Summary
Streptococcus pneumoniae er den førende patogen forårsager alvorlige community-erhvervet pneumoni og ansvarlig for over 2 millioner dødsfald på verdensplan. Kan følges op på virkningen af bakterielle faktorer impliceret i fitness eller virulens i realtid i en akut mus lungebetændelse eller bakteriæmi model ved hjælp af selvlysende bakterier.
Abstract
Lungebetændelse er en af de store sundhedsvæsenets problemer i udviklingslandene og de industrialiserede lande og er forbundet med betydelig sygelighed og dødelighed. Trods fremskridt i viden om denne sygdom, tilgængeligheden af intensivafdelinger (ICU), og brugen af potente antimikrobielle stoffer og effektive vacciner, dødeligheden fortsat høje 1.. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Dette patogen er udstyret med en udrustning af overflade-eksponerede adhæsinerne og virulens faktorer, der bidrager til lungebetændelse og invasiv pneumokoksygdom (IPS). Vurderingen af in vivo rollen af bakterielle fitness eller virulensfaktorer er af allerstørste betydning at trævle S. pneumoniae patogenicitet mekanismer. Murine modeller af lungebetændelse, bakteriæmi og meningitis bliver brugt til at fastslå virkningen af pneumokok-faktorer ved difskellige faser af infektionen. Her beskriver vi en protokol til at overvåge i realtid pneumokok udbredelse i mus efter intranasal eller intraperitoneal infektioner med selvlysende bakterier. Resultaterne viser formering og spredning af pneumokokker i de nedre luftveje og blod, som kan visualiseres og evalueres ved hjælp af et billedbehandlingssystem og den ledsagende analyse software.
Introduction
Luftvejsinfektioner forårsaget af virus eller bakterier er fortsat en af de mest almindelige samfunds-erhvervet eller kliniske problemer på verdensplan forårsager cirka en tredjedel af alle dødsfald på verdensplan. De vigtigste bakteriearter er Haemophilus influenzae og Streptococcus pneumoniae 2. Men disse bakteriearter er normalt fælles bestanddele af den naturlige luftveje flora. Således bakteriel vogn er også vis risiko for invasiv sygdom og afhængig af immunstatus eller forfordele af enkeltpersoner. Den asymptomatisk kolonisering udløses til invasive infektioner. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Hos raske individer S. pneumoniae (pneumokokker) er ofte asymptomatiske og harmløse kolonisatorer i de øvre luftveje, hvor de konfronteres med nonpathogenic bakterieraf de bosiddende flora, men også med patogener, såsom Haemophilus spp. eller Staphylococcus aureus og den første linje af det menneskelige immunforsvar. Carriage er højest i små børn (37%) og endnu højere i overfyldte daginstitutioner (58%) 3-5. Den yngste befolkning og de ældre, der modtager pneumokokker via aerosol transmission fra luftfartsselskaber og nasopharynx sekreter 6, hører til de højrisikogrupper og vaccination ved hjælp af en af de pneumokok konjugerede vacciner (PCV10 eller PCV13 hos børn og 23-valent polysaccharid PPSV23 hos voksne) anbefales i USA (US) og mange europæiske lande 4. Den PPSV23 dækker serotyper, der er ansvarlige for ~ 90% af de bakteriæmiske pneumokok-sygdomme i USA og Europa, som forhindrer dermed effektivt invasiv pneumokoksygdom sygdomme (IPD) hos voksne, mens PCVs dækker de mest udbredte serotyper i børn. Følgelig IPD grund af vaccine typer (VT) er reducerede men nonvaccine serotyper viser en høj virulens potentiale og antibiotikaresistens er dukket 4,7-12. Nasopharynx som reservoiret er udgangspunktet for pneumokokker at sprede sig til bihulerne eller midterste ører initierende skadelige lokale infektioner. Mere vigtigt, pneumokokker spredes direkte via luftvejene til bronkierne og lungerne resulterer i livstruende CAP 4,13. Lungeinfektioner er ofte ledsaget med væv og ødelæggelse barriere, således at patogenet spredes i blodet og forårsager IPD. Forekomsten af den fælles landbrugspolitik og IPD er højest i immunsvækkede personer eller i de yderste områder af alder 4,13. De omstændigheder, der er ansvarlige for omdannelsen fra en commensal for et patogen med høj virulens er stadig under debat. Imidlertid har foruden ændringer i host modtagelighed og evolutionær tilpasning ledsaget med højere virulens og stigningen i antibiotikaresistenser blevet foreslået at have en afgørende indflydelse på PNEumococcal infektioner 14-16.
Patogenet er udstyret med en flerhed af adhæsiner, der medierer intim kontakt til mukosale epitelceller. Efter overvindelsen af den luftvejs slim, er pneumokok vedhæftning til værtsceller lettes via direkte interaktioner af overfladeeksponerede adhesiner med cellulære receptorer og ved at udnytte ekstracellulære matrix komponenter eller serumproteiner som bro molekyler 4,17,18. Som alsidige patogener pneumokoktyper er også udstyret med faktorer involveret i unddragelse af værtens immun forsvarsmekanismer. Desuden har de evnen til at tilpasse til forskellige host miljøer såsom lunge, blod og cerebrospinalvæske (CSF), henholdsvis 5,17,19,20.
Virkningen af bakterielle faktorer patogenese og inflammatoriske værtsresponser er undersøgt i eksperimentelle dyremodeller for lungebetændelse, bakteriæmi eller meningitis 21-25. Trods et humant patogen, disse modeller er vill-etableret for at dechifrere pneumokok væv tropisme, virulens mekanismer eller protectivity af pneumokokvaccine kandidater. Den genetiske baggrund af indavlede musestammer bestemmer modtagelighed for pneumokokker. BALB / c-mus intranasalt inficeret med pneumokokker blev fundet at være resistente, mens CBA / Ca-og SJL-mus var mere modtagelige over for pneumokokinfektioner 22. Dette indebærer, at ligner mennesker, den genetiske baggrund og værtsforsvarsmekanismer bestemme udfaldet af infektionen. Derfor er det nødvendigt at opklare modstand loci i genomet af mus mindre modtagelige for pneumokokinfektioner yderligere indsats. Resultaterne har ført til ændringer i in vivo virulens protokoller. I stedet for de indavlede BALB / c mus, der ofte anvendes i fortiden, er de meget modtagelige CD-1/MF1 udavlede musestammer dag ofte bruges til at undersøge effekten af tab af funktion pneumokok virulens eller fitness faktorer 26-28. Desuden er tilgængelighedenaf bioluminescerende pneumokokker og optiske billeddannende teknikker tillader tidstro bioluminescens Bioimaging infektioner. I pneumokokker er indsat den optimerede luxABCDE genkassette (plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km R) i en enkelt integration stedet for kromosomet ved transposon mutagenese. Bioluminiscerende pneumokokker er blevet anvendt til at vurdere dæmpningen af pneumokok mutanter med mangelfuld virulens eller fitness faktorer og deres translokation fra en anatomisk websted til et andet 26,28-31.
Her giver vi en protokol for bioimaging af pneumokok infektioner i en murin lungebetændelse eller sepsis model. Forstærkning og formidling af bioluminiscerende pneumokokker i intranasalt eller intraperitonealt inficerede mus kan nemt overvåges over tid ved hjælp af et optisk imaging system, og det samme dyr på forskellige tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyr infektion eksperimenter er beskrevet her, skal udføres i nøje overensstemmelse med lokale og internationale (f.eks European Health Lov af Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA)) retningslinjer og forordninger for brug af hvirveldyr. Eksperimenterne skal godkendes af den lokale etiske bestyrelse og Institutional Animal Care udvalget. Alle forsøg med S. pneumoniae i laboratoriet eller animalske infektioner er udført i et klasse II biosikkerhed kabinet.
1.. Forberedelse af infektiøs Bestand af Bioluminescent Pneumocococi
- Forbered lager pneumokok kulturer i Todd-Hewitt-bouillon suppleret med 1% (w / v) gærekstrakt og en slutkoncentration på 20% glycerol til vedligeholdelse ved 80 ° C.
- Plate en lille mængde af dybfrosne lager pneumokok kultur på en blodagarplade og inkubere bakterierne i 10 timer ved 37 ° C i 5% CO2. Than blodagarplade indeholder passende antibiotika, såsom kanamycin (150 pg / ml) for transposon insertion af luxABCDE genkassetten i genomet.
- Sub-dyrke en frisk koloni på en ny blodagarplade for højst 10 timer.
- Pode THY medium suppleret med 10% (v / v) varmeinaktiveret (30 minutter ved 56 ° C) føtalt bovint serum (FBS) med pneumokokker og starte kulturen ved en OD600 på 0,05 til 0,07.
- Inkuber pneumokokker uden omrøring ved 37 ° C og 5% CO2, indtil kulturen når en OD600 på 0,35 til 0,40. Væksten vil tage mellem 3-4 timer.
- Harvest pneumokokker ved centrifugering ved 3.750 x g i 10 minutter og resuspenderes bioluminescerende pneumokokker i phosphatpufret saltvand pH 7,4 (PBS) suppleret med 0,5% FBS.
- Juster inokulum til den ønskede koncentration i PBS/10% FBS. Infektionen Dosis afhænger af pneumokok-stamme og den genetiske baggrund af mikrofonene. At inficere udavlet CD-1 mus intranasalt med S. pneumoniae D39 Lux infektion dosis skal justeres til 1 x 10 7 CFU i en suspension af 20 pi suppleret med 90 enheder hyaluronidase. Ryst ikke eller vortex pneumokokker, da dette vil udløse autolyse.
- Verificer inokulumkoncentration ved udpladning 10 fold seriefortyndinger på blodagar og tælling af kolonierne efter vækst natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
- Kontroller bioluminescence af pneumokok-inokulum ved at måle bioluminescence hjælp af et optisk imaging system.
2. Intranasalt og Intraperitoneal Infektion af mus med selvlysende Pneumokokker
- Brug kvindelig outbred mus i en alder af 7-10 uger til akut lungebetændelse og sepsis-model. Vægten af disse mus skal være mellem 20-30 gram.
- Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af ketamin og xylazin. Klargør en blanding 1,0 mgketamin og 0,1 mg xylazin i 100 ul sterilt 0,9% (w / v) natriumchlorid til mus med en kropsvægt på 20 g. Dette er konsistent med en dosis på 50 mg / kg legemsvægt for ketamin og 5 mg / kg legemsvægt for xylazin. For at være præcis, vejer mus før injektionen af bedøvelsesmidler.
- Sprøjt blandingen i intraperitoneal hulrum og placere dyrene tilbage ind i buret, indtil bedøvelsesmidler handle og dyrene er narcotized. Vejrtrækning af mus bliver meget langsom og regelmæssig. Mus skal være fuldt narcotized, således at intranasal podning og indånding af bakteriesuspension ikke vil resultere i nysen og dermed tab af inokulum. Dette kan vurderes ved at knibe med musen i slutningen af deres hale, en fuldt narcotized mus vil mangle lydhørhed.
- Forsigtigt afhente en narcotized mus og hold musen mellem fingre og tommelfinger med næsen lodret (figur 1).
- Brug en pipette med lange smalle spidser (Gel LoaderTips) og slippe bioluminiscerende pneumokokker i flere små dråber på Nares (10 gl / næsebor) af musen 26-29. Musen vil ufrivilligt indånde bakterier. Hold musen 1-2 min oprejst og observere, om musen nyser eller holder inokulum.
- Infect 7-10 uger gamle CD-1-mus intranasalt med en infektion dosis på 1 x 10 7 eller 7,5 x 10 7 pneumokokker af stamme D39 og TIGR4 henholdsvis at overvåge infektion i realtid. Detektionsgrænsen for systemet uden nogen absorption af værten væv er ca 1 x 10 6 selvlysende bakterier.
- Inficere mus intraperitonealt (IP) til at vurdere og BioImage virulens pneumokokker i en sepsis mus infektion model. Anvend 5 x 10 3 CFU i 100 pi af stamme D39 og 1 x 10 4 af stamme TIGR4. Mus ikke bedøvet, når du bruger IP-ruten.
- Podes kontrol mus med PBS.
Fig. 1. Intranasal infektion i CD-1 mus med S. pneumoniae. Klik her for at se større billede .
3. Visualisering Pneumokok Formidling til lungerne og blod ved hjælp af Imaging System
Billede formidling af pneumokokker efter intranasal infektion af kvindelige udavlede CD1 mus i realtid ved hjælp af en in vivo imaging system.
- Tænd billeddannende system og start billede analyse software placeret på preconfigurated computer.
- Afbildningssystemet initialiserer automatisk og CCD kameraet er termoelektrisk afkølet til 90 ° C før være aktiv.
- Indstillingerne og Binning afhænger af antallet af mus måltsamtidigt og på styrken af bioluminescerende signal. Synsfeltet (FOV) at overvåge bioluminescence af dyrene er variabel og forstørrelsen svinger mellem et synsfelt på 22,5 cm til at måle fem mus, og et synsfelt på 3,9 cm til at måle en enkelt mus eller dele af dyret ligesom brystet eller hoved.
- Brug rutinemæssigt en eksponeringstid på 1 min, en medium grad af Binning og et synsfelt på 22,5 cm (sæt D). For det første, skal du vælge selvlysende billedbehandlingstype og derefter indstille de billeddannende parametre.
- Emissionen af signalet kan afhænge af den bakterielle stamme og muse-stamme, og pigmentet med musen. Barbere brystet af mus ved hjælp af f.eks C57BL / 6 mus, hvilket kan være fordelagtigt, når afbildning af udviklingen af pneumoni i disse mus.
- Billede inficerede mus ved prechosen tidsintervaller. Måle bioluminescens af mus i akut lungebetændelse model med tidsintervaller på højst 8-12 timer. Overvåg også velfærd inficerede mus med observing deres udseende, adfærd og bestemmelse af vægttab.
- Bedøver mus i den narkotiske kammer anæstesi system Videoudstyrets forud for målingerne i kammeret. Start inhalation af en blanding af isofluran og ilt og vente, indtil musene ånde langsomt og regelmæssigt.
- Placer bedøvede dyr til billeddannelse kammer af systemet og holde mus i liggende stilling. CCD-kameraet på toppen af kammeret vil da billedet murine luftveje.
- Placer dyr med deres næse ind på rør for at tillade inhalering af anæstetika.
- Isofluran indrejse i imaging kammeret via en gas slange er tilladt at opretholde anæstesi.
- For at aktivere CCD kamera på toppen af kammeret og starte bioluminiscerende optisk billeddannelse, tryk på "Acquire" i imaging software. Umiddelbart et fotografi af musene i den lukkede kammer vises på skærmen. Efter et minuts målingen et overlay af bioluminescence data, og fotoet vises.
- Stop anæstesi efter billedet overlay vises i vinduet af softwaren og sætte musene tilbage i deres bure.
- Musene overvåges til nyttiggørelse.
Figur 2. Anæstesi og overvågning af mus inficeret med bioluminescerende pneumokokker hjælp IVIS anæstesi og IVIS Spectrum system hhv. A) IVIS Spectrum imaging system. B) IVIS anæstesi system rugekammeret. C) Mus bedøves i rugekammeret . D) Mus placeret inden IVIS Spectrum Imaging kammer med deres næse indånde bedøvelsesmiddel._blank "> Klik her for at se større billede.
4.. Kvantificering og vurdering af Bioluminescens af mus inficeret med selvlysende S. pneumoniae
- Bestem bioluminescens intensiteter af mus eller et udvalgt område af musene ved at kvantificere den samlede foton emission (fotoner / s) ved hjælp af billedanalyse-software.
- Brug værdierne af fotonemission, der leveres i et Excel-datablad for at forberede en graf. Da variationen af data ofte er høj inden for de grupperede mus, generere en kasse knurhår graf for at vise forskellene i mus inficeret med de forskellige pneumokok-stammer.
- Give fotoner pr mus eller alternativt resultaterne som gennemsnittet af radians (fotoner / sek / cm 2 / sr) af et udvalgt område.
- Data for ROI (region-of-renter) i foton tilstand måling kan kvantitativt sammenlignes på tværs af forskellige in vivo billeddannelse med forskellige komra indstillinger da målingerne i enheder af udstråling automatisk højde kameraindstillinger (fx integration tid, arkivering, f / stop, og synsfelt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Købet og optagelse af methionin er af central betydning for pneumokokker at opretholde fitness i deres vært niche 32,33. Methionin ABC transportør lipoprotein er kodet i D39 ved SPD _ 0151 gen (TIGR4: sp_0149) og navngivet MetQ 32.. Pneumokokker yderligere producere methionin biosyntese enzymer (D39: Spd_0510 - Spd_0511, TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete og MetF). Den manglende methionin i et kemisk defineret medium påvirker væksten af pneumokokker og lignende, manglende methionin bindende lipoprotein MetQ forringet optagelse af methionin 32,33. Denne defekt kunne genoprettes ved tilsætning af høje koncentrationer af methionin. I musen kolonisation eksperimenter mutanten mangler MetQ ikke blev svækket virulens, som vist i coinfektion eksperimenter med isogene vild-type, medens den manglende MetQ svækket pneumokokker i musemodeller af sepsis og pneumoni, som vist vedbestemme den bakterielle belastning 32. Real-time optisk bioimaging hjælp IVIS Spectrum anvendes her tillader overvågning af formering og spredning af bakterier i en enkelt inficeret dyr på forskellige tidspunkter.
I det viste eksempel har vi vurderet effekten af methionin bindende lipoprotein MetQ om kolonisering og virulens ved at anvende den akutte lungebetændelse infektion musemodel. CD-1 udavlede mus (n = 10) blev inficeret intranasalt med 1 x 10 7 bakterier af vildtypestamme S. pneumoniae D39 lux (PN149) eller dens isogene mutante D39 lux Δ metQ (tabel 1). Den metQ mutant (PN252) blev konstrueret ved indsættelse-deletionsmutagenese af metQ genet i selvlysende D39 pneumokokker. Derfor blev metQ genet, 5'-sekvens og 3'sequence amplificeret ved PCR under anvendelse af primere 382 og 385. PCR-produktet blev klonet ind i vektoren pGEMT-let, hvilket resulterede i plasmidet p559 (tabel 1). Ved omvendt PCR under anvendelse af primere 383 og 384 (tabel 2) metQ sekvens (nt 58 til nt 777) blev slettet og erstattet af en erythromycinresistens genkassette (ermB) forstærkes ved PCR ved hjælp af plasmid pE89 (tabel 1) som DNA-skabelon og primerparret ermB_105/ermB_106 (tabel 2). De resulterende plasmid P563 34 blev omdannet til pneumokokker, som beskrevet tidligere ved hjælp af kompetence-stimulerende peptid-1. Mutanter deficiente i lipoprotein MetQ (Spd_0151) blev dyrket i THY eller på blodagarplader suppleret med erythromycin (5 ug / ml).
Sundhedstilstanden af musene blev løbende overvåget. Dyrene blev aflivet når der viser ingen ordentlig respons eller tegn på morbiditet. Desuden pneumokok formidling fra nasopharynx i lungerne og blodet, hvilket fører til alvorlig lungebetændelse og sepsis, var monitorød ved at måle bioluminescens otte timer. I hver gruppe af inficerede mus 7 ud af 10 mus udviklede svære tegn på sygdom, mens de øvrige 3 mus viste ingen bioluminescens og overlevede (figur 3A). Mus succesfuldt inficeret med bioluminescerende vildtype-D39 lux udviklet 32 timer efter infektion alvorlige lungeinfektioner, som skrider frem inden for 8-16 timer til sepsis (figur 3A). På tidspunktet 96 timer bukket, som havde udviklet lungebetændelse og sepsis efter infektion med D39 lux alle mus. Det tab af funktion af methionin bindende lipoprotein væsentligt forringet virulens pneumokokker. Efter 32 hr kun en mus inficeret med metQ mutant viste en svag lungeinfektion, mens de andre viste ingen tydelige tegn på sygdom og lungebetændelse. , Efter 48 timers alvorlige lungeinfektioner blev dog også tydeligt i mus inficeret med mutant. Som et resultat, disse mus sepsis 72 timerpost-infektion og blev døende senest 72 timer efter infektion, hvilket viser, at mangel på MetQ i den akutte lungebetændelse infektion model dæmper pneumokokker.
Tabel 1. Strain og plasmid listen.
Tabel 2. Primer listen. Restriktionssteder er understreget.
| Primer anvendelseserklæringen | Primer navn | Sequence (5'-3 ') |
| Insertion-deletionsmutagenese | ||
| Amplifikation af sp_0149 + 5'-og 3'-flankerende region | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| Invers PCR af sp_0149 + 5 'og 3'-flankerende region (pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| Antibiotika kassette forstærkning | ||
| erythromycin (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
Figur 3.. Overvågning af pneumokok-formidling i mus efter intranasal infektion. A) Bioluminescent optisk billeddannelse af mus inficeret intranasalt med D39 lux eller isogenisk mutant D39 luxΔmetQ. B) Værdierne af bioluminescence intensiteter af grupperede mus (n = 10) er vistfor angivne tidspunkter i en kasse knurhår graf. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle eksperimenter udført i dyr skal godkendes af de lokale myndigheder og etik provisioner. I in vivo infektion eksperimenter den bakterielle belastning i de forskellige host nicher af inficerede dyr skal bestemmes på forskellige tidspunkter efter infektion. Under disse eksperimentelle forhold har de dyr, der skal ofres, før isolering af bakterier fra blodet, nasopharynx, bronchoalvelar udskylning, eller organer såsom lunger, milt og hjerne. For at beregne antallet af bakterier pr vært niche og vurdere effekten af bakterielle faktorer virulens, blod eller organer skal isoleres efterfulgt af bakteriel inddrive og forkromning på faste medier. Den bakterielle belastning derefter kvantificeret ved tælling af CFU. For at nå statistisk signifikante data hvert tidspunkt har brug for en gruppe af mus, som under visse eksperimentelle betingelser medfører vanskeligheder i håndteringen af forsøget på grund af det høje antal af mus.
ove_content "> I modsætning hertil realtid Bioimaging metode er en mindre tidskrævende fremgangsmåde og hver enkelt bakterie-inficerede mus kan overvåges flere gange over en periode. De billeddannende teknik muliggør visualisering af bakterier i dyr på forskellige tidspunkter efter infektion eller endda for en længere periode. Desuden bioluminescence målt med optisk billedstabilisering analyse software muliggør yderligere kvantificering af fotoner, der udsendes af det inficerede dyr. Dette kan begrænses til et afgrænset område af musen eller hele dyr kan betragtes. i in vivo infektion eksperimenter pneumokoktyper-inficerede mus skal overvåges i intervaller på 8-12 timer, da udbredelsen af pneumokokker kan gøre hurtige fremskridt i udavlede CD-1 mus. Den virkelige time scanning kan anvendes til visualisere transmigration af pneumokokker fra nasopharynx i lungerne og blod, og derudover formering af pneumokokker i blodetefter intraperitoneal infektion kan overvåges af den dramatiske stigning i bioluminescens intensitet 26,28,29.Når man sammenligner virulens potentiale vildtype pneumokokker og isogene mutanter er det vigtigt at teste først virkningen af tab af genet under in vitro-dyrkningsbetingelser. Vækst forskelle mellem vildtype-bakterier og mutanter, navnlig i kemisk defineret medium, er allerede tegn på nedsat bakteriel fitness 26. Således er dæmpning observeret under in vivo-tilstande associeret med en ændret fysiologi fører til mindre robust pneumokokker i kolonisering og invasive infektioner.
Det skal dog nævnes, at denne imaging teknik er ofte ikke tilstrækkeligt til at påvise effekten af gen-knockouts på pneumokok virulens. I lighed med andre sygdomsfremkaldende bakterier pneumokokker er alsidige mikroorganismer og har udviklet sig mangefacetterede mekanismer to støder værten og undvige immunsystemet. Følgelig pneumokokker fremstille på den ene side proteiner med mange funktioner, såsom adhesin PspC og på den anden side er de udstyret med adskillige proteiner, der udviser lignende funktioner som således kan kompensere for manglen af et protein på grund af mutationer 4,17,18 35. I disse scenarier andre in vivo infektion eksperimenter såsom coinfection fremgangsmåde har at være ansat til at dechifrere effekten af tab af protein funktion i mutant for kolonisering eller invasive infektioner 27,28.
Pneumokokker kolonisere og inficere fortrinsvis mennesker, men blev også isoleret fra kæledyr eller dyr i zoologiske haver 4,36,37. At dechifrere virkningen af virulens eller bruges fitness faktorer mus infektion modeller. Men ikke alle pneumokokstammer er mus virulent, og endnu vigtigere, modtagelighed af mus afhænger genetiske baggrund af dyrene 22. Pneumokokvirulens samt undersøgelser beskyttelse er i dag udført med CD-1 udavlede mus. Men knockout mus eller transgene mus er også af stor interesse at dechifrere rolle værten faktorer for invasiv pneumokoksygdom sygdomme. Knockout eller transgene mus er ofte genereres i musestammer, såsom C57/BL6 eller Balb / c-. Disse musestammer er mindre modtagelige over for pneumokok infektioner og høj infektionsrisiko doser er nødvendige for at opnå en dødelig dosis, 50% (LD 50). Afhængigt af infektionen dosis denne modstand af mus kan forringe realtid Bioimaging af pneumokok formidling til lungerne eller blod, idet pneumokokker er begrænset til at formere sig på en måde, der er nødvendige for påvisning af det billeddannende system. For at overvinde denne begrænsning, og at være i stand til at afbilde udbredelse i realtid, høje doser infektion skal udnyttes. Risikoen for denne tilgang kunne være, at der ikke kan udforskes forskelle i værtslandet modtagelighed formidling skrider for hurtigt.
via intranasal eller intraperitoneal vej. Denne fremgangsmåde er især egnet til at sammenligne virulensen potentialet mellem vildtype og mutanter af S. pneumoniae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forskning i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) og Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) Medicinsk Infektion Genomics (FKZ 0315828A) til SH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G.
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J.
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E.
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
