 O) per 30 minuti.
- Sciacquare coprioggetto con dH 2 O per 15 minuti e lasciarli asciugare all'aria. Coprioggetto ConA rivestiti possono essere memorizzati fino a 1 mese.
Placcatura le cellule
- Consentono alle cellule S2 di crescere in modo esponenziale T25 o T75 cm 2 palloni a seconda del numero di cellule necessario per l'esperimento.
- Contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di crescita medium (per esempio Insect-Xpress) in un piatto di 35 millimetri di tessuto cultura con coprioggetto ConA rivestite, e delicatamente trasferire ~ 1 x 10 5 cellule al piatto. Questa densità cellulare è ottimale per l'imaging perché i processi di celle diverse non si sovrappongano.
- Al fine di indurre la formazione di processi, subito dopo la placcatura aggiungi medio 1ml con 5 mM CytoD al piatto (alla concentrazione finale di 2,5 mM CytoD). Consentire il completo sviluppo di processi incubando le cellule per almeno 2 ore a 25 ° C prima di imaging.
2. Drosophila primaria Neuron Cultura
Preparazione per la cultura neurone
- Preparare Drosophila mezzo di crescita neuronale (media di Schneider supplementato con siero: 20% fetale bovino, inattivati termicamente a 55 ° C per 30 min; 5 mcg / insulina ml; 100 pg / ml di penicillina, 100 mg / streptomicina ml; 10 mcg / tetraciclina ml) . Questo supmezzo di pre realizzate Schneider può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi.
- Preparare fiale succo di mela agar per la raccolta di Drosophila embrioni (22,5 g di agar, 12,0 g di saccarosio e 750 ml di H 2 O in un pallone da 2 litri, autoclave per 20-25 minuti, aggiungere 250 ml di succo di mela e versare ~ 10 ml in ogni Drosophila fiala, dopo la solidificazione, collegare fiale con batuffoli di cotone, e avvolgere fiale con pellicola di plastica per alimenti per evitare di essiccazione del cibo). Il succo di mela in flaconcini di agar può essere conservato a 4 ° C in sacchetti di plastica ben chiusi per 4 settimane.
- Cappotto lavata con acido 25 millimetri coprioggetto cerchio con ConA (vedi dettagli nel protocollo per le cellule di Drosophila S2) e sterilizzare sotto la luce UV per 10-15 min. Questi vetrini possono essere conservati per un mese.
Drosophila cultura neuroni embrionali
- Mantenere giovane adulto vola in fiale di succo di mela agar addizionato con lievito secco per 1-2 giorni prima di raccogliere embrioni fo la preparazione neurone.
- Il giorno di raccolta, al fine di sincronizzare gli embrioni raccolti, il trasferimento adulto vola a una mela fresco succo di agar fiala per 1 ora Precollection in luce e scartare questi embrioni.
- Trasferimento vola a un nuovo flacone succo di mela agar, raccogliere embrioni per 1 ora, e trasferire le mosche per un altro flacone per un'altra ora, sia nel buio per aumentare la resa embrione.
- Rimuovere le mosche adulte dal succo di mela agar flacone e lasciare che gli embrioni si sviluppano altri 4 ore a 9-11 fasi a temperatura ambiente (4-6 embrioni hr-old sono tra palco 9-11).
- Rimuovere gli embrioni spruzzando acqua in fiale e allentando gli embrioni dal succo di agar mela con un pennello piccolo (almeno 10 embrioni sono necessari per una buona neurone prep).
- Trasferire gli embrioni a 100 micron maglia di nylon filtro cella con una pipetta di trasferimento per drenare l'acqua (Prerisciacquare la pipetta di trasferimento in Drosophila tampone di lavaggio embrione, 0.4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Raccogliere gli embrioni dal filtro con un piccolo pennello, e trasferirli in una provetta da 1,5 ml riempita con 1 ml di Drosophila embrione di lavaggio (Nota: pulire le fibre di agar o di cotone utilizzando il pennello o puntali delle pipette). In questo protocollo, provetta da 1,5 ml dotato di un pellet usa e getta pestello di corrispondenza.
- Lavare gli embrioni in Drosophila embrione lavaggio 3x.
- Dechorionate gli embrioni in una soluzione fresca 1:01 di candeggina commerciale e il 95% di etanolo per 10 minuti [ATTENZIONE: candeggina può causare irritazione a occhi, naso, gola e pelle].
- Passare alla cappa coltura tissutale, e lavare gli embrioni 2x integrato nel mezzo di Schneider.
- Lascia 200-300 microlitri di media nel tubo con gli embrioni, e delicatamente dissociare meccanicamente embrioni dechorionated utilizzando Kimble Chase pestelli pellet usa e getta che sono stati sterilizzati del 70% di etanolo (macinare 10-15x).
- Centrifugare la miscela omogeneizzata a 20 xg per 2 minuti, e TRAnsfer il surnatante in una nuova provetta. [Questo passaggio è opzionale, aiuta a rimuovere i detriti embrione]
- Centrifugare il surnatante a 550 xg per 2 minuti a pellet cellule.
- Risospendere il pellet in 500 ml integrati cellule medie e di spin di Schneider giù di nuovo a 550 xg per 2 minuti, ripetere il ciclo di risospensione filatura volta.
- Infine risospendere il pellet in ~ 100 ml, completata medio di Schneider e piastra le cellule su un vetrino ConA rivestito 25 millimetri in una sterile 35 millimetri piastra di Petri. Incubare per 10 min per permettere l'adesione delle cellule.
- Aggiungere 2 ml di terreno integrato di Schneider, con 5 micron CytoD per immergere il vetrino con le cellule attaccate.
- Incubare il piatto in un umidificata 25 ° C incubatore notte prima di imaging.
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Representative Results
Cellule di Drosophila S2 attaccate sulla diffusione vetrino ConA rivestite in un piatto rotondo di forma "pancake" (Figure 1A e 1C). Tuttavia, quando le cellule S2 piastrate su vetrini in presenza di CytoD e propagate per 2-3 ore, formano processi sottili lunghi riempito dal microtubuli parallele (Figure 1B e 1D). Questi microtubuli hanno polarità uniforme con più-termina fuori 7. Time-lapse imaging di fluorescenza di Drosophila S2 esprimono stabilmente mCherry-tubulina mostra che i processi sono molto dinamici, specialmente durante i primi 60 minuti dopo il collegamento (Figura 2). Dopo 1 ora di incubazione, la crescita rallenta e 2-3 ore di incubazione assicura che la maggioranza delle cellule sono completamente processi cresciuti. Qui vi mostriamo due esempi rappresentativi di trasporto degli organelli lungo i microtubuli in cellule S2, lisosomi (etichettati con LysoTracker, 200 nm Figure 3A-B 7 (trasfezione stabile con PAC-GFP-SKL, figure 3D-E). Immagini time-lapse delle cellule sono state prese ogni 1 secondo per 61 fotogrammi utilizzando un microscopio invertito Nikon TU-2000 dotato di un sistema di messa a fuoco perfetta (Nikon) e la fotocamera CoolSnap CCD (Roper scientifico) guidato da software Metamorph. Una sorgente luminosa alogena da 100 W è stato utilizzato per l'eccitazione di fluorescenza per minimizzare photobleaching e fototossicità. Ciascuno dei 61 fotogrammi in sequenza è colore codificato secondo la barra in alto a destra e le immagini sono state sovrapposte per generare tracce colorate. Particelle così in movimento generate brani arcobaleno, mentre le particelle stazionarie apparso bianco 10. ImageJ plug-in temporale Color-Code ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) è stato utilizzato per questa elaborazione. Per l'analisi quantitativa del movimento organello abbiamo utilizzato software DiaTrack (Semasopht Inc.), selezioniamo soloorganelli che sono localizzati nei processi perché possono essere facilmente monitorati e la polarità delle tracce microtubuli è noto. Figure 3C e 3F mostrano distribuzioni tipiche di velocità retrograda e anterograda ottenuti dai lisosomi e dei perossisomi inseguimento, rispettivamente.
Tecniche simili sono utilizzate nel nostro laboratorio per l'analisi del trasporto organello in neuroni in coltura primaria. I neuroni sono un tipo cellulare predominante in colture miste ottenuti dallo stadio 9-11 embrioni. Dopo la coltura overnight sono facili da riconoscere per la forma delle cellule caratteristico con neuriti che sono più di 50 micron di lunghezza (Figura 4A). Queste cellule sono anche positive per il marcatore pan-neuronale, Elav 21 (Figure 4B e 4B '). Processi nei neuroni sono pieni di microtubuli (figure 4B e 4B "). Possiamo tracciare il trasporto degli organelli lungo i neuriti con il TEchniques descritte sopra per le cellule S2. I mitocondri possono essere etichettati con GFP mitocondriale (Mito-GFP) sotto il controllo di un motore specifico neurone promotore D42 22 (Figure 5A e 5A '), e perossisomi possono essere contrassegnati mediante iniezione di DNA codificante un perossisomi mirati mCherry 7, in sinciziale embrioni stadio blastoderm (figure 5B e 5B »).
Formazione della figura 1. Drosophila S2 processo indotto dalla CytoD. Cellule (A, C) Drosophila S2 allegare e diffondere in forme appiattire e rotonde quando placcato in coprioggetto ConA-prerivestite. Cellule (B, D) S2 placcati in presenza di 2,5 micron CytoD formano lunghi processi pieni di microtubuli dopo 3 ore di incubazione. <strong> AB e CD sono trasmessi luce e le immagini tubulina mCherry-tag fluorescenti, rispettivamente. Barra della scala, 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Time lapse dei processi di crescita in una cella Drosophila S2. Fluorescenza time-lapse di una cellula di Drosophila S2 esprimere mCherry-tubulina in presenza di 2,5 mM CytoD. I numeri indicano il tempo dopo la cella allegare alla vetrino. Barra della scala, 5 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Trasporto movimento Organelle in cellule di Drosophila S2. (AC) Lisosoma in cellule di Drosophila S2. Un rappresentante 1 min-lisosoma trasporto (marcato con 200 nM Lysotracker) in una cella (A, l'immagine DIC) rappresentato dalla Temporal-Code artificiale (creato da FIJI) (B). Le velocità ottenuti dall'analisi dei movimenti lisosomi rintracciato nei processi (DiaTrack; 663 particelle in 23 celle) (C). Movimento (DF) Peroxisome nella cella Drosophila S2. Un rappresentante 1 min-perossisomi trasporto (marcato con PMT-GFP-SKL) in una cella (D, l'immagine DIC) rappresentato dalla Temporal-Code artificiale (creato da FIJI) (E). Le velocità ottenuti dall'analisi dei movimenti dei perossisomi rintracciato nei processi (DiaTrack; 228 particelle in 20 celle) (F). Si noti che i lisosomi si muovono con traiettorie più lunghe e più veloce di perossisomi. Barra della scala, 5 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Primary Drosophila neuroni della cultura durante la notte. (A) Un pernottamento in coltura di Drosophila neurone ha caratteristica morfologia neuronale con lunghi neuriti. (B) Il neurone ha espresso un marcatore pan-neuronale, Elav (rosso in B e bianco in B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) e con lunghe neuriti piene di microtubuli (verdi in B e bianco in B'', DM1α , 1:1000). Scale Bar, 5 micron. nk "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 5. Trasporto organello in colture di neuroni Drosophila. (A) mitocondri in un neurone Drosophila colta segnata da Mito-GFP sotto il controllo di un motore neurone-specifica promotore, D42. (A ') 5 min-movimento mitocondriale in (A) è rappresentato dal codice temporale-Color artificiale (creato da FIJI). (B) perossisomi in un neurone Drosophila colta segnata da Pac-SKL-mCherry, iniettate in embrioni precoci sinciziale fase blastoderm. (B ') 2 min-perossisomi movimento (B) è rappresentato dal codice temporale-Color artificiale (creato da FIJI). Barra della scala, 5 micron.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Organello | Descrizione |
| Perossisomi | Peroxisomal segnale di targeting 1 tripeptide (SKL) contrassegnati con un FP 25 |
| I mitocondri | Mitocondriale sequenza di targeting del citocromo c ossidasi subunità VIII etichettato con un FP 26 |
| I mitocondri | Mitotracker (Dye che si accumula nei mitocondri attiva) 27 |
| Lisosomi | Lysotracker (Dye che si accumula nelle cellulescomparti con basso pH interno) 28 |
Tabella 1. Strategie in materia di etichettatura degli organelli più comuni.
Questa tabella riassume le strategie in materia di etichettatura organello più comuni nelle cellule di coltura di tessuti, tra cui l'etichettatura dei perossisomi, mitocondri e lisosomi.
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Discussion
Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per studiare il trasporto di merci microtubuli-dipendente in cellule di Drosophila S2 e la cultura neurone primario. Entrambi i processi S2 e neuriti sono strutture riempito dal bundle microtubuli matrici che fungono da binari per il trasporto degli organelli.
Due strategie sono tipicamente utilizzati per organelli etichetta: trasfezione di vettori che codificano una proteina fluorescente con una sequenza-organello il targeting o la colorazione con coloranti fluorescenti aggiunti direttamente alle culture. Esempi comuni di etichette carico sono elencati nella Tabella 1. Trasfezione transiente o trattamenti RNAi di cellule di Drosophila S2, se necessario, viene eseguita in sospensione 4,6,7,9,10 prima che le cellule sono placcati su vetrini per l'imaging.
Al fine di ottenere risultati affidabili in esperimenti sulle cellule S2, è importante tenere presente i seguenti punti:
- Cellule piastra a densità ottimale per l'imaging. Alta density comporterà sovrapposizione dei processi in celle diverse, mentre le celle a bassa densità hanno scarsa vitalità e sono in grado di formare processi.
- Consentono alle cellule S2 di sviluppare completamente i processi. Noi abitualmente Incubare le cellule per 2 ore dopo la placcatura, ma l'incubazione fino a 24 ore può essere effettuata, se necessario.
- Cellule S2 devono essere trattati con CytoD prima che essi attribuiscono al vetrini ConA rivestiti. Aggiungendo il farmaco dopo che le cellule sono collegati non indurre la formazione di processi.
- Quando si utilizzano coloranti, cambiare, i campioni per l'imaging ogni 20-25 min; incubazione a lungo termine delle cellule sia con Mitotracker o Lysotracker è tossico per le cellule.
- Noi di solito traccia trasporto merci in cellule S2 da imaging per 1 min a 1 frame / sec. In questa condizione le cellule non sono foto-danneggiate.
- Analizzare il movimento organello solo nei processi cellulari. Densità organello nel corpo cellulare è troppo alta per il monitoraggio affidabile e polarità del movimento non possono essere determinate facilmente.
In questo protocollo, potrebbe essere necessario pagare attenzioni di diversi passaggi chiave elencati di seguito:
- Embrioni correttamente stage. Gli embrioni raccolti devono essere sincronizzati e messo in scena alle fasi 9-11, quando si verifica neuroblast delaminazione dall'ectoderma. Messa in scena embrioni troppo presto o troppo tardi può causare un minor numero di neuroblasti in ogni embrione, e quindi il fallimento dei neuroni di raccolta di embrioni dissociate.
- Embrioni Dechorionate nella misura giusta (tutti gli embrioni cambiano colore da bianco a completamente trasparente). Under-dechorionation potrebbe portare a difficoltà in embrione dissociazione, mentre oltre-dechorionation potrebbero danneggiare gli embrioni. Dicembreembrioni horionated diventano molto appiccicoso e morbido, quindi cercano di evitare pipettaggio o di toccare gli embrioni con le punte delle pipette durante le fasi di lavaggio prima della dissociazione.
- Prestare particolare attenzione agli embrioni dissociazione. Troviamo che di plastica pestelli pellet usa e getta e microtubi corrispondenza dare una migliore dissociazione di un omogeneizzatore Dounce vetro, soprattutto per piccolo numero di embrioni. Under-dissociazione lascerà grandi gruppi di cellule, mentre oltre-dissociazione porterà alla rottura delle cellule e massiccio accumulo di detriti cellulari. Regolare il livello di dissociazione secondo i numeri embrione.
- Placcatura neurone sul vetrino di vetro per una densità ragionevole. Affollato neuroni si sviluppano di solito molto brevi neuriti, mentre i neuroni sparsi spesso non riescono a sopravvivere.
Inoltre, abbiamo notato che le colture cellulari primarie spesso contengono cellule muscolari e le cellule del sangue. Trattamento notte con CytoD aiuta a ridurre il numero di cellule muscolari e cellule del sangue, e promuoveres crescita dei neuriti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Gelfand che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Science del National Institutes of Health con il numero aggiudicazione R01GM052111 di VIG e basco Government Department of Education, dell'Università e della Ricerca con il numero award BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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