Summary
Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.
Abstract
Drosophila S2 cellen op een dekglaasje in aanwezigheid van een actine-depolymeriseren geneesmiddelvorm lange onvertakte werkwijzen vol uniform gepolariseerd microtubuli. Organellen bewegen langs deze processen microtubule motoren. Gemakkelijk onderhoud, hoge gevoeligheid voor RNAi-gemedieerde proteïne knock-down en efficiënte procedure voor het maken van stabiele cellijnen Drosophila S2 cellen ideale modelsysteem vrachtvervoer bestuderen door levende beeldvorming. De met S2 cellen resultaten kunnen verder worden aangebracht op een fysiologisch relevante systeem: axonaal transport in primaire neuronen gekweekt uit gedissocieerde Drosophila embryo. Gekweekte neuronen groeien lange neurites gevuld met gebundelde microtubuli, zeer vergelijkbaar met S2 processen. Zoals in S2-cellen, organellen in gekweekte neuronen kan worden gevisualiseerd door een organel-specifieke fluorescente kleurstoffen of met fluorescente merkers organel gecodeerd door DNA geïnjecteerd in vroege embryo's of uitgedrukt in transgeneic vliegt. Daarom kan organel transport eenvoudig worden opgenomen in neuronen gekweekt op dekglaasjes met levende beeldvorming. Hier beschrijven we de procedures voor het kweken en visualiseren van het vrachtvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuronen. Wij geloven dat deze protocollen maken beide systemen toegankelijk voor laboratoria bestuderen vrachtvervoer.
Introduction
Drosophila S2 cellen hebben opgedaan toenemende populariteit voor het bestuderen van vele cellulaire processen. Deze cellen werden oorspronkelijk verkregen van getrypsineerd laat stadium embryo's van OregonR Drosophila melanogaster en onderhouden van macrofaag-achtige functies 1. Drosophila S2 cellen bieden vele voordelen ten opzichte van andere cellijnen. Ze worden gekweekt bij 25 ° C zonder CO2 en kunnen worden afgebeeld vele uren bij kamertemperatuur zonder verwarming of gasuitwisseling. Belangrijker Drosophila S2 cellen zijn zeer gevoelig voor RNAi behandeling waardoor hoge rendement knockdown van eiwitten van belang. S2-cellen zijn zeer transfecteerbare en stabiele cellijnen kunnen worden geselecteerd in minder dan vier weken stabiele ectopische expressie van eiwitten van belang mogelijk. S2 cellen normaal te laten groeien ofwel losjes verbonden, maar niet verspreid op een fles of in suspensie. Ze kunnen worden geïnduceerd te verspreiden op dekglaasjes van tevoren met een plant lectine Concanavalin A (ConA). De omtrek van de verspreiding cellen is bijzonder dun en daarom ideaal voor levende cel microscopie. Gedetailleerde protocollen voor S2 cellen cultuur, RNAi behandeling, levende licht beeldvorming en immunostaining kan worden gevonden in de literatuur 2,3. Ons laboratorium heeft S2 cellen aangenomen als een modelsysteem voor de microtubuli-gebaseerde vrachtvervoer bestuderen. Drosophila S2 cellen behandeld met een geneesmiddel dat depolymeriseert of verbreekt F-actine, zoals cytochalasine D (CytoD), groeien lange processen gevuld met uniform gepolariseerde microtubuli 4 -10, waardoor het een ideaal systeem om lading beweging bestudeerd langs microtubuli arrays maakt. Verschillende parameters van transport in deze processen (. Dwz trajecten lengte, snelheden, richtinggevoeligheid enz.) kan gemakkelijk worden gemeten met behulp van geautomatiseerde deeltje tracking software, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Deze eigenschappen maken S2 cellen een aantrekkelijk systeem voor het bestuderen van vrachtvervoer langs microtubuli in weefselkweek cellen.
Proefprojecten in S2 cellen kunnen worden uitgebreid tot een fysiologisch belangrijk model van studies vrachtvervoer in Drosophila primaire neuronen. Net als S2-cellen, neuronen gekweekt uit gedissocieerde embryo's permeabel voor kleine moleculen zoals kleurstoffen en inhibitoren en hoge-resolutie beeldvorming van levende organel transport kan worden uitgevoerd in neuronen bij kamertemperatuur. Met behulp van Drosophila met verschillende genetische achtergronden, kunnen we gen-functie onderzoeken in primaire neuronen door knock-out (genetische verlies-van-functie mutaties), knock-down (dsRNA injectie of expressie) of ectopische expressie (transgene vliegen). Concreet betekent versnippering van actine filamenten gebruik CytoD behandeling belet niet dat neurietuitgroei, in plaats daarvan sneller groeien ze, en dus kunnen we bestuderen microtubuli-dependent organel transport in CytoD behandelde neuronen zonder de invloed van actine filamenten 11. Daarom primaire neuronale culturen combineren de voordelen van weefselkweek cellen en vliegen genetica, waardoor het een geweldig systeem om vrachtvervoer studeren in een fysiologisch relevante systeem 10,12 maakt. Sinds enkele familiale neurodegeneratieve ziekten kunnen worden veroorzaakt door of in verband met gebreken vracht vervoer (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson 13, de ziekte van Huntington 14, Ziekte van Alzheimer 15,16, amyotrofische laterale sclerose / ALS 17 HMN7B en Perry syndroom 18,19 en Spinocerebellaire soort ataxie 5/SCA5 20), kan de primaire neuronale culturen bruikbaar in de analyse van de effecten van specifieke mutaties veroorzaken deze ziekten voor de microtubuli-afhankelijke vervoer.
Tenslotte worden belangrijke eigenschappen van microtubuli-afhankelijk transport goed geconserveerd tussen zoogdieren en vliegen, maar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila S2 cellen
Bereiding van ConA beklede dekglaasjes
- Plaats dekglaasjes in een keramische rek en wassen met chroomzuur onderdompeling gedurende 1 uur. [LET OP: chroomzuur is bijtend en kan irritatie van ogen, neus, keel en huid veroorzaken].
- Spoel coverslips grondig met constant lopende dH 2 O gedurende 30 min, totdat het zuur volledig wordt uitgewassen.
- Laat dekglaasjes drogen en coaten met ConA (0,5 mg / ml oplossing dH 2 O) gedurende 30 minuten.
- Spoel coverslips met dH 2 O gedurende 15 minuten en laat ze drogen. ConA gecoate dekglaasjes kan worden opgeslagen tot 1 maand.
Plating de cellen
- Laat S2 cellen exponentieel groeien in T25 of T75 cm2 kolven afhankelijk van het aantal cellen die voor het experiment.
- Tel de cel dichtheid met behulp van een hemocytometer. 1 Voeg groei ml medium (bijvoorbeeld Insect-Xpress) in een 35 mm weefselkweek schotel met ConA-gecoate dekglaasje, en zachtjes te dragen ~ 1 x 10 5 cellen aan het gerecht. De celdichtheid is optimaal voor beeldvorming omdat processen van verschillende cellen niet overlappen.
- Om vorming van processen induceren onmiddellijk na plating toevoegen 1 ml medium met 5 uM CytoD de schaal (de uiteindelijke concentratie van 2,5 uM CytoD). Laat volledige ontwikkeling van processen incuberen van de cellen gedurende tenminste 2 uur bij 25 ° C voor de beeldvorming.
2. Drosophila Primaire Neuron Cultuur
Voorbereiding voor neuron cultuur
- Bereid Drosophila neuronale kweekmedium (Schneider's medium aangevuld met 20% foetaal runderserum, hitte geïnactiveerd bij 55 ° C gedurende 30 min, 5 ug / ml insuline, 100 ug / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 10 ug / ml tetracycline) . Dit supvuld Schneider medium kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 6 maanden.
- Bereid appelsap agar flacons voor het verzamelen van Drosophila embryo's (22,5 g agar, 12,0 g sucrose en 750 ml H 2 O in een 2-liter kolf; autoclaaf gedurende 20-25 minuten, voeg 250 ml appelsap en giet ~ 10 ml in elk Drosophila flacon, na het stollen, plug flesjes met katoenen ballen, en wikkel flesjes met plastic huishoudfolie om te voorkomen dat het drogen van het voedsel). De appelsap in agar flacons kunnen bij 4 ° C worden bewaard in goed afgesloten plastic zakken voor 4 weken.
- Coat-zuur gewassen 25 mm cirkel dekglaasjes met ConA (zie details in het protocol voor Drosophila S2 cellen) en steriliseer ze onder UV-licht gedurende 10-15 minuten. Deze dekglaasjes worden bewaard maand.
Drosophila embryonale neuron cultuur
- Houd jonge volwassen vliegen in appelsap agar flacons aangevuld met droge gist voor 1-2 dagen voor het verzamelen van f embryoof neuron voorbereiding.
- Op de dag verzamelen, om de verzamelde embryo synchroniseren, volwassen vliegen een frisse appelsap agar flacon 1 uur spermawinning licht en gooi deze embryo.
- Transfer vliegt in nieuw appelsap agar flacon verzamelen embryo gedurende 1 uur, en breng de vliegen naar een andere flacon nog een uur, zowel donker naar het embryo opbrengst te verhogen.
- Verwijder de volwassen vliegen uit de appelsap agar flesje en laat de embryo's ontwikkelen nog eens 4 uur te trappen 9-11 bij kamertemperatuur (4-6 uur-oude embryo's zijn tussen fase 9-11).
- Verwijder de embryo's door spuiten water in flesjes en losmaken van de embryo's uit de appelsap agar met een klein penseel (minstens 10 embryo's nodig zijn voor een goede neuron prep).
- Breng de embryo's om een 100 um nylon mesh cel zeef met een transfer pipet om water af te voeren (voorspoeling de transferpipet in Drosophila embryo wasbuffer, 0,4% NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Het verzamelen van de embryo's uit de zeef met behulp van een klein penseel en breng ze in een 1,5 ml microbuisjes gevuld met 1 ml Drosophila embryo wassen (Opmerking: reinig alle agar of katoenvezels met de kwast of pipet tips). In dit protocol, de 1,5 ml microbuisjes geleverd met een bijpassende disposable pellet stamper.
- Was de embryo's in Drosophila embryo wassen 3x.
- Dechorionate de embryo's in een frisse 01:01 oplossing van commerciële bleekwater en 95% ethanol gedurende 10 min [LET OP: bleekmiddel kan irritatie van ogen, neus, keel en huid veroorzaken].
- Ga naar de weefselkweek kap, en was embryo 2x in aangevuld Schneider medium.
- Verlaat 200-300 ul medium in de buis met de embryo's, en voorzichtig mechanisch distantiëren dechorionated embryo's met behulp van Kimble Chase wegwerp pellet stampers die zijn gesteriliseerd met 70% ethanol (grind 10-15x).
- Centrifugeer het gehomogeniseerde mengsel bij 20 g gedurende 2 min en transfer het supernatant naar een nieuwe buis. [Deze stap is optioneel, het helpt om embryo vuil te verwijderen]
- Centrifugeer het supernatant bij 550 xg gedurende 2 minuten om cellen te pelleteren.
- Resuspendeer de pellet in 500 pi aangevuld Schneider medium en spin-cellen weer neer op 550 xg gedurende 2 minuten, herhaal de resuspensie-spinnen cyclus eenmaal.
- Eindelijk resuspendeer de pellet in ~ 100 pi aangevuld Schneider medium en de plaat de cellen op een 25 mm ConA-gecoate dekglaasje in een steriele 35 mm petrischaal. Incubeer gedurende 10 min celbinding mogelijk.
- Voeg 2 ml aangevuld Schneider medium, met 5 uM CytoD aan het dekglaasje dompelen met aangehechte cellen.
- Incubeer de schotel in een vochtige 25 ° C incubator 's nachts voor de beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila S2 cellen bevestigd aan de ConA-gecoate dekglaasje uitgespreid in een platte ronde "pannenkoek"-vorm (figuren 1A en 1C). Wanneer S2 cellen op dekglaasjes in aanwezigheid van CytoD en mogen verspreiden 2-3 uur, vormen ze lange dunne processen voorzien door parallelle microtubuli (Figuren 1B en 1D). Deze microtubuli hebben een uniforme polariteit met plus-ends uit 7. Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Drosophila S2 stabiel tot expressie mCherry-tubuline blijkt dat processen zijn zeer dynamisch, vooral tijdens de eerste 60 minuten na de beslaglegging (figuur 2). Na 1 uur incubatie, hun groei vertraagt en 2-3 uur incubatie zorgt ervoor dat de meerderheid van de cellen volledig zijn gegroeid processen. Hier laten we twee representatieve voorbeelden van organel transport langs microtubuli in S2 cellen, lysosomen (gelabeld met Lysotracker, 200 nM, Figuren 3A-B 7 (stabiele transfectie met pac-GFP-SKL; figuren 3D-E). Time-lapse beelden van de cellen werden genomen om de 1 sec voor 61 frames met een Nikon TU-2000 omgekeerde microscoop uitgerust met een Perfect Focus systeem (Nikon) en Coolsnap CCD-camera (Roper Scientific) gedreven door Metamorph software. Een 100-W halogeen lichtbron werd gebruikt voor fluorescentie excitatie te fotobleken en fototoxiciteit minimaliseren. Elk van de 61 frames in de juiste volgorde is kleur gecodeerd volgens de balk aan de rechterkant en beelden werden gelegd om kleurgecodeerde tracks genereren bovenste. Zo bewegende deeltjes gegenereerd regenboog tracks, terwijl stilstaande deeltjes verschenen wit 10. ImageJ plug-in Temporal Color-Code ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) werd gebruikt voor deze verwerking. Voor de kwantitatieve analyse van organel beweging die we gebruikt DiaTrack software (Semasopht Inc), selecteren we alleenorganellen die gelocaliseerd zijn in processen omdat zij gemakkelijk kunnen worden gevolgd en de polariteit van microtubule titels bekend. figuren 3C en 3F tonen typische verdeling van retrograde en anterograde snelheden verkregen door lysosomen en peroxisomen volgen respectievelijk.
Vergelijkbare technieken worden gebruikt in ons lab voor analyse van organel vervoer in primaire gekweekte neuronen. Neuronen zijn een overheersende celtype in gemengde culturen verkregen uit fase 9-11 embryo's. Na een nacht kweken ze zijn gemakkelijk te herkennen aan karakteristieke cel vorm met neurites die ouder zijn dan 50 micrometer lang (Figuur 4A). Deze cellen zijn ook positief voor de pan-neuronale marker, Elav 21 (Figuren 4B en 4B). Processen in de neuronen zijn gevuld met microtubuli (Figuren 4B en 4B "). We organel transport spoor langs de neurieten met de techniques hierboven voor S2-cellen. Mitochondriën kan met mitochondriale GFP (Mito-GFP) onder controle van een motor neuron-specifieke promotor D42 22 (figuren 5A en 5A ') worden geëtiketteerd, en peroxisomen kan worden gemarkeerd door injectie van DNA dat codeert voor een-peroxisomen gerichte mCherry 7, in syncytieel blastoderm stadium embryo's (Figuren 5B en 5B).
Figuur 1. Drosophila S2 proces geïnduceerd door CytoD. (A, C) Drosophila S2 cellen hechten en verspreid in plat en ronde vormen wanneer plated in ConA-voorbeklede dekglaasjes. (B, D) S2-cellen uitgeplaat in de aanwezigheid van 2,5 urn CytoD vormen lange uitlopers gevuld met microtubuli na 3 uur incubatie. <strong> AB en CD worden doorgelaten licht en tl-mCherry gelabeld tubuline beelden, respectievelijk. Schaal bar, 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Tijdspanne van processen groei in een Drosophila S2 cel. Fluorescentie time-lapse van een Drosophila S2 cel die mCherry-tubuline in aanwezigheid van 2,5 uM CytoD. De cijfers geven de tijd na de cellen hechten aan het dekglaasje. Schaal bar, 5 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Organel transport in Drosophila S2 cellen. (AC) Lysosome beweging in Drosophila S2 cel. Een representatieve 1 min-lysosoom transport (gelabeld met 200 nM Lysotracker) in een cel (A, DIC beeld) weergegeven door de kunstmatige Temporal-Code (door FIJI) (B). Snelheden die bij de analyse van lysosoom beweging bijgehouden in processen (DiaTrack, 663 deeltjes in 23 cellen) (C). (DF) Peroxisome beweging in Drosophila S2 cel. Een representatieve 1 min-peroxisomen transport (gelabeld met pMT-GFP-SKL) in een cel (D, stock DIC) weergegeven door de kunstmatige Temporal-Code (door FIJI) (E). Snelheden die bij de analyse van peroxisoom beweging bijgehouden in processen (DiaTrack, 228 deeltjes in 20 cellen) (F). Merk op dat lysosomen verplaatsen met langere en snellere trajecten dan peroxisomen. Schaal bar, 5 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Primaire Drosophila neuronen uit ovemachtkweek. (A) Een overnachting gekweekte Drosophila neuron heeft een karakteristiek neuronale morfologie met lange neurites. (B) De neuron uitgedrukt een pan-neuronale marker, Elav (rood in B en wit in B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) en met lange neurites gevuld met microtubuli (groen in B en wit in B'', DM1α , 1:1000). Schaal Bar, 5 micrometer. nk "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Organel transport in gekweekte Drosophila neuronen. (A) Mitochondria in gekweekte Drosophila neuron gekenmerkt door Mito-GFP onder controle van een motor neuron-specifieke promotor, D42. (A ') 5 min-mitochondriale beweging in (A) wordt vertegenwoordigd door de kunstmatige Temporal-Color code (gemaakt door Fiji). (B) peroxisomen in een beschaafde Drosophila neuron gekenmerkt door pAC-SKL-mCherry, geïnjecteerd in de vroege syncytieel blastoderm stadium embryo's. (B) 2 min-peroxisoom beweging in (B) wordt vertegenwoordigd door de kunstmatige Temporal-Color code (gemaakt door Fiji). Schaal bar, 5 micrometer.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
| Organel | Beschrijving |
| Peroxisomen | Peroxisomale targeting signaal 1 tripeptide (SKL) getagged met een FP 25 |
| Mitochondriën | Mitochondriale targeting volgorde van cytochroom c oxidase subunit VIII gelabeld met een FP 26 |
| Mitochondriën | Mitotracker (Dye, die zich ophoopt in actieve mitochondriën) 27 |
| Lysosomen | Lysotracker (Dye, die zich ophoopt in de cellulairecompartimenten met lage interne pH) 28 |
Tabel 1. Meest voorkomende organel etikettering strategieën.
Deze tabel geeft een overzicht van de meest voorkomende organel etikettering strategieën in weefselkweek cellen, met inbegrip van etikettering van peroxisomen, mitochondria en lysosomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van microtubuli-afhankelijke goederenvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuron cultuur. Zowel S2 processen en neurites zijn structuren opgevuld door gebundelde microtubuli arrays die dienen als tracks voor organel transport.
Twee strategieën worden gewoonlijk gebruikt om label organellen: transfectie van vectoren die coderen voor een fluorescerend eiwit met een organel doelsequentie of kleuring met fluorescente kleurstoffen direct toegevoegd aan kweken. Bekende voorbeelden van lading labels zijn vermeld in tabel 1. Transiënte transfectie of RNAi behandeling van Drosophila S2 cellen eventueel wordt uitgevoerd in suspensie 4,6,7,9,10 voordat cellen worden uitgeplaat op dekglaasjes voor beeldvorming.
Om betrouwbare resultaten te krijgen in S2 cel experimenten, is het belangrijk om de volgende punten in gedachten te houden:
- Plaat cellen bij optimale dichtheid voor de beeldvorming. High densiteit zal resulteren in overlapping van processen van verschillende cellen, terwijl cellen lage dichtheid slechte levensvatbaarheid en niet in staat om processen te vormen.
- Laat S2 cellen processen volledig ontwikkelen. We routinematig incubeer cellen voor 2 uur na plating maar incubatie maximaal 24 uur kan worden uitgevoerd indien nodig.
- S2-cellen worden behandeld met CytoD voordat zij hechten aan ConA beklede dekglaasjes. Het toevoegen van het geneesmiddel nadat de cellen zijn bevestigd zullen processen vorming opwekken.
- Bij gebruik van kleurstoffen, verandering monsters voor beeldvorming elke 20-25 min, langdurige incubatie van cellen met hetzij Mitotracker of Lysotracker is giftig voor de cellen.
- Wij volgen meestal het vrachtvervoer in S2 cellen door beeldvorming gedurende 1 minuut bij 1 beeld / sec. Onder deze voorwaarde cellen zijn niet foto-beschadigd.
- Alleen analyseren organel beweging in celprocessen. Organel dichtheid in het cellichaam te hoog betrouwbare volgen en polariteit van de beweging niet gemakkelijk worden bepaald.
In dit protocol, moet u aandacht besteden aan een aantal belangrijke stappen hieronder opgesomd:
- Embryo's correct. De verzamelde embryo's moeten worden gesynchroniseerd en opgevoerd naar stadia 9-11, wanneer neuroblast delaminatie van het ectoderm optreedt. Staging embryo te vroeg of te laat kan resulteren in minder neuroblasts per embryo en dus falen oogst neuronen uit het gedissocieerde embryo.
- Dechorionate's naar de juiste mate (alle embryo's van kleur veranderen van volledig wit naar meer transparant). Onder-dechorionation zou kunnen leiden tot moeilijkheden bij het embryo dissociatie, terwijl over-dechorionation de embryo's kunnen beschadigen. Decemberhorionated embryo's worden erg kleverig en zacht, dus proberen te pipetteren of het aanraken van de embryo's met pipet tips tijdens het stappen wassen voordat dissociatie te voorkomen.
- Besteed speciale aandacht aan dissociatie embryo's. We vinden dat plastic wegwerp pellet stampers en bijpassende microtubes geven beter dissociatie dan een glas dounce homogeniseerapparaat, vooral voor kleine aantal embryo's. Onder-dissociatie zal grote cel clusters vertrekken, terwijl over-dissociatie zal leiden tot cellen afbraak en enorme accumulatie van cel puin. Stel de dissociatie niveau overeenkomstig de embryo nummers.
- Plating neuron op de glazen dekglaasje een redelijke dichtheid. Overvolle neuronen ontwikkelen zich gewoonlijk zeer korte neurites, terwijl schaars neuronen vaak niet te overleven.
Daarnaast hebben we gemerkt dat primaire celculturen spiercellen bevatten vaak, en bloedcellen. Overnight behandeling met CytoD helpt om het aantal spiercellen en bloedcellen verminderen, waarbijs neurietuitgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de Gelfand lab die de ontwikkeling van deze protocollen bijgedragen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder nummer award R01GM052111 aan VIG en door Baskische regering Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek onder nummer award BFI-2011-295 tot UDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
