Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/51174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department Genetics of Microorganisms, Interfaculty Institute for Genetics and Functional Genomics, University of Greifswald

Summary

Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen forårsaker alvorlig smittsom lungebetennelse og ansvarlig for over 2 millioner dødsfall på verdensbasis. Virkningen av bakterielle faktorer involvert i fitness eller virulens kan overvåkes i sanntid i en akutt mus lungebetennelse eller bakteriemi modell med selvlysende bakterier.

Abstract

Lungebetennelse er en av de største helsevesenet problemer i utviklingsland og industrialiserte land, og er forbundet med betydelig sykelighet og dødelighet. Til tross for fremskritt i kunnskap om denne sykdommen, tilgjengeligheten av intensivavdelinger (ICU), og bruk av potente antimikrobielle midler og effektive vaksiner, dødeligheten forbli høy en. Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen av smittsom lungebetennelse (CAP) og en av de mest vanlige årsaker til bakteriemi hos mennesker. Dette patogen er utstyrt med en armamentarium av overflateeksponert adhesiner og virulens faktorer som bidrar til lungebetennelse og invasiv pneumokokksykdom (IPD). Vurderingen av in vivo rollen bakterielle fitness eller virulens faktorer er av største viktighet å rakne S. pneumoniae patogenitet mekanismer. Murine modeller av lungebetennelse, bakteriemi og meningitt blir brukt for å fastslå effekten av pneumokokk faktorer ved forskjellige stadier av infeksjonen. Her beskriver vi en protokoll for å overvåke i sanntid pneumokokk formidling i mus etter intranasal eller intraperitoneal infeksjoner med selvlysende bakterier. Resultatene viser at formering og spredning av pneumokokker i nedre luftveier og blod, som kan bli visualisert og evalueres ved hjelp av et avbildningssystem og den tilhørende analyse-programvare.

Introduction

Luftveisinfeksjoner forårsaket av virus eller bakterier er fortsatt en av de vanligste smittsom eller kliniske problemer på verdensbasis forårsaker om lag en tredjedel av alle dødsfall på verdensbasis. De viktigste bakteriearter er Haemophilus influenzae og Streptococcus pneumoniae to. Imidlertid er disse bakteriearter er normalt vanlige bestanddeler av den naturlige luftveis flora. Dermed bakteriell vogn er også av viss risiko for invasiv sykdom og avhengig av immunstatus eller predisposisjoner av enkeltpersoner. Den asymptomatisk kolonisering utløses til invasive infeksjoner. Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen av smittsom lungebetennelse (CAP) og en av de vanligste årsakene til bakteriemi hos mennesker. Hos friske individer S. pneumoniae (pneumokokker) er ofte asymptomatiske og ufarlig koloniherrer i de øvre luftveiene, hvor de blir konfrontert med nonpathogenic bakterierav de fastboende flora, men også med patogener som Haemophilus spp.. eller Staphylococcus aureus og den første linjen av menneskets immunforsvar. Vogn priser er høyest hos unge barn (37%) og enda høyere i løpet av overfylte barnehager (58%) 3-5. Den yngste befolkning og eldre, mottar pneumococcus via aerosol overføring fra operatører og svelgsekreter 6, hører til de høye risikogrupper og vaksinasjon ved hjelp av en av konjugert pneumokokk vaksine (PCV10 eller PCV13 hos barn og 23-valent polysakkarid PPSV23 hos voksne) anbefales i og mange europeiske land 4 USA (US). Den PPSV23 dekker serotyper ansvarlige for ~ 90% av bakteriemi pneumokokksykdommer i USA og Europa, og hindrer dermed effektivt invasiv pneumokokksykdom (IPD) hos voksne, mens de PCVs dekke de mest utbredte serotyper hos barn. Følgelig IPD grunn vaksinetyper (VT) er reduCED men nonvaccine serotyper viser en høy virulens potensial og antibiotikaresistens har dukket 4,7-12. Nasopharynx som reservoaret er utgangspunkt for pneumokokker å spre seg til bihulene eller mellomøret initiere skadelige lokale infeksjoner. Mer viktig, pneumokokker spres direkte via luftveiene til bronkier og lunge resulterer i livstruende CAP 4,13. Lungeinfeksjoner er ofte ledsaget med vev og barriere ødeleggelse, og dermed gjør den patogen å spre seg inn i blodet og forårsaker IPD. Forekomst av CAP og IPD er høyest hos immunsupprimerte personer eller på ytterpunktene av alder 4,13. De ansvarlig for konvertering fra en commensal til et patogen med høy virulens er fortsatt under debatt. Imidlertid, i tillegg til endringer i verts mottakelighet og evolusjonære tilpasning sammen med økt virulens, og økningen i antibiotiske motstandsverdier har blitt foreslått å ha en avgjørende virkning på PNEumococcal infeksjoner 14-16.

Den patogen er utstyrt med et mangfold av adhesiner som medierer intim kontakt å mucosal epitelceller. Etter surmounting luftveiene slim, er pneumokokk tilslutning til vertsceller tilrettelagt via direkte interaksjoner av overflateeksponert adhesiner med cellulære reseptorer og ved å utnytte ekstracellulære matrix komponenter eller serumproteiner som bridging molekyler 4,17,18. Som allsidig patogener pneumokokker er også utstyrt med faktorer involvert i unndragelse av vertens immunforsvarsmekanismer. Dessuten har de evnen til å tilpasse seg forskjellige verts miljøer slik som i lunge, blod og spinalvæske (CSF), henholdsvis 5,17,19,20.

Virkningen av bakterielle faktorer på patogenese og inflammatorisk vertsresponser er undersøkt i eksperimentelle dyremodeller av lungebetennelse, bakteriemi, eller hjernehinnebetennelse 21-25. Til tross for å være et menneskelig patogen, disse modellene er vill-etablert for å dechiffrere pneumokokk vev tropisme, virulensmekanismer, eller protectivity av pneumokokk vaksine kandidater. Den genetiske bakgrunnen til innavlede musestammer bestemmer mottakelighet for pneumokokker. BALB / c-mus intranasalt infisert med pneumococci ble funnet å være motstandsdyktige, mens CBA / Ca-og SJL mus var mer mottagelige mot pneumokokkinfeksjon 22. Dette medfører at, i likhet med mennesker, den genetiske bakgrunn og vertsforsvarsmekanismer bestemme resultatet av infeksjon. Derfor er ytterligere innsats er nødvendig for å løse motstand loci i genomet hos mus mindre utsatt for pneumokokkinfeksjoner. Funnene har ført til endringer i in vivo virulens protokoller. I stedet for den innavlede BALB / c mus ofte brukt i det siste, er de svært mottakelige CD-1/MF1 utavmusestammer i dag ofte brukt for å studere effekten av tap-av-funksjon pneumokokk virulens eller egnethet faktorer 26-28. Videre tilgjengelighetenbioluminescerende pneumokokker og optiske avbildningsteknikker gjør at sanntids Bioluminescens Bioimaging av infeksjoner. I pneumokokker den optimaliserte luxABCDE genet kassett (plasmid Paul-En Tn 4001 luxABCDE Km r) har blitt satt inn i en enkelt integrering stedet av kromosom ved transposon mutagenese. Bioluminescent pneumokokker har blitt ansatt for å vurdere demping av pneumokokk-mutanter mangelfull i virulens eller fitness faktorer og deres trans fra en anatomisk område til et annet 26,28-31.

Her gir vi en protokoll for Bioimaging av pneumokokkinfeksjon i en murine lungebetennelse eller blodforgiftning modell. Forsterkning og formidling av selvlysende pneumokokker i intranasalt eller intraperitonealt infiserte mus kan enkelt overvåkes over tid ved hjelp av en optisk imaging system og samme dyr ved ulike tidspunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dyr smitteforsøk er beskrevet her må utføres i henhold til de lokale og internasjonale (f.eks European Health Law of the Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA)) retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyr. Forsøkene må godkjennes av den lokale etiske styret and Institutional Animal Care Committee. Alle eksperimenter med S. pneumoniae i laboratoriet eller dyre infeksjoner er gjennomført i en klasse II biosikkerhet kabinettet.

En. Forberedelse av Infeksiøs lager av Bioluminescent Pneumocococi

  1. Forbered lagerpneumokokk kulturer i Todd-Hewitt-buljong supplert med 1% (w / v) gjærekstrakt, og en sluttkonsentrasjon på 20% glycerol for vedlikehold ved 80 ° C.
  2. Plate en liten mengde av dypfryst lager pneumokokk-kultur på en blod-agar-plate og inkuberes bakterier i 10 timer ved 37 ° C i 5% CO2. THan blod agarplate inneholder de riktige antibiotika slik som kanamycin (150 ug / ml) for transposon innsetting av kassetten luxABCDE genet i genomet.
  3. Sub-dyrke en frisk koloni på en ny blod agar plate i maksimalt 10 timer.
  4. Inokulere THY medium supplert med 10% (v / v) varme-inaktivert (30 min ved 56 ° C) føtalt bovint serum (FBS) med pneumokokker og start kulturen ved en OD 600 på 0,05 til 0,07.
  5. Inkuber pneumokokker uten omrøring ved 37 ° C og 5% CO2 inntil kulturen har nådd en OD 600 på 0,35 til 0,40. Veksten vil ta mellom 3-4 timer.
  6. Innhøstings pneumokokker ved sentrifugering ved 3750 xg i 10 min, og resuspender bioluminescent pneumokokker i fosfatbufret saltvann pH 7,4 (PBS) supplert med 0,5% FBS.
  7. Juster inokulum til den ønskede konsentrasjon i PBS/10% FBS. Infeksjonen dose avhenger av pneumokokk stamme brukt og den genetiske bakgrunnen for mike. Å infisere outbred CD-en mus intranasalt med S. pneumoniae D39 lux infeksjonen bør dosen justeres til en x 10 7 CFU i en suspensjon av 20 mL supplert med 90 stk hyaluronidase. Ikke rist eller vortex pneumokokker, siden dette vil utløse autolyse.
  8. Verifiserings inokulum konsentrasjon ved å plate 10 ganger serie-fortynninger på blodagar og telling av kolonier etter vekst over natten ved 37 ° C i 5% CO2.
  9. Kontroller Bioluminescens av pneumokokk pode ved å måle Bioluminescens ved hjelp av en optisk imaging system.

2. Intranasal og Intraperitoneal Infeksjon av Mus med Bioluminescent pneumokokker

  1. Bruk kvinnelige outbred mus i en alder av 7-10 uker for den akutte lungebetennelse og blodforgiftning modell. Vekten av disse musene bør være mellom 20-30 g.
  2. Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin. Lag en blanding 1,0 mgketamin og 0,1 mg xylazin i 100 ul steril 0,9% (w / v) natriumklorid til mus med en kroppsvekt på 20 g. Dette stemmer overens med en dose på 50 mg / kg kroppsvekt for ketamin og 5 mg / kg kroppsvekt for xylazin. For å være nøyaktig, veie mus før injeksjon av bedøvelse.
  3. Sprøyt røren i intraperitoneal hulen og plassere dyrene tilbake inn i buret før de anestetika handle og dyrene er narcotized. Breathing av mus vil bli veldig treg og regelmessig. Mus må være fullt narcotized, slik at intranasal inokulering og innånding av den bakterielle suspensjonen ikke vil resultere i nysing og dermed tap av inokulum. Dette kan vurderes ved å knipe musen på slutten av sin hale, en fullt narcotized musen vil reagere dårlig.
  4. Forsiktig plukke opp en narcotized mus og hold muse mellom fingrene og tommelen med nesen oppreist (Figur 1).
  5. Bruk en pipette med lange smale tips (Gel LoaderTips) og slippe bioluminescent pneumokokker i flere små dråper på de svelget (10 mL / nesebor) av musen 26-29. Musen vil ufrivillig inhalere bakteriene. Hold musen 1-2 min stående og observere om musen nyser eller holder pode.
  6. Infect 7-10 uker gamle CD-1 mus intranasalt med en infeksjonsdose på 1 x 10 7, eller 7.5 x 10 7 pneumokokker av stamme D39 og TIGR4, henholdsvis, for å overvåke infeksjon i sanntid. Deteksjonsgrensen for systemet uten absorpsjon av vertsvevet er omtrent 1 x 10 6 bioluminescent bakterier.
  7. Infisere mus intraperitonealt (IP) for å vurdere og bioimage virulens av pneumokokker i en sepsis mus infeksjon modell. Bruk 5 x 10 CFU 3 i 100 mL av stammen D39 og 1 x 10 4 av strekk TIGR4. Mus er ikke bedøves ved bruk av IP-rute.
  8. Vaksinere kontroll mus med PBS.
    Figur 1 Figur 1. Intranasal infeksjon av CD-en mus med S. pneumoniae. Klikk her for å se større bilde .

Tre. Visualisering Pneumokokk Formidling inn i Lung and Blood Bruke Imaging System

Bilde formidling av pneumokokker etter intranasal infeksjon av kvinnelige utav CD1 mus i sanntid ved hjelp av en in vivo imaging system.

  1. Slå på imaging system og starte bildeanalyse programvare ligger på preconfigurated datamaskinen.
  2. Den bildesystem initialiseres automatisk og CCD-kameraet er thermoelectrically avkjølt til 90 ° C før de blir aktivert.
  3. Innstillingene og binning avhenge av antall mus måltsamtidig og på styrken av bioluminescent signal. Den synsfelt (FOV) for å overvåke Bioluminescens av dyrene er variabel og forstørrelsen varierer mellom en FOV på 22,5 cm for å måle fem mus, og en FOV på 3,9 cm for å måle en enkelt mus eller deler av dyr slik brystet eller hode.
  4. Bruk rutinemessig en eksponeringstid på 1 min, en middels grad av binning, og en FOV på 22,5 cm (felt D). For det første velger selvlysende bildemodus og angi bildeparametere da.
  5. Utslipp av signalet kan avhenge av bakteriestammen og mus belastning anvendes, og pigment i mus. Barber brystet på mus ved bruk av f.eks C57BL / 6 mus, noe som kan være fordelaktig ved avbildning utviklingen av lungebetennelse hos disse mus.
  6. Bilde-infiserte mus ved prechosen tidsintervaller. Mål Bioluminescens til mus i den akutte lungemodell ved tidsintervaller på maksimalt 8-12 timer. Overvåk også velferd infiserte mus ved observing deres utseende, oppførsel, og fastsettelse av tap av vekt.
  7. Anesthetize mus i den narkotiske kammer av anestesi system av avbildningsutstyr før målingene i kammeret. Starter innånding av en blanding av isofluran og oksygen og vente til musene puste langsomt og regelmessig.
  8. Plasser bedøvede dyrene inn i avbildningskammeret av systemet og holde mus i liggende stilling. CCD-kamera på toppen av kammeret vil da bilde murine luftveier.
  9. Plasser dyrene med nesen inn i rør for å tillate innånding av bedøvelse.
  10. Isofluran inntreden i avbildningskammeret via en gasslange blir tillatt å opprettholde anestesi.
  11. For å aktivere CCD-kamera på toppen av kammeret og å starte bioluminescent optisk avbildning, trykk "Acquire" i bildebehandlingsprogrammer. Umiddelbart et fotografi av musene i det lukkede kammer vises på skjermen. Etter ett minutt med Måling en overlapping av Bioluminescens data og bildet vises.
  12. Stopp anestesi etter at bildet overlegg vises i vinduet av programvaren og sette musene tilbake i burene sine.
  13. Mus overvåkes for utvinning.
    Fig. 2
    Figur 2. Anestesi og overvåking av mus infisert med bioluminescent pneumokokker ved hjelp av IVIS anestesi og IVIS spektrum systemet, respektivt. A) IVIS spektrum avbildningssystem. B) Den IVIS anestesi systemet med inkubasjon kammeret. C) mus ble bedøvet i inkuberingen kammeret . D) Mus ligger innenfor IVIS Spectrum Imaging kammer med nesen inhalasjon av bedøvelse._blank "> Klikk her for å se større bilde.

4. Kvantifisering og Evaluering av Bioluminescence av mus infisert med Bioluminescent S. pneumoniae

  1. Bestem Bioluminescens intensiteter av mus eller av en valgt region av mus ved å kvantifisere det totale foton emisjon (fotoner / sekund) ved bruk av bildeanalyse-programvare.
  2. Bruk verdiene av foton emisjon som er gitt i et Excel-databladet for å forberede en graf. Siden dataene variasjon er ofte høy i de grupperte mus, generere en boks whisker grafen for å vise forskjellene i mus infisert med de forskjellige pneumokokkstammer.
  3. Gi fotoner pr mus eller alternativt resultatene som gjennomsnittet av utstråling (fotoner / sek / cm 2 / sr) for et valgt område.
  4. Måledata av ROI (region-of-interesse) i foton-modus kan kvantitativt sammenlignes på tvers av ulike in vivo imaging-systemer med ulik komra innstillinger, siden målingene i enheter av utstråling automatisk tar hensyn til kamerainnstillinger (f.eks integrering tid, binning, f / stop, og synsfelt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oppkjøpet og opptak av metionin er av sentral betydning for pneumokokker å opprettholde fitness i verts nisje 32,33. Den metionin ABC transporter lipoprotein er kodet i D39 ved spd _ 0151 genet (TIGR4: sp_0149) og oppkalt MetQ 32. Pneumokokker videre produsere metionin biosyntese enzymer (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete og METF). Mangelen på metionin i et kjemisk definert medium påvirker veksten av pneumokokker og lignende, mangelen av metionin binding lipoprotein MetQ svekket opptak av metionin 32,33. Denne defekt kan gjenopprettes ved tilsetning av høye konsentrasjoner av metionin. I mus koloniserings eksperimenter mutant mangelfull i MetQ ikke ble svekket i virulens som vist i coinfection eksperimenter med isogene vill-type, mens den manglende MetQ attenuert pneumokokker i musemodeller av sepsis og lungebetennelse som vist vedfastsettelse av bakteriemengde 32. Sanntids optisk Bioimaging hjelp av IVIS spektrum brukes her tillater overvåking av formering og spredning av bakterier i en enkelt infisert dyr ved ulike tidspunkt.

I eksempelet vist her, har vi vurdert effekten av metionin bindende lipoprotein MetQ på kolonisering og virulens ved å bruke den akutte lungebetennelse infeksjon mus modell. CD-en outbred mus (n = 10) ble smittet intranasalt med 1 x 10 7 bakterier av vill-type belastning S. pneumoniae D39 lux (PN149) eller dens Isogene mutant D39 lux Δ metQ (Tabell 1). Den metQ mutant (PN252) ble konstruert ved innsetting-sletting mutagenese av metQ genet i selvlysende D39 pneumokokker. Derfor ble det metQ genet, 5 'sekvensen og 3'sequence amplifisert ved PCR ved bruk av primerne 382 og 385. PCR-produktet ble klonet inn i vektoren PGEMT-lett, noe som resulterte i plasmid p559 (Tabell 1). Ved invers PCR ved bruk av primerne 383 og 384 (tabell 2) metQ sekvens (nt 58 til nt 777) ble fjernet og erstattet av en erytromycin-resistensgenet kassett (ermB) amplifisert ved PCR ved bruk av plasmid pE89 (tabell 1) som DNA-mal og den primerpar ermB_105/ermB_106 (tabell 2). De resulterende plasmid p563 34 ble forvandlet til pneumokokker som tidligere beskrevet ved hjelp av kompetanse-stimulerende peptid-1. Mutanter mangel i lipoprotein MetQ (Spd_0151) ble dyrket i THY eller på blodagarplater supplert med erytromycin (5 mikrogram / ml).

Helsetilstanden til musene ble kontinuerlig overvåket. Dyrene ble avlivet da viser ingen skikkelig respons eller tegn på sykelighet. Videre pneumokokk formidling fra nasopharynx inn i lungene og blod, noe som fører til alvorlig lungebetennelse og sepsis, ble monitorød ved å måle Bioluminescens hver åttende time. I hver gruppe av infiserte mus 7 ut av 10 mus utviklet alvorlige tegn på sykdom, mens de andre tre mus viste ingen bioluminescens og overlevde (figur 3A). Mus vellykket infisert med bioluminescent villtype D39 lux utviklet 32 timer etter infeksjon alvorlige lungeinfeksjoner, som utvikler seg i løpet av 8-16 timer til sepsis (figur 3A). På tidspunktet 96 hr alle mus bukket under som hadde utviklet lungebetennelse og blodforgiftning etter infeksjon med D39 lux. Den tap-av-funksjon av metionin binding lipoprotein signifikant nedsatt virulens av pneumokokker. Etter 32 timers bare ett muse infisert med metQ mutant viste en svak lungeinfeksjon, mens de andre viste ingen tydelige tegn på sykdom og lungebetennelse. Men etter 48 timers alvorlige lungeinfeksjoner ble også tydelig i mus infisert med mutant. Som et resultat av disse musene utviklet sepsis 72 hretter infeksjon og ble døende senere enn 72 timer etter infeksjon, noe som viser at det i den akutte lungebetennelse infeksjonsmodell mangel på MetQ demper pneumokokker.

Tabell 1. Strain og plasmid-listen.

Tabell 1

Tabell 2. Primer liste. Restriksjons nettsteder er understreket.

Primer tiltenkt bruk Primer navn Sekvens (5'-3 ')
Innsetting-sletting mutagenese
Forsterkning av sp_0149 + 5 'og
3 'flankerende region
382
385
5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 '
5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 '
Inverse PCR av sp_0149 + 5 'og
3 'flanker region (pGEMTeasy)
383

384
5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT
GCGACTGTAG-3 '
5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA
CCACACAGA-3 '
Antibiotika kassett forsterkning
erytromycin (ermB) ermB_105

ermB_106 		5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA
ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 '
5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT
GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 '
ntent "> Den Bioluminescens målt ved hjelp av bildebehandlingsprogrammet ble også beregnet. likhet med visualisering av infeksjonen, kvantifisering av bioluminescent flux viste signifikante forskjeller mellom villtype-infiserte og infiserte mus metQ 32 og 40 timer etter infeksjon. således tap-av-funksjon MetQ demper pneumokokker og resulterer i en betydelig forsinkelse av invasiv infeksjon, men ikke resulterer i avirulent bakterier.

Figur 3
Figur 3. Overvåking av pneumokokk formidling i mus etter intranasal infeksjon. A) Bioluminescent optisk avbildning av mus infisert intranasalt med D39 lux eller Isogene mutant D39 luxΔmetQ. B) Verdiene av Bioluminescens intensiteter av grupperte mus (n = 10) er vistfor angitte tidspunkter i en boks whisker graf. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle eksperimenter utført på dyr må være godkjent av lokale myndigheter og etikk provisjoner. I in vivo-smitteforsøk bakteriemengden i de forskjellige verts nisjer av infiserte dyr har til å bli bestemt ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon. Under disse eksperimentelle betingelser dyrene måtte ofres forut for isolering av bakterier fra blod, nasofarynks, bronchoalvelar kylling, eller organer som lunger, milt og i hjernen. For å beregne antall bakterier per vert nisje og vurdere effekten av bakterielle faktorer på virulens, blod eller organer må være isolert fulgt av bakteriell utvinne og platekledning på faste medier. Den bakteriemengde blir deretter kvantifisert ved telling av de CFU. For å oppnå statistisk signifikante data hvert tidspunkt trenger en gruppe mus, som under visse eksperimentelle betingelser fører til vanskeligheter med håndtering av eksperimentet på grunn av det høye antall mus.

ove_content "> I kontrast, i sanntid Bioimaging fremgangsmåte er en mindre tid-krevende metode og den enkelte bakterie-infiserte mus kan måles flere ganger i løpet av en tidsperiode. den avbildningsteknikk tillater visualisering av bakterier i dyr ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon eller til og med i en lengre tidsperiode. Videre Bioluminescens målt med optisk bildeanalyse-programvare muliggjør kvantifisering av fotoner som sendes ut fra det infiserte dyr ytterligere. Dette kan være begrenset til et definert område av musen eller hele dyr kan bli vurdert. I in vivo smitteforsøk pneumokokker-infiserte mus må overvåkes i intervaller på 8-12 timer, ettersom spredningen av pneumokokker kan utvikle seg raskt i utav CD-en mus. Den sanntid bildebehandling kan benyttes til visualisere transmigrasjon av pneumokokker fra nasopharynx inn i lungen og blodet, og i tillegg, multiplikasjon av pneumokokker i blodetetter intraperitoneal infeksjon kan bli overvåket av den dramatiske økningen i Bioluminescens intensitet 26,28,29.

Ved sammenligning av virulens potensialet av villtype pneumokokker og isogene mutanter er det viktig å teste først virkningen av tap-av-genet under in vitro kultur forhold. Vekst forskjeller mellom villtype bakterier og mutanter, spesielt kjemisk definert medium, som allerede viser en redusert bakteriell trenings 26.. Således blir dempningen observert under in vivo betingelser i forbindelse med en endret fysiologi som fører til mindre robust pneumokokker ved kolonisering og invasive infeksjoner.

Imidlertid må det nevnes at denne avbildningsteknikk er ofte ikke tilstrekkelig til å demonstrere virkningen av genet knockouts for pneumokokk virulens. I likhet med andre sykdomsfremkallende bakterier pneumokokker er allsidige mikroorganismer og har utviklet seg mangefasetterte mekanismer to møte verts og unngå immunsystemet. Følgelig pneumokokker produserer på den ene side er proteiner med manifoldfunksjoner som adhesin PSPC og, på den annen side, er de utstyrt med flere proteiner som utviser lignende funksjoner som derved kan kompensere mangelen av et protein på grunn av mutasjoner 4,17,18 , 35. I disse scenariene andre in vivo-smitteforsøk som coinfection tilnærming har til å bli anvendt for å dechiffrere effekten av tap-av-proteinfunksjon i mutant for kolonisering eller invasive infeksjoner 27,28.

Pneumokokker kolonisere og infisere fortrinnsvis mennesker, men ble også isolert fra husdyr eller zoo dyr 4,36,37. Å dechiffrere virkningen av virulens eller fitness faktorer mus smittemodeller brukes. Men ikke alle pneumokokkstammer er mus virulente, og enda viktigere, mottakelighet hos mus er avhengig av den genetiske bakgrunn av dyrene 22. Pneumokokkvirulens studier og beskyttelse studier er i dag gjennomført med CD-en utav mus. Men knockout mus eller transgene mus er også av stor interesse å dechiffrere rollen som vertsfaktorer for invasive pneumokokksykdommer. Den knockout eller transgene mus er ofte generert på musestammer som C57/BL6 eller Balb / c. Disse musestammer er mindre mottagelige mot pneumokokkinfeksjon og høy infeksjons doser er nødvendig for å oppnå en dødelig dose 50% (LD 50). Alt etter infeksjonsdosen denne resistens hos mus kan svekke sanntid Bioimaging av pneumokokk-spredning til lungene eller blod, siden pneumokokker er begrenset til å formere seg på en måte som er nødvendig for detektering av bildedanningssystemet. For å overvinne denne begrensningen, og for å være i stand til å avbilde spredning i sanntid, høy infeksjonsdoser måtte anvendes. Risikoen for at denne fremgangsmåte kunne være at forskjeller i verts følsomhet ikke kan bli utforsket som formidling skrider frem for raskt.

via intranasal eller intra-peritoneal rute. Denne fremgangsmåten er særlig egnet for å sammenligne den virulens potensialet mellom vill-type og mutanter av S. pneumoniae.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning i laboratoriet ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) og Federal Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF) Medisinsk Infeksjon Genomics (FKZ 0315828A) til SH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1  
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2  
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A  
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2  
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376  
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151  
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500 mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany  
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany  
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok syringes with needle
Gel Loader Tips PeqLab 81-13790 MµltiFlex Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001  
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany  
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany  
Oligonucleotides  Eurofins MWG, Ebersberg, Germany  
Qiaprep Spin Midiprep Kit  Qiagen, Hilden, Germany 27104  
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106  
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
IVIS Spectrum Imaging System  Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
  2. WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
  3. Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
  4. Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
  5. Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
  6. Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
  7. Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
  8. Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
  9. Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
  10. Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
  11. Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
  12. Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
  13. Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
  14. Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
  15. Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
  16. Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
  17. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
  18. Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
  19. Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
  20. Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
  21. Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
  22. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
  23. Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
  24. Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
  25. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
  26. Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
  27. Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
  28. Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
  29. Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
  30. Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  31. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
  32. Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
  33. Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
  34. Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
  35. Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
  36. Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
  37. vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
  38. Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).

Tags

Infeksjon grampositive bakterier, Lungebetennelse bakterielle luftveisinfeksjoner dyremodeller smittsom lungebetennelse invasive pneumokokksykdommer pneumokokker Bioimaging virulens faktor formidling Bioluminescens IVIS Spectrum
Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz,… More

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter