Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/51174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department Genetics of Microorganisms, Interfaculty Institute for Genetics and Functional Genomics, University of Greifswald

Summary

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Abstract

Lungenentzündung ist eine der wichtigsten Gesundheitsprobleme in Entwicklungsländern und Industrieländern und ist mit erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden. Trotz der Fortschritte in Kenntnis dieser Krankheit, die Verfügbarkeit von Intensivstationen (ICU), und der Einsatz von potenten antimikrobielle Mittel und wirksame Impfstoffe, bleiben die Sterblichkeit hoch ein. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Dieser Erreger ist mit einem Arsenal von oberflächenexponierten Adhäsine und Virulenz Faktoren, die zu einer Lungenentzündung und invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) ausgestattet. Die Bewertung der in-vivo-Rolle von bakteriellen Virulenzfaktoren Fitness oder ist von größter Bedeutung, S. entwirren pneumoniae Pathogenität Mechanismen. Murine Modelle von Pneumonie, Bakteriämie, und Meningitis werden eingesetzt, um die Auswirkungen der Pneumokokken-Faktoren zu bestimmen, verschiedenen Stadien der Infektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Überwachung in Echtzeit Pneumokokken-Verbreitung in Mäusen nach intranasaler oder intraperitoneale Infektionen mit Biolumineszenz-Bakterien. Die Ergebnisse zeigen die Vermehrung und Verbreitung von Pneumokokken in die unteren Atemwege und Blut, die visualisiert und ausgewertet werden kann mit Hilfe eines Imaging-System und die dazugehörige Analyse-Software.

Introduction

Infektionen der Atemwege, die durch Viren oder Bakterien verursacht weiterhin eine der häufigsten ambulant erworbenen oder klinische Probleme verursachen etwa ein Drittel aller weltweit Todesursache weltweit. Die wichtigsten Bakterienarten sind Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae 2. Allerdings sind diese Bakterienarten in der Regel übliche Bestandteile der natürlichen Atemwege Flora. Somit ist die bakterielle Schlitten auch gewisse Gefahr einer invasiven Erkrankung und je nach der Immunstatus oder Prädispositionen der Individuen. Die asymptomatischen Besiedlung auf invasive Infektionen ausgelöst. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Bei gesunden Personen S. pneumoniae (Pneumokokken) sind oft asymptomatisch und harmlos Kolonisatoren der oberen Atemwege, wo sie mit nicht-pathogener Bakterien gegender ansässigen Flora, sondern auch mit Erregern wie Haemophilus spp. oder Staphylococcus aureus und die erste Zeile des menschlichen Immunabwehr. Wagen am höchsten sind bei jungen Kindern (37%) und sogar noch höher im überfüllten Tagesstätten (58%) 3-5. Die jüngste Bevölkerung und ältere Menschen, Erhalt der Pneumokokken über Aerosol-Übertragung von Nasen-Rachen-Sekrete Träger und 6, gehören zu den Risikogruppen und die Impfung mit einem der Pneumokokken-Konjugat-Impfstoffe (PCV10 oder PCV13 bei Kindern und 23-valenten Polysaccharid PPSV23 bei Erwachsenen) ist in den Vereinigten Staaten (US) und vielen europäischen Ländern 4 empfohlen. Die PPSV23 deckt Serotypen für ~ 90% der Pneumokokken-Bakteriämie Krankheiten in den USA und Europa, so effizient verhindert invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) bei Erwachsenen verantwortlich, während die PCV decken die häufigsten Serotypen bei Kindern. Folglich durch Impfstoff-Typen (VT) sind IPD reduced aber nonvaccine Serotypen Anzeige eine hohe Virulenz Potenzial und die Antibiotika-Resistenz haben 4,7-12 entstanden. Der Nasenrachenraum als Reservoir ist der Ausgangspunkt für Pneumokokken zu den Nasennebenhöhlen oder Mittelohr Einleitung schädlicher lokaler Infektionen verbreiten. Noch wichtiger ist, Pneumokokken direkt über die Atemwege bis zu den Bronchien und der Lunge, was zu lebensbedrohlichen CAP 4,13 verbreiten. Lungenentzündungen sind oft mit Gewebe-und Barriere Zerstörung begleitet, so dass die Erreger in die Blut verbreitet und verursacht IPD. Inzidenz von GAP und IPD höchsten sind bei immungeschwächten Personen oder an den Extremen der Alters 4,13. Die für die Umwandlung von einem kommen auf einen Erreger mit hoher Virulenz verantwortlich Umstände sind noch immer umstritten. Doch neben Veränderungen in der Wirtsempfindlichkeit und evolutionäre Anpassung begleitet mit höheren Virulenz und die Zunahme der Antibiotika-Resistenzen wurden vorgeschlagen, um einen entscheidenden Einfluss auf pne habenumococcal Infektionen 14-16.

Der Erreger ist mit einer Vielzahl von Adhäsine Vermittlung innigem Kontakt an Epithelzellen der Schleimhaut dotiert. Nach Überwindung der Atemwege Schleim, ist die Einhaltung Pneumokokken an Wirtszellen über direkte Interaktionen der Oberfläche exponierte Adhäsine mit zellulären Rezeptoren und durch die Nutzung extrazellulären Matrixkomponenten oder Serumproteine ​​als Brückenmoleküle 4,17,18 erleichtert. So vielseitig Erreger Pneumokokken sind auch mit Faktoren in Umgehung der Immunabwehr beteiligten Mechanismen ausgestattet. Darüber hinaus haben sie die Fähigkeit, sich an verschiedene Wirts Milieus wie der Lunge, Blut und Rückenmarksflüssigkeit (CSF), jeweils 5,17,19,20 anzupassen.

Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren auf die Pathogenese und entzündlichen Wirtsreaktionen in experimentellen Tiermodellen der Pneumonie, Bakteriämie sucht oder Meningitis 21-25. Obwohl er ein humanes Pathogen, wir sind diese Modellell-gegründet, um Pneumokokken Gewebetropismus, Virulenz Mechanismen oder Protektivität der Pneumokokken-Impfstoff-Kandidaten zu entziffern. Der genetische Hintergrund des Inzucht-Mausstämmen bestimmt die Empfindlichkeit gegen Pneumokokken. BALB / c-Mäuse intranasal mit Pneumokokken infiziert waren resistent zu sein, während CBA / Ca und SJL-Mäuse waren empfindlich gegen Pneumokokken-Infektionen 22. Dies impliziert, dass, ähnlich wie beim Menschen, den genetischen Hintergrund und die Abwehrmechanismen des Wirts zu bestimmen, das Ergebnis der Infektion. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um den Widerstand Loci im Genom der Mäuse weniger anfällig für Pneumokokken-Infektionen zu entwirren. Die Ergebnisse wurden auf Veränderungen in vivo Virulenz Protokolle geführt. Anstelle der Inzucht BALB / c-Mäuse in der Vergangenheit oft verwendet, werden die sehr anfällig CD-1/MF1 outbred Mausstämme heutzutage oft verwendet, um die Wirkung von loss-of-function Pneumokokken Virulenz oder Fitness Faktoren 26-28 studieren. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeitbiolumineszierender Pneumokokken und optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht die Echtzeit-Biolumineszenz bioimaging von Infektionen. In Pneumokokken die optimierte luxABCDE Gen-Kassette (Plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) hat sich zu einem einzigen Integrationsstelle des Chromosoms durch Transposon-Mutagenese eingeführt worden ist. Biolumineszenz Pneumokokken wurden eingesetzt, um die Dämpfung des Pneumokokken-Mutanten in der Virulenz oder Fitness-Faktoren und ihre Translokation von einem zu einem anderen anatomischen Ort 26,28-31 mangelhaft zu beurteilen.

Hier stellen wir ein Protokoll für die bioimaging der Pneumokokken-Infektionen in einem Maus-Pneumonie oder Sepsis-Modell. Amplifikation und Verbreitung von Biolumineszenz Pneumokokken in intranasal oder intraperitoneal infiziert Mäuse leicht mit der Zeit unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems und des gleichen Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die hier beschriebenen Tierinfektionsversuche müssen in strikter Übereinstimmung mit den örtlichen und internationalen (zB Europäische Gesundheitsgesetz des Bundes für Labortierkunde Verbände (FELASA)) Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren durchgeführt werden. Die Versuche müssen von der lokalen ethischen Pension und Institutional Animal Care Committee genehmigt werden. Alle Experimente mit S. pneumoniae im Labor oder Tierinfektionen sind in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt.

1. Vorbereitung der Infektions Auf Biolumineszenz Pneumocococi

  1. Vorbereitung stock Pneumokokken Kulturen in Todd-Hewitt-Brühe mit 1% (w / v) Hefeextrakt und einer Endkonzentration von 20% Glycerin für die Wartung bei 80 ° C ergänzt
  2. Platte eine kleine Menge an Tiefkühl Lager Pneumokokken-Kultur auf eine Blut-Agar-Platte und Inkubation der Bakterien für 10 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. Ter Blut-Agar-Platte enthält die geeigneten Antibiotika wie Kanamycin (150 ug / ml) für die Transposon-Insertion des luxABCDE Genkassette in das Genom.
  3. Unter pflegen eine frische Kolonie auf eine neue Blut-Agar-Platte für maximal 10 Stunden.
  4. Impfen THY-Medium mit 10% (v / v) hitzeinaktiviertem (30 min bei 56 ° C) fetales Rinderserum (FBS) mit Pneumokokken ergänzt und starten Sie die Kultur auf eine OD 600 von 0,05 bis 0,07.
  5. Pneumokokken Inkubieren ohne Schütteln bei 37 ° C und 5% CO 2, bis die Kultur eine OD 600 von 0,35-0,40 erreicht. Das Wachstum wird zwischen 3-4 Stunden dauern.
  6. Pneumokokken Ernte durch Zentrifugation bei 3.750 × g für 10 min und Resuspendieren Biolumineszenz Pneumokokken in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS) mit 0,5% FBS ergänzt.
  7. Einstellen des Inokulums auf die gewünschte Konzentration in PBS/10% FBS. Die Infektionsdosis ist abhängig von der Pneumokokkenstamm verwendet und den genetischen Hintergrund der micE. Um intranasal mit S. infizieren outbred CD-1-Mäuse pneumoniae D39 lux die Infektion Dosis bis 1 × 10 7 CFU in einer Suspension von 20 ul mit 90 Einheiten Hyaluronidase ergänzt eingestellt werden. Schütteln oder Wirbel Pneumokokken, da dies Autolyse auslösen.
  8. Überprüfen der Inokulum-Konzentration durch Plattieren 10fache serielle Verdünnungen auf Blut-Agar-und Auszählung der Kolonien nach dem Wachstum über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2.
  9. Überprüfen der Biolumineszenz des Pneumokokken Inokulum durch Messung der Biolumineszenz unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems.

2. Die intranasale und intraperitoneale Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz Pneumokokken

  1. Verwenden weiblichen outbred Mäuse in dem Alter von 7-10 Wochen für die akute Lungenentzündung und Sepsis-Modell. Das Gewicht dieser Mäuse sollte zwischen 20-30 g bestimmt.
  2. Mäuse anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin. Bereiten Sie eine Mischung 1,0 mgKetamin und Xylazin 0,1 mg in 100 &mgr; l sterilem 0,9% (w / v) Natriumchlorid-Mäuse mit einem Körpergewicht von 20 g. Dies ist konsistent mit einer Dosis von 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht für Xylazin. Um genau zu sein, wiegen Mäuse vor der Injektion von Anästhetika.
  3. Injizieren Sie die Mischung in die Bauchhöhle und legen die Tiere zurück in den Käfig, bis die Narkosemittel wirken und die Tiere narkotisiert sind. Die Atmung von Mäusen wird sehr langsam und regelmäßig. Mäuse müssen vollständig narkotisierten, so dass die intranasale Impfung und Inhalation der Bakteriensuspension werden in Niesen und damit Verlust von Inokulum führen. Dies kann durch Einklemmen der Maus am Ende ihres Schwanzes untersucht werden, eine vollständig narkotisierten Maus Reaktions fehlt.
  4. Vorsichtig holen ein narkotisierten Maus und halten Sie die Maus zwischen den Fingern und Daumen mit der Nase aufrecht (Abbildung 1).
  5. Verwenden Sie eine Pipette mit langen, schmalen Spitzen (Gel-LoaderTipps) und Drop Biolumineszenz Pneumokokken in mehreren kleinen Tröpfchen auf der Nase (10 ul / Nasenloch) der Maus 26-29. Die Maus wird unfreiwillig einatmen der Bakterien. Halten Sie die Maus 1-2 min aufrecht und beobachten, ob die Maus niest oder hält den Impfstoff.
  6. Infect 7-10 Wochen alten CD-1-Mäuse intranasal mit einer Infektionsdosis von 1 x 10 7 oder 7,5 x 10 7 Pneumokokken des Stammes D39 und TIGR4 jeweils um die Infektion in Echtzeit zu überwachen. Die Nachweisgrenze für das System ohne Absorption durch das Wirtsgewebe ist etwa 1 x 10 6 biolumineszenten Bakterien.
  7. Infect Mäusen intraperitoneal (IP) zu bewerten und BioImage Virulenz von Pneumokokken in einem Sepsis-Mausinfektionsmodell. Verwenden 5 x 10 3 CFU in 100 &mgr; l-Stamm D39 und 1 x 10 4 Dehnungs TIGR4. Mäuse werden nicht bei der Verwendung der IP-Route betäubt.
  8. Impfen Kontrollmäusen mit PBS.
    Figur 1 Fig. 1 ist. Intranasale Infektion von CD-1-Mäusen mit S. pneumoniae. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

3. Visualisierung Pneumokokken-Verbreitung in die Lunge und Blut Mit dem Imaging System

Bild Verbreitung von Pneumokokken nach der intranasalen Infektion der weiblichen outbred CD1-Mäusen in Echtzeit unter Verwendung einer in-vivo-Imaging-System.

  1. Schalten Sie die Imaging-System und starten Sie die Bildanalyse-Software auf dem vorkonfigurierte Computer.
  2. Das Abbildungssystem automatisch initialisiert und die CCD-Kamera thermo bis 90 ° C, bevor es aktiv abgekühlt wird.
  3. Die Einstellungen und Binning hängen von der Anzahl der Mäuse gemessengleichzeitig und auf die Stärke der biolumineszenten Signals. Das Sichtfeld (FOV), um die Biolumineszenz der Tiere zu überwachen ist variabel und reicht die Vergrößerung zwischen einem FOV von 22,5 cm bis zu fünf Mäuse zu messen, und ein FOV von 3,9 cm, eine einzelne Maus oder Teile des Tieres, wie die Brust messen oder Kopf.
  4. Verwenden routinemäßig eine Belichtungszeit von 1 min, einem mittleren Grad von Binning und einem FOV von 22,5 cm (Satz D). Zunächst wählen Sie die Leuchtbildmodus und legen Sie die Bildparameter dann.
  5. Die Emission des Signals auf dem Bakterienstamm und Mausstamm verwendet und das Pigment der Maus ab. Rasur der Brust von Mäusen bei Verwendung z. B. C57BL / 6 Mäusen, was vorteilhaft sein kann, wenn die Abbildung der Entwicklung von Lungenentzündung in diesen Mäusen.
  6. Bild infizierten Mäusen in vorgewählten Zeitintervallen. Messung der Biolumineszenz von Mäusen in der akuten Lungenmodell in zeitlichen Abständen von maximal 8-12 Stunden. Überwachung auch das Wohlergehen von infizierten Mäusen durch observing ihr Aussehen, das Verhalten und die Bestimmung der Gewichtsabnahme.
  7. Betäuben Mäuse in der Suchtkammer des Anästhesiesystems der Bildgebungsgeräte vor den Messungen in der Kammer. Starten Inhalation eines Gemisches von Isofluran und Sauerstoff und warten, bis die Mäuse atmen Sie langsam und regelmäßig.
  8. Zeigen betäubt Tiere in der bildgebenden Kammer des Systems und halten Mäuse in der Rückenlage. Die CCD-Kamera an der Oberseite der Kammer wird dann die Bild murinen Atemwege.
  9. Legen Sie die Tiere mit der Nase in den Röhren, um ein Einatmen der Anästhetika ermöglichen.
  10. Isofluran Eintrag in die Abbildungskammer über eine Gasleitung darf Narkose aufrecht zu erhalten.
  11. Um die CCD-Kamera auf der Oberseite der Kammer zu aktivieren und Biolumineszenz-optische Bildgebung, drücken Sie "Acquire" in der Bildbearbeitungssoftware starten. Sofort eine Fotografie der Mäuse in der geschlossenen Kammer auf dem Bildschirm erscheint. Nach einer Minute Messung eine Überlagerung der Biolumineszenz Daten und das Foto gezeigt.
  12. Stoppen Narkose nach der Bildüberlagerung im Fenster der Software angezeigt wird, und setzen die Mäuse wieder in ihre Käfige.
  13. Mäuse werden für die Wiederherstellung überwacht.
    Figur 2
    Abbildung 2. Anästhesie und Überwachung von Mäusen mit Biolumineszenz Pneumokokken mit der Anästhesie und IVIS IVIS Spectrum System auf. A) Die IVIS Spectrum Imaging-System. B) Die IVIS Anästhesiesystem mit dem Brutraum. C) Mäuse in der Inkubation Kammer betäubt infiziert . D) Mäuse innerhalb der IVIS Spectrum Imaging Kammer mit ihrer Nase Einatmen der Narkose entfernt._blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

4. Quantifizierung und Bewertung der Biolumineszenz von Mäuse Infizierte mit Biolumineszenz S. pneumoniae

  1. Bestimmen der Intensität der Biolumineszenz Mäusen oder von einem ausgewählten Bereich der Mäuse durch die Quantifizierung der Gesamtphotonenemission (Photonen / sec) unter Verwendung der Bildanalyse-Software.
  2. Verwenden Sie die Werte der Photonenemission, die in einer Excel-Datenblattes sind, um eine Grafik erstellen. Da die Datenvariation ist oft hoch in den gruppierten Mäusen, erzeugen eine Box-Whisker Diagramm, um die Unterschiede in den Mäusen, die mit den verschiedenen Pneumokokken-Stämmen infiziert anzuzeigen.
  3. Stellen die Photonen pro Mäusen oder alternativ die Ergebnisse als Mittelwert der Strahldichte (Photonen / sec / cm 2 / sr) eines ausgewählten Bereichs.
  4. Die Messdaten von ROI (Region-of-Interest) in Photonen-Modus kann quantitativ über verschiedene verglichen werden, in vivo Imaging-Systeme mit unterschiedlichen kamra-Einstellungen, da die Messungen in Einheiten der Ausstrahlung automatisch die Kameraeinstellungen (zB Integrationszeit, Binning, f / Stop, und Feld) zu berücksichtigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der Erwerb und die Aufnahme von Methionin ist von zentraler Bedeutung für Pneumokokken zu Fitness in ihren Gast Nische 32,33 zu erhalten. Die Methionin-ABC-Transporter-Lipoprotein in D39 von der SPD _ 0151 Gen (TIGR4: sp_0149) codiert und nannte MetQ 32. Pneumokokken weiter produzieren Methionin-Biosynthese-Enzyme (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete und metF). Das Fehlen von Methionin in einem chemisch definierten Medium beeinflusst das Wachstum von Pneumokokken und ähnliche, den Mangel an Methionin Bindungs ​​Lipoprotein MetQ beeinträchtigt die Aufnahme von Methionin 32,33. Dieser Mangel könnte durch den Zusatz von hohen Konzentrationen an Methionin wiederhergestellt werden. In den Experimenten der Maus Kolonisation Mangelmutante MetQ war nicht in der Virulenz als Koinfektion in Experimenten mit dem isogenen Wildtyp gezeigt abgeschwächt, während der Mangel an MetQ gedämpft Pneumokokken in Mausmodellen der Sepsis und Pneumonie, wie durchBestimmung der Bakterienlast 32. Echtzeit unter Verwendung des optischen Bioimaging welche hier IVIS Spectrum ermöglicht die Kontrolle der Vermehrung und Verbreitung von Bakterien in einem infizierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten.

In dem hier gezeigten Beispiel haben wir die Wirkung des Methionins Bindungs ​​Lipoprotein MetQ auf Kolonisation und Virulenz durch Anwenden der akuten Lungeninfektion Maus-Modell untersucht. CD-1 outbred Mäusen (n = 10) wurden intranasal mit 1 x 10 7 Bakterien der Wildtyp-Stamm infiziert S. pneumoniae D39 Lux (PN149) oder seine isogene Mutante Δ D39 lux metQ (Tabelle 1). Die metQ Mutante (PN252) wurde durch Insertion-Deletion Mutagenese des Gens in metQ Biolumineszenz D39 Pneumokokken errichtet. Daher wurden die metQ Gen 5'-Sequenz und die 3'-Sequenz durch PCR unter Verwendung der Primer 382 und 385 verstärkt. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor kloniert pGEMT-einfach, das Plasmid P559 (Tabelle 1) führte. Durch inverse PCR unter Verwendung der Primer 383 und 384 (Tabelle 2) die metQ Sequenz (nt 58 bis nt 777) entfernt und durch eine Erythromycin-Resistenz-Gen-Kassette (ermB) durch PCR unter Verwendung des Plasmids pE89 (Tabelle 1) als DNA-Vorlage ersetzt und das Primerpaar ermB_105/ermB_106 (Tabelle 2). Das resultierende Plasmid P563 wurde in 34 Pneumokokken als zuvor mit Kompetenz-stimulierendes Peptid-1 transformiert. Mutanten in der Lipoprotein MetQ (Spd_0151) wurden in THY oder auf Blut-Agar-Platten mit Erythromycin (5 ug / ml) ergänzt angebaut.

Der Gesundheitszustand der Mäuse wurde kontinuierlich überwacht. Die Tiere wurden getötet, wenn die keine richtige Antwort oder Anzeichen von Morbidität. Darüber hinaus Pneumokokken-Verbreitung aus dem Nasenrachenraum in die Lunge und Blut, was zu einer schweren Lungenentzündung und Sepsis, war Überwachungrot durch die Messung der Biolumineszenz alle acht Stunden. In jeder Gruppe infizierter Mäuse 7 von 10 Mäusen entwickelte schwere Krankheitssymptome, während die anderen 3 Mäuse zeigten keine Biolumineszenz und überlebten (Fig. 3A). Mäuse erfolgreich mit dem Biolumineszenz-Wildtyp infiziert entwickelt D39 Lux 32 Stunden nach der Infektion schwere Lungeninfektionen, die innerhalb von 8-16 Stunden zu einer Sepsis (3A) fortschreitet. Zum Zeitpunkt 96 Stunden erlag alle Mäuse, die Lungenentzündung und Sepsis nach Infektion mit D39 Lux entwickelt hatte. Die Verlust-Funktion der Methionin-Lipoprotein-Bindung die Virulenz von Pneumokokken wesentlich beeinträchtigt. Nach 32 Stunden nur eine Maus mit der Mutante infiziert metQ zeigte eine schwache Infektion der Lunge, die anderen zeigten keine Anzeichen von Krankheit und Lungenentzündung. Jedoch nach 48 h schwere Lungeninfektionen wurde auch in Mäusen, die mit der Mutante infiziert ersichtlich. Als Ergebnis entwickelten die Mäuse 72 Stunden Sepsisnach der Infektion und wurde später als 72 Stunden nach der Infektion moribund, die zeigen, dass in der akuten Lungenentzündung Infektionsmodell der Mangel an MetQ dämpft Pneumokokken.

Tabelle 1. Stamm und Plasmid-Liste.

Tabelle 1

Tabelle 2. Primer-Liste. Restriktionsstellen sind unterstrichen.

Primer Zweckbestimmung Primer Namen Sequenz (5'-3 ')
Insertion-Deletionsmutagenese
Amplifikation von sp_0149 + 5 'und
3 'flankierenden Region
382
385
5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 '
5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 '
Inverse PCR von sp_0149 + 5 'und
3 'flankierenden Region (pGEMTeasy)
383

384
5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT
GCGACTGTAG-3 '
5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA
CCACACAGA-3 '
Antibiotika-Kassette Verstärkung
Erythromycin (ermB) ermB_105

ermB_106 		5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA
ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 '
5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT
GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 '
ntent "> Die Biolumineszenz gemessen mit der Bildverarbeitungssoftware wurde ebenfalls berechnet. Ähnlich der Visualisierung der Infektion, die Quantifizierung der biolumineszenten Fluss zeigte signifikante Unterschiede zwischen Wildtyp infiziert und metQ infizierten Mäusen 32 und 40 Stunden nach der Infektion. Somit kann die Verlust-Funktion MetQ dämpft Pneumokokken und einer signifikanten Verzögerung von invasiven Infektionen, aber nicht in avirulenten Bakterien führen.

Fig. 3
Abbildung 3. Überwachung von Pneumokokken-Verbreitung in Mäusen nach intranasaler Infektion. A) Biolumineszenz optischen Abbildungs ​​von Mäusen intranasal mit D39 Lux oder isogenen Mutanten D39 luxΔmetQ. B) infiziert Die Werte der Intensitäten der Biolumineszenz gruppierten Mäusen (n = 10) gezeigtfür angegebenen Zeitpunkten in einer Box Whisker-Diagramm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle Versuche an Tieren durchgeführt haben, die von den lokalen Behörden und Ethikkommissionen genehmigt werden. Bei in vivo Experimenten ist die Infektion bakterielle Belastung in den verschiedenen Wirtsnischen der infizierten Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt. Unter diesen experimentellen Bedingungen die Tiere, die vor der Trennung der Bakterien aus dem Blut, des Nasopharynx, bronchoalvelar Spülung oder Organen wie der Lunge, Milz und Gehirn geopfert werden. Um die Anzahl der Bakterien pro Host Nische Berechnung und Beurteilung der Wirkung von bakteriellen Faktoren auf die Virulenz, isoliert verfolgt werden, die durch bakterielle das Blut oder Organe erholt haben und Beschichtung auf festen Medien. Die bakterielle Belastung wird dann durch Auszählung der KBE quantifiziert. Um statistisch signifikante Daten zu erreichen Jeder Zeitpunkt muss eine Gruppe von Mäusen, die unter bestimmten experimentellen Bedingungen führt zu Schwierigkeiten bei der Handhabung des Versuchs aufgrund der hohen Anzahl von Mäusen.

ove_content "> Im Gegensatz dazu ist die Echtzeit-Bio-Imaging Verfahren eine weniger zeitintensive Ansatz und jede einzelne Bakterien infizierten Maus kann mehrmals über einen Zeitraum überwacht werden. Das bildgebende Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Bakterien im Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion oder aber über einen längeren Zeitraum. Außerdem ist die Biolumineszenz mit der optischen Bildanalyse-Software gemessen weiteren ermöglicht die Quantifizierung von Photonen, die von dem infizierten Tier abgegeben wird. Dies kann zu einem definierten Bereich der Maus oder des gesamten begrenzt Tier berücksichtigt werden kann. Bei den in vivo Experimenten Pneumokokken-Infektion infiziert Mäuse in Intervallen von 8-12 Stunden überwacht werden, da die Ausbreitung von Pneumokokken schnell in outbred CD-1-Mäusen voran. Die Echtzeit-Bildgebung eingesetzt werden visualisieren Transmigration der Pneumokokken aus dem Nasen-Rachenraum in die Lunge und Blut, und zusätzlich die Multiplikation von Pneumokokken im Blutnach intraperitonealer Infektion kann durch die dramatische Zunahme der Biolumineszenz Intensität 26,28,29 überwacht werden.

Beim Vergleich der Virulenz Potenzial von Wildtyp-Pneumokokken und isogenen Mutanten ist es wichtig, zunächst die Wirkung des Verlust-Gen unter in vitro Kulturbedingungen zu testen. Wachstumsunterschiede zwischen den Wildtyp-Bakterien und Mutanten, insbesondere in chemisch definiertem Medium, bereits auf eine verminderte bakterielle Fitness 26. Somit wird die Dämpfung unter in vivo-Bedingungen beobachtet mit veränderter Physiologie während der Kolonisation und invasive Infektionen mit Pneumokokken weniger robust verbunden.

Es muss jedoch erwähnt werden, dass dieser Abbildungstechnik ist oft nicht ausreichend, um die Wirkung von Gen-Knockouts auf Pneumokokken Virulenz demonstrieren. Ähnlich wie bei anderen pathogenen Bakterien Pneumokokken sind vielseitig Mikroorganismen und haben vielseitige Mechanismen t entwickelto Begegnung der Host-und dem Immunsystem ausweichen. Folglich Pneumokokken erzeugen einerseits Proteine ​​mit vielfältigen Funktionen wie die Adhäsin PspC und auf der anderen Seite sind sie mit mehreren Proteinen, die ähnliche Funktionen können so den Defekt eines Proteins aufgrund von Mutationen 4,17,18 kompensieren dotiert , 35. In diesen Szenarien anderen in vivo Infektionsversuche wie die Koinfektion Ansatz muss eingesetzt werden, um die Wirkung der Verlust-Protein-Funktion in der Mutante zur Besiedelung oder invasive Infektionen 27,28 entziffern werden.

Pneumokokken besiedeln und infizieren bevorzugt Menschen wurden aber auch von Haustieren oder Zootiere 4,36,37 isoliert. Um die Auswirkungen der Virulenz entziffern oder Fitness-Faktoren Mausinfektionsmodellen verwendet werden. Allerdings sind nicht alle Pneumokokken-Stämme Maus virulent, und noch wichtiger, die Anfälligkeit von Mäusen ist abhängig vom genetischen Hintergrund der Tiere 22. PneumokokkenVirulenz-Studien und Schutzstudien werden heute mit CD-1 outbred Mäusen durchgeführt. Jedoch Knockout-Mäusen oder transgenen Mäuse sind auch von großem Interesse für die Rolle von Wirtsfaktoren für invasive Pneumokokkenerkrankungen zu entschlüsseln. Die Knockout-oder transgene Mäuse werden oft in Maus-Stämme, wie C57/BL6 oder Balb / c erzeugt. Diese Mausstämme sind weniger anfällig gegen Pneumokokken-Infektionen und hohen Infektionsdosen sind erforderlich, um eine tödliche Dosis, 50% (LD 50) zu erhalten. In Abhängigkeit von der Infektionsdosis dieser Widerstand von Mäusen kann Echtzeit Bioimaging der Pneumokokken-Verbreitung in die Lunge oder Blut beeinträchtigen, da Pneumokokken sind begrenzt, in einem für den Nachweis erforderlich durch das Abbildungssystem Weise vermehren. Um diese Einschränkung zu überwinden, und um die Verbreitung Bild in Echtzeit zu sein, müssen hohen Infektionsdosen verwendet werden. Das Risiko dieser Ansatz könnte sein, dass Unterschiede in der Anfälligkeit Host kann nicht geprüft werden wie die Verbreitung zu schnell fortschreitet.

über die intranasale oder intraperitoneale Injektion infiziert. Dieser Ansatz ist besonders geeignet, um die Virulenz Potential zwischen Wildtyp und Mutanten von S. vergleichen pneumoniae.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Forschung im Labor wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Medical Genomics Infektion (FKZ 0315828A) SH unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1  
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2  
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A  
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2  
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376  
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151  
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500 mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany  
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany  
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok syringes with needle
Gel Loader Tips PeqLab 81-13790 MµltiFlex Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001  
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany  
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany  
Oligonucleotides  Eurofins MWG, Ebersberg, Germany  
Qiaprep Spin Midiprep Kit  Qiagen, Hilden, Germany 27104  
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106  
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
IVIS Spectrum Imaging System  Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
  2. WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
  3. Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
  4. Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
  5. Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
  6. Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
  7. Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
  8. Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
  9. Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
  10. Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
  11. Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
  12. Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
  13. Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
  14. Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
  15. Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
  16. Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
  17. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
  18. Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
  19. Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
  20. Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
  21. Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
  22. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
  23. Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
  24. Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
  25. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
  26. Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
  27. Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
  28. Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
  29. Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
  30. Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  31. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
  32. Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
  33. Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
  34. Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
  35. Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
  36. Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
  37. vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
  38. Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).

Tags

Infektion Gram-positiven Bakterien, Lungenentzündung bakterielle Atemwegsinfektionen Tiermodelle ambulant erworbener Pneumonie invasive Pneumokokken-Erkrankungen Pneumokokken Bioimaging Virulenzfaktoren Verbreitung Biolumineszenz IVIS Spectrum
Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz,… More

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter