Summary
Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.
Abstract
La neumonía es una de los principales problemas de salud en países en desarrollo e industrializados y se asocia con una considerable morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances en el conocimiento de esta enfermedad, la disponibilidad de las unidades de cuidados intensivos (UCI), y el uso de potentes agentes antimicrobianos y vacunas eficaces, las tasas de mortalidad siguen siendo elevados 1. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en seres humanos. Este patógeno está equipado con un arsenal de adhesinas de superficie expuesta y factores de virulencia que contribuyen a la neumonía y la enfermedad neumocócica invasiva (ENI). La evaluación de la función in vivo de los factores de aptitud o de virulencia bacteriana es de suma importancia para desentrañar S. mecanismos de patogenicidad pneumoniae. Los modelos murinos de neumonía, bacteremia y meningitis se utilizan para determinar el impacto de los factores de neumococo en difeFerent etapas de la infección. Aquí se describe un protocolo para controlar la difusión de neumococo en tiempo real en los ratones después intranasal o infecciones intraperitoneales con bacterias bioluminiscentes. Los resultados muestran la multiplicación y difusión de neumococos en el tracto respiratorio inferior y la sangre, que puede ser visualizado y evaluado utilizando un sistema de imagen y el software de análisis adjunto.
Introduction
Infecciones de las vías respiratorias causadas por virus o bacterias siguen siendo uno de los problemas o adquiridas en la comunidad clínicas más comunes en todo el mundo que causan aproximadamente un tercio de todas las muertes en todo el mundo. Las especies bacterianas clave son Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae 2. Sin embargo, estas especies bacterianas son normalmente constituyentes comunes de la flora del tracto respiratorio naturales. Así carro bacteriana es también de cierto riesgo para la enfermedad invasiva y dependiendo del estado inmunitario o predisposiciones de los individuos. La colonización asintomática se dispara a las infecciones invasivas. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en los seres humanos. En individuos sanos S. pneumoniae (neumococo) son a menudo asintomáticos colonizadores e inofensivos del tracto respiratorio superior, donde se enfrentan a las bacterias patógenasde la flora residente, sino también con agentes patógenos como Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus y la primera línea del sistema de defensa inmunológico humano. Las tasas de transporte son más altos en los niños pequeños (37%) e incluso superior en los centros de atención de día de hacinamiento (58%) 3-5. La población más joven y el anciano, que recibe el neumococo a través de la transmisión por aerosol de los transportistas y las secreciones nasofaríngeas 6, pertenecen a los grupos de alto riesgo y la vacunación con una de las vacunas neumocócicas conjugadas (PCV10 o PCV13 en niños y 23-valente polisacárida PPSV23 en adultos) se recomienda en los Estados Unidos (EE.UU.) y muchos países europeos 4. El PPSV23 cubre los serotipos responsables de ~ 90% de las enfermedades neumocócicas bacteriemia en los EE.UU. y Europa, la prevención de enfermedades neumocócicas así eficientemente invasiva (ENI) en los adultos, mientras que los PCVs cubren los serotipos más prevalentes en los niños. En consecuencia, la ENI por tipos vacunales (VT) se reduserotipos no vacunales ced pero que muestran un alto potencial de virulencia y resistencia a los antibióticos se han convertido 4,7-12. La nasofaringe como reservorio es el punto de partida de los neumococos a extenderse a los senos paranasales o el oído medio que inician infecciones locales dañinos. Más importante aún, los neumococos difundir directamente a través de la vía aérea a los bronquios y del pulmón que resulta en peligro la vida de la PAC 4,13. Las infecciones pulmonares son acompañados a menudo con el tejido y destrucción de la barrera, lo que permite al patógeno a extenderse a la sangre y causando IPD. Las incidencias de la PAC y la ENI son más altos en personas inmunodeprimidas o en los extremos de 4,13 años. Las circunstancias responsables de la conversión de un comensal a un patógeno con alta virulencia son aún objeto de debate. Sin embargo, además de los cambios en la susceptibilidad del huésped y la adaptación evolutiva acompañado con una mayor virulencia y el aumento de la resistencia a los antibióticos se han sugerido a tener un impacto crucial en el PNEinfecciones umococcal 14-16.
El patógeno está dotado de una multiplicidad de adhesinas que median el contacto íntimo de la mucosa células epiteliales. Después de superar la mucosidad de las vías respiratorias, la adhesión de neumococo a las células huésped se facilita a través de interacciones directas de adhesinas de superficie expuesta con los receptores celulares y mediante la explotación de componentes de la matriz extracelular o proteínas séricas como moléculas puente 4,17,18. Patógenos Como versátiles neumococos también están equipados con los factores involucrados en la evasión de los mecanismos de defensa del huésped inmune. Además, tienen la capacidad de adaptarse a diversos ambientes huésped, tales como el pulmón, la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR), respectivamente 5,17,19,20.
El impacto de los factores bacterianos en las respuestas de la patogénesis y de acogida inflamatoria se investiga en modelos animales experimentales de la neumonía, bacteriemia o meningitis 21-25. A pesar de ser un patógeno humano, estos modelos son nosotrosll establecida para descifrar tropismo tisular neumocócica, los mecanismos de virulencia, o protectividad de candidatas a vacunas neumocócicas. El fondo genético de cepas puras ratón determina la susceptibilidad a los neumococos. Ratones BALB / c por vía intranasal infectados con neumococos se encontró que eran resistentes, mientras que CBA / Ca y SJL ratones eran más susceptibles contra infecciones neumocócicas 22. Esto implica que, de forma similar a los seres humanos, los antecedentes genéticos y los mecanismos de defensa del huésped determinar el resultado de la infección. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos para desentrañar loci de resistencia en el genoma de los ratones menos susceptibles a las infecciones neumocócicas. Los resultados han dado lugar a cambios en los protocolos de virulencia en vivo. En lugar de los ratones BALB / c endogámicos de uso frecuente en el pasado, las cepas de ratón outbred CD-1/MF1 altamente susceptibles se utilizan hoy en día a menudo para estudiar el efecto de la virulencia o la aptitud neumocócica pérdida de la función de factores de 26-28. Por otra parte, la disponibilidadde neumococos bioluminiscente y técnicas de formación de imágenes ópticas permite que el tiempo real bioimagen bioluminiscencia de las infecciones. En neumococos el casete del gen de luxABCDE optimizado (plásmido Paul-Un Tn 4001 luxABCDE Km R) ha sido insertado en un único sitio de integración del cromosoma por mutagénesis de transposones. Neumococos bioluminiscente se han empleado para evaluar la atenuación de los mutantes deficientes en neumocócicas de virulencia o aptitud factores y su translocación desde un sitio anatómico a otro 26,28-31.
Aquí les ofrecemos un protocolo para la bioimagen de infecciones neumocócicas en una neumonía murina o modelo de sepsis. La amplificación y la difusión de neumococos bioluminiscente en ratones por vía intranasal o por vía intraperitoneal infectados pueden ser fácilmente monitorizados en el tiempo utilizando un sistema de imagen óptica y el mismo animal en diferentes puntos de tiempo.
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Protocol
Los experimentos de infección de los animales que aquí se describen deben realizarse en estricta conformidad con los planos local e internacional (por ejemplo, la Ley de Salud de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA)) directrices y reglamentos para el uso de animales vertebrados. Los experimentos tienen que ser aprobados por el comité de ética local y Comité de Cuidado de Animales institucional. Todos los experimentos con S. pneumoniae en el laboratorio o las infecciones en los animales se llevan a cabo en una Clase II Bioseguridad Gabinete.
1. Preparación de la Bolsa de Infecciosas de bioluminiscente Pneumocococi
- Preparar cultivos madre neumocócicas en caldo Todd-Hewitt suplementado con 1% (w / v) de extracto de levadura y una concentración final de 20% de glicerol para el mantenimiento a 80 º C.
- Placa de una pequeña cantidad de la cultura de stock neumocócica congelado en una placa de agar sangre e incubar las bacterias durante 10 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. Tplaca de agar sangre que contiene los antibióticos apropiados, tales como kanamicina (150 mg / ml) para la inserción del transposón de la casete del gen de luxABCDE en el genoma.
- Sub-cultivar una colonia fresca en una nueva placa de agar sangre para un máximo de 10 horas.
- Inocular THY medio suplementado con 10% (v / v) inactivado por calor (30 min a 56 ° C) de suero bovino fetal (FBS) con neumococos y empezar el cultivo a una DO 600 de 0,05-0,07.
- Incubar neumococos sin agitación a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que el cultivo alcanzó una DO 600 de 0,35 a 0,40. El crecimiento dura entre 3-4 horas.
- Neumococos cosecha por centrifugación a 3750 xg durante 10 min y resuspender neumococos bioluminiscente en solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS) suplementado con 0,5% de FBS.
- Ajuste el inóculo a la concentración deseada en PBS/10% de FBS. La dosis de infección depende de la cepa de neumococo utilizado y los antecedentes genéticos del micrófonoe. Para infectar outbred ratones CD-1 por vía intranasal con S. pneumoniae D39 lux la dosis de infección se debe ajustar a 1 x 10 7 UFC en una suspensión de 20 l suplementado con 90 unidades de hialuronidasa. No agite o vórtice neumococos, ya que esto dará lugar a la autolisis.
- Comprobar la concentración de inóculo mediante siembra de diluciones seriadas 10 veces en agar sangre y el recuento de las colonias después del crecimiento durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Verificar la bioluminiscencia del inóculo neumocócica mediante la medición de la bioluminiscencia usando un sistema de imagen óptica.
2. Intranasal y la infección intraperitoneal de ratones con neumococos bioluminiscente
- Utilice ratones hembra consanguínea en la edad de 7-10 semanas para la neumonía aguda y el modelo de sepsis. El peso de estos ratones debe estar entre 20-30 g.
- Anestesie ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Prepare una mezcla de 1,0 mgketamina y 0,1 mg de xilazina en 100 l estéril al 0,9% (w / v) de cloruro sódico para ratones con un peso corporal de 20 g. Esto es consistente con una dosis de 50 mg / kg de peso corporal para la ketamina y 5 mg / kg de peso corporal para xilazina. Para ser exactos, pesar los ratones antes de la inyección de los anestésicos.
- Se inyecta la mezcla en la cavidad intraperitoneal y colocar los animales dentro de la jaula hasta que los anestésicos actúan y los animales son narcotizados. La respiración de los ratones será muy lento y regular. Los ratones tienen que ser totalmente narcotizado, de manera que la inoculación intranasal y la inhalación de la suspensión bacteriana no darán lugar a estornudos y, por tanto, la pérdida de inóculo. Esto se puede evaluar por pellizcar el ratón en el extremo de su cola; un ratón totalmente narcotizado carecerá de la capacidad de respuesta.
- Recoger suavemente hasta un ratón narcotizado y mantenga pulsado el ratón entre los dedos y el pulgar, con la nariz en posición vertical (Figura 1).
- Utilice una pipeta con largas puntas estrechas (Gel LoaderTips) y colocar los neumococos bioluminiscente en múltiples pequeñas gotas en las fosas nasales (10 l / ventana de la nariz) del ratón 26-29. El ratón involuntariamente inhalar la bacteria. Mantenga el ratón 1-2 min en posición vertical y observe si el ratón estornuda o mantiene el inóculo.
- Infect 7-10 semanas de edad ratones CD-1 por vía intranasal con una dosis de infección de 1 x 10 7 o 7,5 x 10 7 neumococos de D39 cepa y TIGR4, respectivamente, para controlar la infección en tiempo real. El límite de detección para el sistema sin ninguna absorción por el tejido del huésped es de aproximadamente 1 x 10 6 bacterias bioluminiscentes.
- Infectar ratones por vía intraperitoneal (IP) para evaluar y bioimagen virulencia del neumococo en un modelo de infección sepsis ratón. Utilice 5 x 10 3 UFC en 100 l de D39 tensión y 1 x 10 4 de cepa TIGR4. Los ratones no son anestesiados utilizando la ruta IP.
- Se inoculan los ratones de control con PBS.
Figura 1. Infección intranasal de ratones CD-1 con S. pneumoniae. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
3. Visualizar neumocócica Difusión en el Pulmón y la Sangre Usando el sistema de imágenes
Difusión de imagen de neumococos después de la infección intranasal de ratones CD1 hembras consanguíneos en tiempo real, utilizando un sistema de imagen en vivo.
- Encienda el sistema de imagen e iniciar el software de análisis de imágenes se encuentra en el equipo preconfigurar.
- El sistema de imágenes inicializa automáticamente y la cámara CCD se enfría termoeléctricamente a 90 ° C antes de ser activo.
- Los ajustes y hurgar en la basura dependen del número de ratones medidosimultáneamente y en la fuerza de la señal bioluminiscente. El campo de visión (FOV) para supervisar la bioluminiscencia de los animales es variable y la ampliación oscila entre un campo de visión de 22,5 cm para medir cinco ratones, y un campo de visión de 3,9 cm para medir un solo ratón o partes del animal como el pecho o la cabeza.
- Utilizar habitualmente un tiempo de exposición de 1 min, un grado medio de hurgar en la basura, y un campo de visión de 22,5 cm (conjunto D). En primer lugar, seleccionar el modo de imagen luminiscente y luego configurar los parámetros de la imagen.
- La emisión de la señal puede depender de la cepa bacteriana y cepa de ratón utilizado, y el pigmento del ratón. Afeitar el pecho de los ratones cuando se utiliza por ejemplo, ratones C57BL / 6, que puede ser ventajoso cuando obtención de imágenes del desarrollo de neumonía en estos ratones.
- Imagen ratones infectados a intervalos de tiempo preseleccionado. Mida la bioluminiscencia de los ratones en el modelo de neumonía aguda en intervalos de tiempo de máximo 8-12 hr. Vigile también el bienestar de los ratones infectados por observing su apariencia, comportamiento, y la determinación de la pérdida de peso.
- Anestesie ratones en la cámara de narcóticos del sistema de anestesia de los equipos de formación de imágenes antes de las mediciones en la cámara. Inicie la inhalación de una mezcla de isoflurano y oxígeno y esperar hasta que los ratones respirar lenta y regularmente.
- Coloque los animales anestesiados en la cámara de formación de imágenes del sistema y mantener los ratones en posición supina. La cámara CCD en la parte superior de la cámara A continuación, la imagen del tracto respiratorio murino.
- Coloca los animales con su nariz en los tubos para permitir la inhalación de los anestésicos.
- El isoflurano se permite la entrada en la cámara de formación de imágenes a través de una tubería de gas para mantener la anestesia.
- Para activar la cámara CCD en la parte superior de la cámara y empezar a imágenes ópticas bioluminiscente, pulse "Acquire" en el software de imágenes. Inmediatamente una fotografía de los ratones en la cámara cerrada aparece en la pantalla. Después de un minuto de la medición una superposición de los datos de la bioluminiscencia y la foto se muestra.
- Detener la anestesia después de que aparezca la superposición de imágenes en la ventana del programa y poner a los ratones de nuevo en sus jaulas.
- Los ratones son monitoreados para la recuperación.
Figura 2. Anestesia y seguimiento de los ratones infectados con neumococos bioluminiscente usando la anestesia IVIS y sistema de IVIS Spectrum, respectivamente. A) El sistema de IVIS Espectro de formación de imágenes. B) El sistema de anestesia de IVIS con la cámara de incubación. C) ratones anestesiados en la cámara de incubación . D) Ratones situado dentro de la cámara de IVIS Spectrum Imaging con la nariz inhalando el anestésico._blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
4. Cuantificación y Evaluación de la bioluminiscencia de los ratones infectados con S. bioluminiscente pneumoniae
- Determinar las intensidades de bioluminiscencia de los ratones o de una región seleccionada de los ratones mediante la cuantificación de la emisión de fotones total de (fotones / seg) usando el software de análisis de imagen.
- Utilice los valores de la emisión de fotones que se proporcionan en una hoja de datos de Excel para preparar un gráfico. Dado que la variación de los datos es a menudo alta dentro de los ratones agrupados, generar un gráfico cuadro de bigote para mostrar las diferencias en los ratones infectados con las diferentes cepas de neumococo.
- Proporcionar los fotones por ratones o como alternativa los resultados como el promedio de radiación (fotones / s / cm 2 / SR) de un área seleccionada.
- Los datos de medición de ROI (región de interés) en el modo de fotones pueden ser cuantitativamente diferente comparado a través de los sistemas de imágenes in vivo con diferentes vinoajustes ra, ya que las medidas en unidades de luminosidad toman en cuenta automáticamente los ajustes de la cámara (por ejemplo, tiempo de integración, hurgar en la basura, f / parada, y el campo de visión).
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Representative Results
La adquisición y la absorción de la metionina es de importancia central para los neumococos a mantener la forma física en su nicho de acogida 32,33. La metionina ABC transportador de lipoproteína se codifica en D39 por el SPD _ 0151 genes (TIGR4: sp_0149) y nombró MetQ 32. Los neumococos producen más enzimas de la biosíntesis de la metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete y metF). La falta de metionina en un medio químicamente definido afecta el crecimiento de neumococos y similares, la falta de la metionina de unión MetQ lipoproteína de alteración de la captación de metionina 32,33. Este defecto podría ser restaurada mediante la adición de altas concentraciones de metionina. En los experimentos de colonización de ratón mutante deficiente en MetQ no se atenuó en la virulencia tal como se muestra en los experimentos de coinfección con el de tipo salvaje isogénicas, mientras que la falta de MetQ atenuada neumococos en modelos de ratón de sepsis y neumonía como se muestra pordeterminación de la carga bacteriana 32. Bioimagen óptica en tiempo real utilizando el espectro IVIS utilizado aquí permite el control de la multiplicación y diseminación de las bacterias en un solo animal infectado en diferentes momentos.
En el ejemplo que se muestra aquí, hemos evaluado el impacto de la unión MetQ lipoproteína sobre la colonización y virulencia mediante la aplicación del modelo de ratón de infección aguda neumonía metionina. CD-1 ratones outbred (n = 10) fueron infectados por vía intranasal con 1 x 10 7 bacterias de tipo salvaje cepa de S. pneumoniae lux D39 (PN149) o sus isogénicas lux D39 mutante Δ metQ (Tabla 1). El mutante metQ (PN252) se construyó mediante la inserción-deleción mutagénesis del gen metQ en neumococos D39 bioluminiscente. Por lo tanto, el gen metQ, secuencia 5 'y 3'sequence fueron amplificados por PCR usando los cebadores 382 y 385. El producto de PCR se clonó en el vector de PGE-MT fácil, lo que resultó en P559 de plásmido (Tabla 1). Por PCR inversa usando los cebadores 383 y 384 (Tabla 2) la secuencia de metQ (nt 58 a nt 777) se ha eliminado y sustituido por un casete de gen de resistencia a eritromicina (ermB) amplificado por PCR utilizando el plásmido pE89 (Tabla 1) como ADN-plantilla y el par de cebadores ermB_105/ermB_106 (Tabla 2). El plásmido resultante que P563 34 se transformó en neumococos como se describe anteriormente usando competencia estimulante de péptido-1. Los mutantes deficientes en el MetQ lipoproteína (Spd_0151) se cultivaron en THY o en placas de agar sangre suplementadas con eritromicina (5 g / ml).
El estado de salud de los ratones fue de control permanente. Los animales fueron sacrificados cuando no respondedores o signos de morbilidad debida. Por otra parte, la difusión de neumococo de la nasofaringe en los pulmones y la sangre, lo que lleva a una neumonía severa y sepsis, fue monitoRed por la medición de la bioluminiscencia cada ocho horas. En cada grupo de ratones infectados 7 de cada 10 ratones desarrollaron signos graves de la enfermedad, mientras que los otros 3 ratones no mostraron bioluminiscencia y sobrevivieron (Figura 3A). Los ratones infectados con éxito con el bioluminiscente de tipo salvaje D39 lux desarrollaron 32 horas las infecciones pulmonares graves después de la infección, que progresa dentro de 8-16 horas a la sepsis (Figura 3A). A la hora del punto de las 96 horas todos los ratones sucumbieron que habían desarrollado neumonía y sepsis post-infección con lux D39. La pérdida de la función de la lipoproteína de unión metionina perjudicados de manera significativa la virulencia del neumococo. Después de 32 horas sólo un ratón infectado con el mutante metQ mostró una infección en los pulmones débiles, mientras que los otros no mostraron signos evidentes de la enfermedad y la neumonía. Sin embargo, después de 48 h infecciones pulmonares graves se convirtieron también evidente en los ratones infectados con el mutante. Como resultado de ello, estos ratones desarrollaron la sepsis 72 hrdespués de la infección y se convirtió moribundo a más tardar 72 horas después de la infección, lo que demuestra que en el modelo de infección por neumonía aguda la carencia de MetQ atenúa neumococos.
Tabla 1. Colar y lista plásmido.
Tabla 2. Lista de Primer. Se subrayan los sitios de restricción.
| Primer uso previsto | Nombre Primer | Secuencia (5'-3 ') |
| Mutagénesis de inserción-deleción | ||
| La amplificación de sp_0149 + 5 'y 3 'de acompañamiento región | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| La PCR inversa de sp_0149 + 5 'y Acompañamiento región 3 '(pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-AAGCTT ATCATCATCATCG AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-AAGCTT ACTCACTCACTG ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| Amplificación casete antibióticos | ||
| eritromicina (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
Figura 3. Monitoreo de difusión neumocócica en ratones después de la infección intranasal. A) de imágenes ópticas bioluminiscente de ratones infectados por vía intranasal con lux D39 o la D39 luxΔmetQ isogénicas mutantes. B) Los valores de las intensidades de bioluminiscencia de ratones agrupados (n = 10) se muestranpara los puntos de tiempo indicados en una gráfica cuadro bigote. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Todos los experimentos realizados en animales tienen que ser aprobados por las autoridades locales y las comisiones de ética. En experimentos in vivo de infección de la carga bacteriana en los diversos nichos de acogida de animales infectados tiene que ser determinada en diversos puntos temporales después de la infección. Bajo estas condiciones experimentales los animales tienen que ser sacrificados antes del aislamiento de las bacterias de la sangre, nasofaringe, lavado bronchoalvelar, o órganos tales como los pulmones, el bazo y cerebro. Para calcular el número de bacterias por nicho anfitrión y evaluar el efecto de factores bacterianos de la virulencia, la sangre o los órganos tienen que ser aislado seguido de la recuperación bacteriana y en placas sobre medios sólidos. La carga bacteriana se cuantifica luego por enumeración de las UFC. Para llegar estadísticamente significativas de datos cada punto de tiempo necesita un grupo de ratones, que bajo ciertas condiciones experimentales conduce a dificultades en el manejo del experimento debido a la alta número de ratones.
ove_content "> En contraste, el método de bioimagen en tiempo real es un enfoque tiempo-exigiendo menos y cada ratón infectados con bacterias individuo se puede monitorizar varias veces durante un período de tiempo. La técnica de formación de imágenes permite la visualización de las bacterias dentro del animal en diferentes puntos de tiempo después de la infección, o incluso por un período de tiempo prolongado. Además, la bioluminiscencia medida con el software de análisis de imagen óptica permite además la cuantificación de los fotones emitidos por el animal infectado. Esto se puede limitar a un área definida del ratón o la totalidad animal puede ser considerado. En los experimentos in vivo de ratones infectados con neumococos de infección en exijan un control en intervalos de 8 a 12 horas, ya que la propagación de neumococos puede progresar rápidamente en outbred ratones CD-1. La formación de imágenes en tiempo real se puede emplear para visualizar la transmigración de neumococos de la nasofaringe en el pulmón y la sangre, y además, la multiplicación de neumococos en la sangredespués de la infección intraperitoneal puede ser controlado por el dramático aumento en la intensidad de la bioluminiscencia 26,28,29.Al comparar el potencial de virulencia de tipo salvaje y mutantes isogénicas neumococos es esencial para probar primero el efecto del gen de la pérdida-de-bajo condiciones de cultivo in vitro. Las diferencias de crecimiento entre las bacterias de tipo salvaje y mutantes, en particular en medio químicamente definido, ya indican un gimnasio bacteriana disminuyó 26. Por lo tanto, la atenuación observada bajo condiciones in vivo se asocia con una fisiología alterada conduce a menos robusto neumococos durante las infecciones de colonización e invasoras.
Sin embargo, se tiene que mencionar que esta técnica de imagen a menudo no es suficiente para demostrar el efecto de knockouts de genes de virulencia en el neumococo. Similar a otros neumococos bacterias patógenas son microorganismos versátiles y han desarrollado mecanismos multifacéticos tO encontrar el host y evadir el sistema inmune. En consecuencia, los neumococos producen en las proteínas de una mano con múltiples funciones, tales como la PspC adhesina y, por otro lado, están dotados de varias proteínas que presentan funciones similares que por lo tanto puede compensar el defecto de una proteína debido a mutaciones 4,17,18 , 35. En estos escenarios otros in vivo en experimentos de infección tales como el enfoque de la coinfección tiene que ser empleada para descifrar el efecto de la función de pérdida de proteína en el mutante para la colonización o infecciones invasivas 27,28.
Los neumococos colonizar e infectar preferentemente seres humanos, sino también se aislaron de las mascotas o animales de zoológico 4,36,37. Para descifrar el impacto de la virulencia o se utilizan modelos de infección en los factores de la aptitud del ratón. Sin embargo, no todas las cepas de neumococo son ratón virulenta, y más importante aún, la susceptibilidad de los ratones depende de los antecedentes genéticos de los animales 22. Neumococoestudios de virulencia y estudios de protección son hoy en día a cabo con ratones CD-1 outbred. Sin embargo, los ratones knockout o ratones transgénicos también son de gran interés para descifrar el papel de los factores del huésped para las enfermedades neumocócicas invasivas. El nocaut o ratones transgénicos suelen generarse en cepas de ratón como C57/BL6 o Balb / c. Estas cepas de ratón son menos susceptibles contra las infecciones neumocócicas y dosis alta de infección están obligados a obtener una dosis letal, 50% (DL50). Dependiendo de la dosis de infección esta resistencia de los ratones puede perjudicar bioimagen tiempo real de difusión neumocócica a los pulmones o la sangre, ya que los neumococos se limitan a multiplicar de una manera necesaria para la detección por el sistema de formación de imágenes. Para superar esta limitación y para ser capaz de la imagen de la difusión en tiempo real, dosis altas de infección tienen que ser utilizados. El riesgo de este enfoque podría ser que las diferencias en la susceptibilidad de acogida no pueden ser explorados como la difusión avanza con demasiada rapidez.
a través de la vía intranasal o intraperitoneal. Este enfoque es especialmente adecuado para comparar el potencial de virulencia entre los de tipo salvaje y los mutantes de S. pneumoniae.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) Genómica Médica Infección (FKZ 0315828A) a SH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
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