Summary
Cellules S2 de drosophile et des neurones en culture sont de grands systèmes pour l'imagerie du transport motorisé organite in vivo. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour la culture des deux types de cellules, leur imagerie et d'analyse de transport.
Abstract
Des cellules S2 de Drosophila étalées sur une lamelle couvre-objet en présence de tous les longs processus non ramifiées de forme de médicaments de l'actine-dépolymérisation de microtubules uniformément remplis de polarisation. Organites se déplacent le long de ces processus par des moteurs de microtubules. Facile d'entretien, de sensibilité à la protéine ARNi knock-down et procédure efficace pour créer des lignées cellulaires stables rendre les cellules S2 de drosophile un système modèle idéal pour étudier le transport de marchandises par imagerie en temps réel. Les résultats obtenus avec des cellules S2 peuvent être en outre appliqués à un système plus physiologiquement pertinente: transport axonal dans les neurones primaires en culture à partir d'embryons de Drosophila dissociées. Des neurones en culture se développent de longues neurites remplis de microtubules groupés, très similaires aux processus S2. Comme dans les cellules S2, organelles dans des neurones en culture peuvent être visualisées soit par des colorants fluorescents spécifiques à l'organelle ou en utilisant des marqueurs d'organelles fluorescentes codées par l'ADN injecté dans des embryons précoces ou exprimé dans transgenic vole. Par conséquent, le transport des organites peut être facilement enregistré dans les neurones en culture sur des lamelles de verre en utilisant l'imagerie vivant. Nous décrivons ici les procédures pour la culture et la visualisation de transport de marchandises dans les cellules S2 de drosophile et les neurones primaires. Nous croyons que ces protocoles font deux systèmes accessibles pour les laboratoires qui étudient le transport de fret.
Introduction
Cellules S2 de drosophile ont gagné en popularité de plus en plus pour l'étude de nombreux processus cellulaires. Ces cellules ont été initialement obtenues à partir d'embryons à un stade avancé de trypsinisées OregonR Drosophila melanogaster et maintiennent des caractéristiques de type macrophage 1. Cellules S2 de Drosophila offrent de nombreux avantages par rapport à d'autres lignées cellulaires. Elles sont mises en culture à 25 ° C sans CO 2, et peuvent être visualisés pendant plusieurs heures à la température ambiante sans nécessiter de chauffage ou d'échange de gaz. Plus important encore, les cellules S2 de Drosophila sont très sensibles à un traitement ARNi permet une grande efficacité de knock-down des protéines d'intérêt. Les cellules S2 sont hautement transfectable et des lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés en moins de quatre semaines pour permettre l'expression ectopique stable de protéines d'intérêt. Les cellules S2 poussent normalement soit vaguement attachés mais pas étalés sur un ballon ou en suspension. Ils peuvent être amenés à se propager sur des lamelles prérevêtues avec une conca lectine végétalenavalin A (ConA). La périphérie des cellules de propagation est particulièrement mince et est idéal pour la microscopie de cellules vivantes donc. Des protocoles détaillés pour les cellules S2 de la culture, le traitement ARNi, l'imagerie par immunomarquage direct et la lumière peuvent être trouvés dans la littérature de 2,3. Notre laboratoire a adopté cellules S2 en tant que système modèle pour étudier le transport du fret à base de microtubules. Cellules S2 de Drosophila traités avec un médicament qui dépolymérise ou rompt la F-actine, tels que la cytochalasine D (CytoD), se développent de longs processus remplis de microtubules uniformément polarisées 4 -10, ce qui en fait un système idéal pour étudier le mouvement des marchandises le long des réseaux de microtubules. Différents paramètres de transport dans ces processus (c.-à-trajectoires. Longueurs, vitesses, directivité etc) peuvent être facilement mesurés en utilisant un logiciel de traces de particules automatisé, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Ces propriétés rendent les cellules S2 un système attrayant pour étudier le transport de cargaison le long des microtubules dans les cellules de culture de tissu.
Des expériences pilotes dans les cellules S2 peuvent être étendus à un modèle physiologique important des études de transport de marchandises dans la drosophile neurones primaires. Similaire à des cellules S2, les neurones mis en culture à partir d'embryons dissociées sont perméables aux petites molécules telles que des colorants et des inhibiteurs, et l'imagerie haute résolution en temps réel du transport des organites peuvent être effectuées dans des neurones à la température ambiante. En utilisant la drosophile fonds génétiques différents, nous pouvons examiner la fonction des gènes dans les neurones primaires par KO (mutations génétiques perte de fonction), knockdown (injection d'ARNdb ou expression) ou l'expression ectopique (mouches transgéniques). Plus précisément, la fragmentation des filaments d'actine en utilisant le traitement CytoD n'empêche pas la croissance des neurites, mais plutôt qu'ils poussent plus vite, et ainsi nous pouvons étudier microtubules dependent le transport des organites dans les neurones CytoD traités sans l'influence de filaments d'actine 11. Par conséquent, les cultures primaires de neurones combinent les avantages des cellules de culture de tissus et de voler la génétique, ce qui en fait un excellent système pour étudier le transport de fret dans un système pertinent physiologique 10,12. Depuis plusieurs maladies neurodégénératives familiales pourraient être causés par ou associées à des défauts de transport de marchandises (par exemple de la maladie de Parkinson 13, la maladie de Huntington 14, la maladie d'Alzheimer 15,16, la sclérose latérale amyotrophique / ALS 17, HMN7B et Perry syndrome 18,19, et Ataxie spinocérébelleuse type 5/SCA5 20), les cultures primaires de neurones peuvent être utiles dans l'analyse des effets de mutations spécifiques qui causent ces maladies sur le transport des microtubules dépendant.
Enfin, les propriétés importantes de transport des microtubules dépendant sont bien conservées entre les mammifères et les mouches, mais
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Protocol
Une. Cellules S2 de Drosophila
Préparation des lamelles couvre-objet enduites ConA
- Placez les lamelles dans un rack en céramique et les laver par immersion de l'acide chromique pendant 1 heure. [ATTENTION: l'acide chromique est corrosif et peut provoquer une irritation des yeux, du nez, de la gorge et de la peau].
- Rincer abondamment avec de lamelles constamment courir dH 2 O pendant 30 minutes jusqu'à ce que l'acide est complètement délavé.
- Laissez l'air lamelles sec et les enrober de ConA (solution à 0,5 mg / ml dans dH 2 O) pendant 30 min.
- Rincer lamelles avec dH 2 O pendant 15 minutes et laisser sécher à l'air. Lamelles recouvertes ConA peuvent être stockés jusqu'à 1 mois.
Étalement des cellules
- Laisser les cellules S2 de croître de façon exponentielle en T25 ou T75 cm2 en fonction du nombre de cellules nécessaires pour l'expérience.
- Compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Ajouter une croissance ml moyenne (par exemple les insectes Xpress) dans une boîte de 35 mm de tissu de culture avec de la ConA lamelle revêtue, et le transfert en douceur ~ 1 x 10 5 cellules à l'antenne. Cette densité cellulaire est optimale pour l'imagerie parce que les procédés à partir de cellules différentes ne se chevauchent pas.
- Afin d'induire la formation de processus, immédiatement après l'étalement ajouter 1 ml de milieu avec 5 uM CytoD à l'antenne (à la concentration finale de 2,5 uM CytoD). Permettre le plein développement de procédés en incubant les cellules au moins pendant 2 heures à 25 ° C avant l'imagerie.
2. Drosophila primaire Neuron Culture
Préparation pour la culture de neurones
- Préparer Drosophila milieu de croissance neuronale (milieu de Schneider supplémenté avec 20% de sérum de fœtus bovin, inactivé par la chaleur à 55 ° C pendant 30 min, 5 ug / ml d'insuline, 100 ug / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 10 pg / ml de tetracycline) . Ce soutienle milieu de plemented Schneider peut être conservé à 4 ° C pendant 6 mois.
- Préparer la pomme flacons de gélose au jus de collecte de Drosophila embryons (22,5 g d'agar-agar, 12,0 g de saccharose et 750 ml H 2 O dans un ballon de 2 litres, autoclave pendant 20 à 25 min, ajouter 250 ml de jus de pomme et verser ~ 10 ml dans chaque Drosophila flacon, après solidification, branchez flacons avec des boules de coton, et l'envelopper d'une pellicule de flacons en plastique pour aliments afin d'éviter un séchage excessif de la nourriture). Le jus de pomme dans des flacons de gélose peut être conservé à 4 ° C dans des sacs en plastique bien fermés pendant 4 semaines.
- Lavés à l'acide manteau 25 mm lamelles de cercle avec ConA (voir détails dans le protocole pour les cellules S2 de drosophile) et stériliser les sous lumière UV pendant 10-15 min. Ces lamelles peuvent être stockés pendant un mois.
Culture des neurones embryonnaires de Drosophila
- Gardez jeune adulte vole dans des flacons de gélose pomme de jus additionné de levure sèche de 1-2 jours avant la collecte des embryons fou la préparation de neurones.
- Le jour de collecte, afin de synchroniser les embryons collectés, transfert mouches adultes à une pomme jus agar flacon pendant 1 heure précollecte à la lumière et jeter ces embryons.
- Transfert vole vers un nouveau flacon de jus de gélose de pomme, de recueillir des embryons pendant 1 heure, et de transférer les mouches à un autre flacon pendant une heure, à la fois dans l'obscurité pour augmenter le rendement de l'embryon.
- Retirez les mouches adultes à partir du jus de pomme agar flacon et laisser les embryons se développent encore 4 h à étapes 9-11 à la température ambiante (4-6 embryons h-vieux sont entre le stade 9-11).
- Retirez les embryons en injectant de l'eau dans des flacons et desserrant les embryons du jus de pomme agar avec un petit pinceau (au moins 10 embryons sont nécessaires pour une bonne préparation des neurones).
- Transférer les embryons à un filet de nylon tamis cellulaire 100 um avec une pipette de transfert pour évacuer l'eau (prélavage la pipette de transfert chez la drosophile tampon de lavage de l'embryon, 0,4% de NaCl, 0,03% de TritonX-100).
- Recueillir les embryons de la crépine en utilisant un petit pinceau, et les transférer dans un microtube de 1,5 ml remplie de 1 ml Drosophila lavage de l'embryon (Note: nettoyer les fibres de gélose ou de coton à l'aide du pinceau ou des embouts de pipette). Dans ce protocole, le microtube de 1,5 ml est livré avec une pastille jetable pilon correspondant.
- Laver les embryons dans l'embryon de drosophile lavage 3x.
- Dechorionate les embryons dans une solution d'eau de Javel frais 01h01 commerciale et 95% d'éthanol pour 10 min [ATTENTION: l'eau de Javel peut provoquer une irritation des yeux, du nez, de la gorge et de la peau].
- Passez à la hotte de culture de tissus, et laver les embryons 2x en milieu de Schneider complété.
- Laissez 200-300 milieu de pi dans le tube avec les embryons, et doucement dissocier mécaniquement embryons dechorionated utilisant Kimble Chase pilons de granulés jetables qui ont été stérilisées par 70% d'éthanol (10-15x moudre).
- Centrifuger le mélange homogénéisé à 20 g pendant 2 min, et transfer le surnageant dans un tube frais. [Cette étape est facultative, elle aide à éliminer les débris de l'embryon]
- Centrifuger le surnageant à 550 x g pendant 2 min pour sédimenter les cellules.
- Reprendre le culot dans 500 ul de cellules de moyennes et de spin de Schneider complété à nouveau à 550 g pendant 2 min; répéter le cycle de remise en suspension de filage fois.
- Enfin remettre en suspension le culot dans 100 pl ~ supplémenté le milieu de Schneider et de la plaque les cellules sur une lamelle couvre-objet de 25 mm revêtu de ConA dans une boîte de Pétri de 35 mm stériles. Incuber pendant 10 min pour permettre la fixation des cellules.
- Ajouter 2 ml de milieu de Schneider, complétée avec 5 uM CytoD pour submerger la lamelle avec des cellules attachées.
- Incuber le plat dans une humidifié 25 ° C incubateur pendant une nuit avant l'imagerie.
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Representative Results
Cellules S2 de drosophile attachés sur la propagation de la lamelle ConA revêtu dans un plat rond de forme de "crêpe" (Figures 1A et 1C). Cependant, lorsque les cellules étalées sur des lamelles couvre-S2, en présence d'CytoD et autorisés à se propager pendant 2-3 heures, ils forment de longs processus minces remplis par les microtubules parallèles (figures 1B et 1D). Ces microtubules ont une polarité uniforme avec plus-se termine sur 7. Time-lapse imagerie de fluorescence de la drosophile S2 exprimant de façon stable mCherry-tubuline montre que les processus sont très dynamiques, en particulier pendant les 60 premières minutes après la fixation (Figure 2). Après 1 heure d'incubation, la croissance ralentit et 2-3 heures d'incubation assure que la majorité des cellules ont procédés à maturité. Ici, nous montrons deux exemples représentatifs de transport des organites le long des microtubules dans les cellules S2, lysosomes (marquées avec Lysotracker, 200 nM; figures 3A-B 7 (transfection stable avec PAC-GFP-SKL; figures 3D-E). Images time-lapse des cellules ont été prises toutes les 1 sec pour 61 cadres à l'aide d'un microscope inversé Nikon TU-2000 équipé d'un système de mise au point parfaite (Nikon) et une caméra CCD Coolsnap (Roper Scientific) entraînée par le logiciel Metamorph. Une source de lumière à halogène de 100 W a été utilisé pour l'excitation de fluorescence à réduire au minimum le photoblanchiment et de phototoxicité. Chacune des 61 images dans la séquence a été code couleur en fonction de la barre en haut à droite et images ont été superposées pour créer des pistes de code couleur. Particules ainsi générées mobiles pistes d'arc en ciel, tandis que les particules fixes semblaient blanc 10. ImageJ plug-in Temporal Code-couleur ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) a été utilisé pour ce traitement. Pour l'analyse quantitative de mouvement des organites, nous avons utilisé le logiciel DiaTrack (Semasopht Inc.), nous ne sélectionnons queorganites qui sont localisées dans des procédés car ils peuvent être facilement suivies et la polarité des titres des microtubules est connue. figures 3C et 3F montrent des distributions typiques de vitesses rétrograde et antérograde obtenus par les lysosomes et les peroxysomes cheminement, respectivement.
Des techniques similaires sont utilisées dans notre laboratoire pour l'analyse du transport des organites dans des neurones en culture primaire. Les neurones sont un type cellulaire prédominant dans les cultures mixtes obtenus à partir de l'étape 9 à 11 embryons. Après la culture durant la nuit, ils sont faciles à reconnaître par la forme des cellules de caractère avec neurites à plus de 50 m de long (figure 4A). Ces cellules sont également positives pour le marqueur pan-neuronal, Elav 21 (figures 4B et 4B). Processus dans les neurones sont remplis avec les microtubules (figures 4B et 4B "). Nous pouvons suivre le transport des organites le long des axones en utilisant le techniques décrits ci-dessus pour les cellules S2. Mitochondries peuvent être marquées à la GFP mitochondrial (Mito-GFP) sous le contrôle d'un moteur spécifique des neurones promoteur D42 22 (figures 5A et 5A), et les peroxysomes peuvent être marqués par injection d'ADN codant pour un peroxysomes ciblée mCherry 7, dans syncytial embryons au stade de blastoderme (figures 5B et 5B ').
Figure 1. Drosophila S2 formation de processus induit par CytoD. Cellules (A, C) S2 de drosophile attachent et répartis dans des formes rondes et aplatir quand plaqué en lamelles ConA prérevêtues. Cellules (B, D) S2 plaqués en présence de 2,5 um CytoD forment un long processus remplis de microtubules après 3 heures d'incubation. <strong> AB et CD sont transmises lumière et images fluorescentes de tubuline mCherry marqués, respectivement. La barre d'échelle, 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Laps de temps de croissance des processus dans une cellule de Drosophila S2. Fluorescence time-lapse d'une cellule de Drosophila S2 exprimant mCherry-tubuline en présence de 2,5 uM CytoD. Les chiffres indiquent le temps après la cellule joindre à la lamelle. La barre d'échelle, 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. mouvement de transport des organites dans les cellules S2 de drosophile. (AC) Lysosome dans la cellule de Drosophila S2. A 1 min-lysosome transports représentant (marqué avec 200 nM Lysotracker) dans une cellule (Une image DIC), représenté par le Temporal-code artificielle (créée par FIDJI) (B). Vitesses obtenues à partir de l'analyse du mouvement lysosome suivi dans les processus (DiaTrack; 663 particules dans 23 cellules) (C). Mouvement (DF) des peroxysomes dans la cellule de Drosophila S2. A 1 min-peroxysomes transports représentant (marqué avec pMT-GFP-SKL) dans une cellule (D, l'image DIC), représenté par le Temporal-code artificielle (créée par FIDJI) (E). Vitesses obtenues à partir de l'analyse du mouvement des peroxysomes suivi dans les processus (DiaTrack; 228 particules dans 20 cellules) (F). Notez que les lysosomes déplacent avec des trajectoires plus longues et plus rapides que les peroxysomes. La barre d'échelle, 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Neurones de drosophile primaire de culture de la nuit. (A) Une culture pendant une nuit neurone drosophile a la morphologie neuronale caractéristique avec de longs neurites. (B) Le neurone exprime un marqueur pan-neuronal, Elav (rouge et blanc B en B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) et avec de longs neurites remplis de microtubules (vert en B et blanc en B'', DM1α , 1:1000). Barre d'échelle, 5 um. nk "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 5. le transport des organites dans des neurones en culture de Drosophila. (A) Les mitochondries dans un neurone Drosophila cultivées marqué par Mito-GFP sous le contrôle d'un moteur promoteur spécifique des neurones, D42. (A ') 5 mouvement de min-mitochondrial (A) est représenté par le code temporel-Couleur artificielle (créée par FIDJI). (B) Les peroxysomes dans un neurone drosophile en culture marquée par PAC-SKL-mCherry, injectées dans des embryons au stade de blastoderme syncytial début. (B ') 2 min-peroxysomes mouvement (B) est représenté par le code temporel-Couleur artificielle (créée par FIDJI). La barre d'échelle, 5 um.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
| Organite | Description |
| Peroxysomes | Signal de ciblage des peroxysomes 1 tripeptide (SKL) marqué avec un FP 25 |
| Mitochondries | Séquence de ciblage mitochondrial de la cytochrome c oxydase sous-unité VIII marqué avec un FP 26 |
| Mitochondries | Mitotracker (Dye qui s'accumule dans les mitochondries actif) 27 |
| Lysosomes | Lysotracker (Dye qui s'accumule dans cellulairecompartiments ayant un faible pH interne) 28 |
Tableau 1. Stratégies en matière d'étiquetage des organites les plus courantes.
Ce tableau résume les stratégies les plus courantes en matière d'étiquetage des organites dans les cellules de culture de tissus, y compris l'étiquetage des peroxysomes, mitochondries et des lysosomes.
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Discussion
Nous présentons ici des protocoles détaillés pour étudier le transport de fret microtubules dépendante dans les cellules S2 de drosophile et de la culture de neurones primaires. Les processus et les neurites S2 sont des structures remplies par groupés microtubules tableaux qui servent de pistes pour le transport des organites.
Deux stratégies sont généralement utilisées pour des organelles de l'étiquette: la transfection de vecteurs codant pour une protéine fluorescente ayant une séquence d'organite de ciblage ou la coloration avec des colorants ajoutés directement à des cultures fluorescents. Des exemples courants d'étiquettes de marchandises sont énumérées dans le tableau 1. Transfection transitoire ou traitements ARNi de cellules S2 de drosophile si nécessaire est effectuée en suspension 4,6,7,9,10 avant que les cellules sont étalées sur des lamelles pour l'imagerie.
Afin d'obtenir des résultats fiables dans des expériences de cellules S2, il est important de garder les points suivants à l'esprit:
- Cellules de la plaque à une densité optimale pour l'imagerie. Haut densité entraînera des chevauchements des processus à partir de cellules différentes, tout en cellules de faible densité ont une mauvaise viabilité et sont incapables de former processus.
- Laisser les cellules S2 de développer complètement processus. Nous incuber régulièrement les cellules pendant 2 heures après l'étalement, mais l'incubation jusqu'à 24 heures peut être effectué si nécessaire.
- Les cellules S2 doivent être traités avec CytoD avant qu'ils attachent à lamelles recouvertes ConA. Ajout de la drogue après que les cellules sont attachés ne sera pas induire la formation de processus.
- Lors de l'utilisation des colorants, des changements échantillons pour imager chaque 20-25 min; incubation à long terme de cellules avec soit Mitotracker ou Lysotracker est toxique pour les cellules.
- Nous suivons généralement le transport de fret dans les cellules S2 par imagerie pendant 1 min à 1 image / sec. Dans ces conditions les cellules ne sont pas photo-endommagée.
- Seulement analyser les mouvements des organites dans les processus cellulaires. densité de Organelle dans le corps cellulaire est trop élevé pour un suivi fiable et la polarité du mouvement ne pouvaient pas être facilement déterminées.
Dans ce protocole, vous devrez peut-être payer attentions à plusieurs étapes clés énumérés ci-dessous:
- embryons de Scène correctement. Les embryons collectés doivent être synchronisés et mis en scène à étapes 9-11, quand neuroblastes délaminage de l'ectoderme se produit. Mise en scène embryons trop tôt ou trop tard peut entraîner moins de neuroblastes dans chaque embryon et donc l'échec de neurones de récolte sur les embryons dissociées.
- Embryons Dechorionate à droite mesure (tous les embryons changent de couleur de tout blanc à plus de transparence). Sous-dechorionation pourrait conduire à des difficultés dans l'embryon dissociation, tandis que plus-dechorionation pourrait endommager les embryons. Décembreembryons horionated deviennent très collant et doux, essayez donc d'éviter la pipette ou de toucher les embryons avec des embouts de pipette au cours des étapes de lavage avant dissociation.
- Portez une attention particulière aux embryons dissociation. Nous constatons que les pilons en plastique jetables et à granulés microtubes correspondant donnent une meilleure dissociation d'un homogénéisateur Dounce en verre, en particulier pour les petites nombre d'embryons. Sous-dissociation laissera grands amas de cellules, tandis que plus de dissociation mènera à cellules ventilation et l'accumulation massive de débris cellulaires. Réglez le niveau de dissociation selon le nombre d'embryons.
- Placage neurone sur la lamelle de verre à une densité raisonnable. Neurones se développent généralement bondés neurites très courts, tandis que les neurones épars omettent souvent de survivre.
En outre, nous avons constaté que des cultures de cellules primaires contiennent souvent des cellules musculaires et les cellules sanguines. Traitement pendant une nuit avec CytoD permet de réduire le nombre de cellules musculaires et les cellules du sang, et de promouvoirs neurites.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Gelfand qui ont contribué à l'élaboration de ces protocoles. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national de sciences générales médical des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution R01GM052111 de VIG et par basque ministère du gouvernement de l'Éducation, des Universités et de la Recherche sous le numéro d'attribution BFI-2011-295 à UdC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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