Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

После в режиме реального времени Влияние пневмококковой факторов вирулентности в острой Mouse пневмонии Модель Использование биолюминесцентных бактерии

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/51174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department Genetics of Microorganisms, Interfaculty Institute for Genetics and Functional Genomics, University of Greifswald

Summary

Пневмококк является ведущим возбудителем тяжелой внебольничной пневмонии и отвечает за более чем 2 миллиона смертей во всем мире. Влияние бактериальных факторов, вовлеченных в фитнес или вирулентности можно отслеживать в режиме реального времени в острой мыши пневмонии или бактериемия модели с использованием биолюминесцентных бактерии.

Abstract

Пневмония является одной из основных проблем здравоохранения в развивающихся и промышленно развитых странах и связана со значительным заболеваемости и смертности. Несмотря на успехи в знании этой болезни, наличия отделениях интенсивной терапии (ОИТ), а также использование сильнодействующих противомикробных препаратов и эффективных вакцин, показатели смертности остаются высокими 1. Пневмококк является ведущим возбудителем внебольничной пневмонии (ВП) и одним из наиболее распространенных причин бактериемии у людей. Это возбудитель оснащен арсенал поверхностно-подвергается адгезинов и вирулентности факторов, способствующих пневмонии и инвазивных пневмококковых инфекций (IPD). Оценка роли в естественных бактериальных фитнес или факторов вирулентности имеет первостепенное значение, чтобы разгадать S. пневмонии патогенности механизмов. Мышиные модели пневмонии, бактериемии и менингита используются для определения влияния пневмококковых факторов при разразличных стадиях инфекции. Здесь мы опишем протокол для мониторинга в режиме реального времени пневмококковой распространения у мышей после интраназального или внутрибрюшинными инфекций с биолюминесцентных бактерий. Результаты показывают, умножение и распространение пневмококков в нижних дыхательных путей и крови, что может быть визуально и оценивали с помощью системы визуализации и программное обеспечение прилагаемого анализа.

Introduction

Инфекции дыхательных путей, вызванных вирусами или бактериями остаются одним из наиболее распространенных внебольничных или клинических проблем по всему миру, вызывая примерно одну треть всех смертей в мире. Ключевые виды бактерий являются гемофильной и пневмококк 2. Однако эти виды бактерий, как правило, общие компоненты природной флоры дыхательных путей. Таким образом бактериальная каретки также определенного риска развития инвазивного заболевания и в зависимости от иммунного статуса или предрасположенности лиц. Бессимптомно колонизация срабатывает с инвазивными инфекциями. Пневмококк является ведущим возбудителем внебольничной пневмонии (CAP) и один из самых распространенных причин бактериемии у людей. У здоровых лиц С. пневмонии (пневмококки), часто протекает бессимптомно и безвредные колонизаторы верхних дыхательных путей, где они сталкиваются с непатогенных бактерийиз флорой, но и с патогенов, таких как Haemophilus SPP. или золотистый стафилококк и первая линия системы обороны иммунной человека. Ставки по транспортировке являются самыми высокими в маленьких детей (37%) и даже выше в переполненных детских садах (58%) 3-5. Самый молодой населения и пожилых людей, получив пневмококк через аэрозольной передачи от перевозчиков и носоглотки выделениями 6, принадлежат к группам высокого риска и вакцинации с использованием одного из пневмококковых конъюгированных вакцин (PCV10 или PCV13 у детей и 23-валентной полисахаридной PPSV23 у взрослых) Рекомендуется в Соединенных Штатах (США) и многих европейских странах 4. PPSV23 охватывает серотипов, ответственных за ~ 90% бактериемией пневмококковых заболеваний в США и Европе, предотвращая, таким образом, эффективно инвазивных пневмококковых заболеваний (IPD) у взрослых, в то время как PCVs охватывают наиболее распространенные серотипы у детей. Следовательно, IPD из-за типов вакцин (VT) являются РедуCED но невакцинных серотипов отображения высокой вирулентности потенциал и устойчивость к антибиотикам появились 4,7-12. Носоглотки в качестве резервуара является отправной точкой для пневмококков распространяться на пазух или среднего уха, начавших вредных местных инфекций. Что более важно, пневмококки распространяться непосредственно через дыхательные пути в бронхах и легких, в результате чего, угрожающей жизни CAP 4,13. Легочные инфекции часто сопровождаются ткани и разрушения барьера, что позволит возбудителя распространяться в кровь и вызывает IPD. Случаи CAP и IPD являются самыми высокими в ослабленным иммунитетом лиц или в крайних возрастных 4,13. Обстоятельства, ответственные за преобразование из комменсал к патогена с высокой вирулентностью находятся в стадии обсуждения. Однако, помимо изменений в восприимчивости хозяина и эволюционной адаптации сопровождается более высокой вирулентностью и увеличение сопротивления к антибиотикам были предложены иметь решающее влияние на PNEumococcal инфекции 14-16.

Возбудитель наделен множеством адгезинов посреднических тесный контакт слизистой эпителиальных клеток. После преодоления слизи в дыхательных путях, пневмококковая соблюдение клетки-хозяева, облегчается с помощью прямых взаимодействий поверхностных, подвергшихся воздействию адгезинов с клеточными рецепторами и, используя компоненты внеклеточного матрикса или сывороточных белков, как преодоление молекулам 4,17,18. Как универсальные патогены пневмококки также оснащены факторов, участвующих в уклонении от иммунной защитных механизмов. Кроме того, они имеют способность адаптироваться к различным принимающих кругах, таких как легких, крови и спинномозговой жидкости (ликвора), соответственно 5,17,19,20.

Влияние бактериальных факторов на патогенез и воспалительные принимающих ответов исследуется в экспериментальных моделях на животных пневмонии, бактериемии или менингита 21-25. Несмотря на то, патоген человека, эти модели мыLL-создан, чтобы расшифровать пневмококковой ткани тропизм, механизмы вирулентности или protectivity кандидатов пневмококковых вакцин. Генетический фон инбредных линий мышей определяет восприимчивость к пневмококков. BALB / с мышей, инфицированных интраназально пневмококков Было обнаружено, что устойчивые, а CBA / Ca и SJL мыши были более чувствительны против пневмококковых инфекций 22. Это означает, что, похожи на людей, генетического фона и принимающих защитных механизмов определить исход инфекции. Таким образом, необходимы дальнейшие усилия, чтобы разгадать сопротивления локусов в геноме мышей менее чувствительными к пневмококковых инфекций. Полученные данные привели к изменениям в в естественных условиях протоколов вирулентности. Вместо инбредных мышей BALB / с мышей, часто используемых в прошлом, очень уязвимые CD-1/MF1 беспородных линии мышей являются в настоящее время часто используется для изучения влияния потерь на-функции пневмококковой вирулентности или пригодности факторов 26-28. Кроме того, наличиебиолюминесцентной пневмококков и оптических методов визуализации позволяет в режиме реального времени биолюминесценции Bioimaging инфекций. В пневмококков оптимизированный ген кассета luxABCDE (плазмиды Paul-Tn 4001 luxABCDE Км г) был вставлен в одном месте интеграции в хромосому транспозонного мутагенеза. Биолюминесцентный пневмококки были использованы для оценки ослабления пневмококковых мутантов, дефицитных по вирулентности или фитнес-факторов и их транслокации из одной анатомической сайта на другой 26,28-31.

Здесь мы предлагаем протокол для биоизображений пневмококковых инфекций в мышиной пневмонии или сепсиса модели. Усиление и распространение биолюминесцентного пневмококков в интраназально или внутрибрюшинно инфицированных мышей можно легко контролировать с течением времени с помощью оптической системы формирования изображения и того же животного в различные моменты времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты инфекции животных, описанные здесь, должны выполняться в строгом соответствии с местными и международными (например, европейского права здравоохранения Федерации лабораторных животных Наука ассоциаций (FELASA)) принципами и правилами по использованию позвоночных животных. Эксперименты должны быть одобрены местным этического совета и институционального комитета по уходу за животными. Все эксперименты с S. пневмонии в лаборатории или инфекций животных проводятся в Кабинете класса II биобезопасности.

1. Подготовка инфекционных складе биолюминесцентных Pneumocococi

  1. Подготовка запас пневмококковых культуры в Todd-Hewitt бульона с добавлением 1% (вес / объем) дрожжевого экстракта и конечная концентрация 20% глицерина для поддержания при 80 ° С
  2. Plate небольшое количество глубокой заморозки складе пневмококковой культуры на кровяным агаром и инкубировать бактерии в течение 10 ч при 37 ° С в 5% СО 2. Тон кровяной агар пластина содержит соответствующие антибиотики, такие как канамицин (150 мкг / мл) для вставки транспозона гена кассеты luxABCDE в геном.
  3. Суб-культивировать свежий колонию на новый кровяным агаром в течение максимум 10 часов.
  4. Инокуляции THY среде, дополненной 10% (об / об) инактивированной нагреванием (30 мин при 56 ° С) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) с пневмококков и начать культуру при OD 600 из 0.05-0.07.
  5. Выдержите пневмококки без перемешивания при 37 ° С и 5% CO 2, пока культура не достигнет OD 600 из 0,35-0,40. Рост займет от 3-4 часов.
  6. Урожай пневмококки центрифугированием при 3750 х г в течение 10 мин и ресуспендируют биолюминесцентного пневмококков в фосфатном буферном растворе с рН 7,4 (PBS), дополненной 0,5% FBS.
  7. Регулировка посевной до желаемой концентрации в PBS/10% FBS. Доза инфекции зависит от пневмококковой используемого штамма и генетического фона микрофонэ. Для заражения беспородных CD-1 мышей интраназально S. пневмонии D39 Lux доза инфекции должна быть скорректирована до 1 х 10 7 КОЕ в суспензии 20 мкл с добавлением 90 единиц гиалуронидазы. Не трясите и не вихрь пневмококки, так как это вызовет автолиз.
  8. Проверьте концентрацию посевной путем посева в 10 раз серийные разведения на кровяной агар и подсчета колоний после ночного роста при 37 ° С в 5% CO 2.
  9. Проверьте биолюминесценции от пневмококковой посевного путем измерения биолюминесценции с помощью оптической системы формирования изображения.

2. Интраназальная и Внутрибрюшинное Заражение мышей с Bioluminescent пневмококков

  1. Используйте женский беспородных мышей в возрасте 7-10 недель для острой пневмонии и сепсиса модели. Вес этих мышей должна быть в пределах 20-30 г.
  2. Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Приготовить смесь 1,0 мгкетамин и 0,1 мг ксилазина в 100 мкл стерильной 0,9% (вес / объем) хлорид натрия для мышей с массой тела 20 г. Это согласуется с дозой 50 мг / кг массы тела в течение кетамина и 5 мг / кг массы тела в течение ксилазина. Чтобы быть точным, вес мышей перед инъекцией анестетиков.
  3. Введите смесь в внутрибрюшинного полости и поместите животных обратно в клетку, пока анестетики не действовать, и животные наркотизируемого. Дыхание мышей будет очень медленным и регулярным. Мыши должны быть полностью наркотизированных, так что интраназальное прививка и вдыхание бактериальной суспензии не приведет к чихание и, следовательно, потерю посевного материала. Об этом можно судить, зажимая мышь в конце хвоста; полностью наркотизируемого мышь не будет хватать отзывчивость.
  4. Аккуратно поднять наркотизируемого мышь и держать мышь между пальцами и большим пальцем с носа вертикальном (рис. 1).
  5. Используйте пипетки с длинными узкими наконечниками (гель LoaderСоветы) и падение биолюминесцентного пневмококки в нескольких мелких капель на ноздри (10 мкл / ноздрю) мыши 26-29. Мышь невольно вдыхать бактерии. Держите мыши 1-2 мин в вертикальном положении и наблюдать чихает ли мышь или держит посевной.
  6. Infect 7-10 неделе старый CD-1 мышей интраназально с инфекцией дозе 1 × 10 7 или 7,5 х 10 7 пневмококков штамма D39 и TIGR4, соответственно, для мониторинга инфекции в реальном времени. Предел обнаружения для системы без поглощения ткани хозяина примерно 1 × 10 6 бактерий биолюминесцентного.
  7. Заразить мышей внутрибрюшинно (IP) для оценки и bioimage вирулентность пневмококков в модели инфекции сепсис мыши. Использование 5 х 10 3 КОЕ в 100 мкл штамма D39 и 1 × 10 4 штамма TIGR4. Мыши не наркоз при использовании маршрут IP.
  8. Инокулировать контрольных мышей с PBS.
    Рисунок 1 Рисунок 1. Интраназальная инфекция CD-1 мышей с S. пневмонии. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

3. Визуализация пневмококковой Распространение в легких и крови Использование Imaging System

Распространение Изображение пневмококков после интраназального заражения женщин беспородных мышей CD1 в режиме реального времени с использованием в естественных условиях системы визуализации.

  1. Включить систему визуализации и запустить программное обеспечение для анализа изображений, расположенную на preconfigurated компьютере.
  2. Система формирования изображения инициализирует автоматически и CCD камера термоэлектрически охлаждают до 90 ° С, прежде чем активным.
  3. Параметры и отбора по зависеть от числа мышей, измереннойодновременно и на основании биолюминесцентного сигнала. Поле зрения (FOV) для мониторинга биолюминесценции животных является переменной и увеличение колеблется между FOV 22,5 см для измерения пять мышей, и поле зрения 3,9 см для измерения одного мыши или частей животного, как грудь или голова.
  4. Используйте регулярно время экспозиции 1 мин, средней степенью биннинга, и поле зрения 22,5 см (комплект D). Во-первых, выберите режим визуализации люминесцентных и затем установите параметры визуализации.
  5. Излучение сигнала может зависеть от бактериального штамма и штамма мыши и используемого пигмента мыши. Бритье грудь мышей при использовании, например, мышей C57BL / 6, который может быть выгодным при визуализации развитие пневмонии у этих мышей.
  6. Изображение инфицированных мышей на prechosen промежутки времени. Измерить биолюминесценции мышей в модели острой пневмонии с интервалами времени в максимальном 8-12 часов. Монитор также благосостояние зараженных мышей observiнг их внешний вид, поведение и определение потери веса.
  7. Обезболить мышей в наркотическом камере анестезии системе съемочной аппаратуры до измерений в камере. Начните вдыхания смеси изофлураном и кислорода и ждать, пока мыши не дышать медленно и регулярно.
  8. Наведите наркозом животных в визуализации камеры системы и держать мышей в положении лежа на спине. ПЗС-камера в верхней части камеры будет потом изображения мышиный дыхательных путей.
  9. Поместите животных с их носом в в пробирки, чтобы вдыхания анестетиков.
  10. Изофлюран вступление в изображения камеры через трубку газа допускается для поддержания анестезии.
  11. Для активации ПЗС-камеры на верхней части камеры и начать биолюминесцентного оптических изображений, нажмите "приобрести" в ПО для обработки изображений. На экране сразу же собой фотографию мышей в закрытой камере появляется. После одной минуты измерению накладку данных биолюминесценции и фото показан.
  12. Остановить анестезии после наложение изображения появится в окне программного обеспечения и положить мышей обратно в их клетках.
  13. Мыши контролируются для восстановления.
    Рисунок 2
    Рисунок 2. Анестезии и мониторинга мышей, инфицированных биолюминесцентного пневмококков с использованием анестезии ИВИС и систему IVIS спектр, соответственно.) Система IVIS Спектр изображений. B) Система анестезии IVIS с инкубационной камере. С) Мышей анестезировали в инкубационной камере . D) Мышей расположен внутри камеры IVIS Спектр изображениями с их нос вдыхая анестетик._blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

4. Количественное и оценки биолюминесценции мышей, инфицированных Bioluminescent S. пневмонии

  1. Определите интенсивность биолюминесценции мышей или выбранного региона мышей путем количественного определения общих выбросов фотонов (фотонов / сек) с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
  2. Используйте значения излучения фотонов, которые предоставляются в паспорте Excel подготовить график. Поскольку изменение данных часто высока в сгруппированных мышей, генерировать коробка усов график, отображающий разницу в мышей, инфицированных различными пневмококковых штаммов.
  3. Обеспечить фотонов в мышей или, альтернативно результаты как в среднем сияния (фотон / сек / см 2 / СР) выбранной области.
  4. Данные измерений из ROI (область интересов,) в режиме фотонного может быть количественно сравнивать между отличается в естественных систем визуализации с различными пришелНастройки ра, так как измерения в единицах сияния автоматически учитывать настройки камеры (например, время интегрирования, биннинга, е / стоп, и поле зрения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Приобретение и поглощение метионина имеет решающее значение для пневмококков для поддержания фитнес в принимающей нише 32,33. Метионин ABC транспортер липопротеинов кодируется в D39 СДПГ _ 0151 генов (TIGR4: sp_0149) и назвал MetQ 32. Пневмококки дальше производить метионин ферменты биосинтеза (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Мете и MetF). Отсутствие метионина в химически определенной среде влияет на рост пневмококков и похожи, отсутствие метионина связывания липопротеинов MetQ нарушением поглощения метионина 32,33. Этот дефект может быть восстановлен путем добавления высоких концентраций метионина. В экспериментах мыши колонизации мутант дефицит MetQ не был ослаблен в вирулентности, как показано на Коинфекция экспериментов с изогенных дикого типа, а отсутствие MetQ ослабляется пневмококков в мышиных моделях сепсиса и пневмонии, как показано наопределения бактериальной нагрузки 32. В режиме реального времени оптический Bioimaging с использованием спектра ИВИС, используемый здесь позволяет контролировать размножение и распространение бактерий в одном зараженного животного в различные моменты времени.

В примере, показанном здесь, мы оценили влияние метионина связывания липопротеинов MetQ на колонизации и вирулентности путем применения острой пневмонии инфекции модель мыши. CD-1 беспородных мышей (n = 10) были заражены интраназально с 1 х 10 7 бактерий штамма дикого типа С. пневмонии D39 люкс (PN149) или его изогенная мутант D39 лк Δ metQ (табл. 1). MetQ мутант (PN252) была построена вставка-удаление мутагенеза гена metQ в биолюминесцентной D39 пневмококков. Таким образом, ген metQ, 5 'последовательность и 3'sequence амплифицировали с использованием праймеров 382 и 385 с помощью ПЦР. Продукт ПЦР клонировали в вектор PGEМТ-легко, в результате плазмиды p559 (табл. 1). По обратной ПЦР с использованием праймеров 383 и 384 (табл. 2) последовательность metQ (нт 58 до нт 777) был удален и заменен ген устойчивости к эритромицин кассеты (ermB) усиливается с помощью ПЦР с использованием плазмиды pE89 (табл. 1), а ДНК-матрицы и Пара праймеров ermB_105/ermB_106 (табл. 2). Полученную в результате плазмиду p563 34 был преобразован в пневмококков, как описано выше, используя компетентность-стимулирующий пептид-1. Мутанты с дефицитом в липопротеинов MetQ (Spd_0151) культивировали в THY или на чашках с кровяным агаром с добавлением эритромицин (5 мкг / мл).

Непрерывно контролировали состояние здоровья мышей. Животных умерщвляли, когда не показывая надлежащий ответ или признаки заболеваемости. Кроме того, пневмококковая распространение из носоглотки в легкие и кровь, что приводит к тяжелой пневмонии и сепсиса, был также мониторингакрасный путем измерения биолюминесценции каждые восемь часов. В каждой группе инфицированных мышей 7 из 10 мышей развились тяжелые признаки заболевания, в то время как другие 3 мыши не показали биолюминесценции и выжил (рис. 3А). Мыши успешно инфицированные биолюминесцентной дикого типа D39 лк разработаны 32 часов после инфицирования тяжелых инфекций легких, которая прогрессирует в течение 8-16 часов, чтобы сепсис (рис. 3А). В момент времени 96 часов все мыши поддался, которые развилась пневмония и сепсис после инфекции с D39 лк. С потерей функции метионина связывания липопротеинов существенно ухудшается вирулентность пневмококков. После 32 часов только одна мышь заражены мутанта metQ показал слабую легочной инфекции, в то время как другие не показали явных признаков болезни и пневмонии. Тем не менее, после 48 часов тяжелые легочные инфекции стал также проявляется в мышей, инфицированных мутанта. В результате, эти мыши разработана сепсис 72 часапосле заражения и стал умирающий позднее 72 ч после заражения, демонстрируя, что в острой пневмонии модели инфекции дефицит MetQ ослабляет пневмококки.

Таблица 1. Процедить и список плазмиды.

Таблица 1

Таблица 2. Список Грунтовка. Сайты рестрикции подчеркнуты.

Грунтовка предполагаемого использования Грунтовка Имя Последовательность (5'-3 ')
Вносимые-удаление мутагенеза
Усиление sp_0149 + 5 'и
3 'фланкирующей области
382
385
5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 '
5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 '
Обратную ПЦР из sp_0149 + 5 'и
3 'фланкирующей области (pGEMTeasy)
383

384
5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT
GCGACTGTAG-3 '
5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA
CCACACAGA-3 '
Антибиотик усиления кассеты
эритромицин (ermB) ermB_105

ermB_106 		5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA
ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 '
5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT
GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 '
ntent "> биолюминесценции измеряется с помощью обработки изображений была также рассчитана. Подобно визуализации инфекции, количественное определение биолюминесцентной потока показали значительные различия между дикого типа инфицированных и metQ инфицированных мышей 32 и 40 ч после заражения. Таким образом, с потерей функции MetQ ослабляет пневмококков и приводит к значительной задержке инвазивной инфекции, но не приводит к авирулентных бактерий.

Рисунок 3
Рисунок 3. Мониторинг пневмококковой распространения у мышей после интраназального заражения. А) Биолюминесцентный оптических изображений мышей, зараженных интраназально D39 люкс или изогенной мутант D39 luxΔmetQ. B) Значения интенсивностей биолюминесценции сгруппированных мышей (п = 10) приведеныдля указанных временных точках в окно усов графике. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Все эксперименты, проведенные на животных, должны быть одобрены местными властями и комиссий по этике. В естественных условиях в инфекции экспериментов бактериальная нагрузка в различных принимающих нишах зараженных животных должно быть определено в различные моменты времени после инфицирования. В этих условиях эксперимента животные должны быть принесены в жертву до выделения бактерий из крови, носоглотки, bronchoalvelar промывания или органов, таких как легкие, селезенка, и мозг. Чтобы рассчитать количество бактерий на принимающей нише и оценить влияние бактериальных факторов на вирулентность, кровь или органы должны быть изолированы сопровождается бактериальной восстановления и покрытие на твердых средах. Бактериальная нагрузка затем количественно перечислении КОЕ. Чтобы достичь статистически значимые данные каждый раз, когда точка нуждается в группе мышей, которые при определенных экспериментальных условиях приводит к трудностям при обработке эксперимента из-за большого количества мышей.

ove_content "> В противоположность этому, метод Bioimaging реального времени меньше времени требуют подход, и каждый отдельный бактерии-инфицированных мышей можно контролировать несколько раз в течение определенного периода времени. метод визуализации позволяет визуализировать бактерий внутри животного в разные временных точках после заражения или даже в течение длительного периода времени. Кроме того, биолюминесценции измеряется с помощью программного обеспечения для анализа изображений оптический дополнительно обеспечивает количественную оценку фотонов, испускаемых зараженного животного. Это может быть ограничено определенной области мыши или в целом Животное может быть рассмотрен. В ин виво инфекции экспериментов пневмококков-инфицированных мышей должны контролироваться с интервалом в 8-12 ч, так как распространение пневмококков может быстро прогрессировать в беспородных CD-1 мышей. визуализации в реальном времени могут быть использованы для визуализировать трансмиграцию пневмококков из носоглотки в легкие и крови, и, кроме того, умножение пневмококков в кровипосле внутрибрюшинного инфекция может контролироваться резкому увеличению интенсивности биолюминесценции 26,28,29.

При сравнении вирулентности потенциал дикого типа пневмококков и изогенных мутантов важно, чтобы проверить первый эффект с потерей гена в пробирке под условиях культивирования. Различия между роста бактерий дикого типа и мутантов, в частности в химически определенной среде, уже показывают уменьшенную пригодность бактериальной 26. Таким образом, ослабление наблюдается при условиях в естественных условиях связан с измененной физиологии, ведущей к менее надежной пневмококков во время колонизации и инвазивных инфекций.

Однако, это должно быть отмечено, что этот метод визуализации, часто не достаточно, чтобы продемонстрировать эффект гена нокаутом по пневмококковой вирулентности. Похожие на патогенные бактерии пневмококки являются универсальными микроорганизмы и развивались многогранных механизмов то столкнуться хозяин и уклониться от иммунной системы. Следовательно, пневмококки производить с одной стороны, белков с разнообразными функциями, такими как адгезина PspC и, с другой стороны, они наделены нескольких белков, обладающих подобные функции, которые, таким образом, может компенсировать дефект белка из-за мутаций 4,17,18 , 35. В этих сценариях другие в естественных условиях инфекция эксперименты, такие как подхода сопутствующей инфекцией должен быть использован, чтобы расшифровать эффект с потерей белка функции в мутанта для колонизации или инвазивных инфекций 27,28.

Пневмококки колонизировать и инфицировать преимущественно людей, но были также изолированы от домашних животных или животных зоопарка 4,36,37. Чтобы расшифровать воздействие вирулентности или используются модели инфекции фитнес факторы мыши. Однако, не все пневмококковой штаммы мыши вирулентным, и что более важно, восприимчивость мышей зависит от генетического фона животных 22. Пневмококковойвирулентности исследования и исследования защиты являются в настоящее время проводится с CD-1 беспородных мышей. Тем не менее, нокаут мышей или трансгенных мышей также большой интерес, чтобы расшифровать роль принимающих факторов для инвазивных пневмококковых заболеваний. Нокаут или трансгенных мышей часто генерируются в линиях мышей, таких как C57/BL6 или Balb / с. Эти линии мышей менее восприимчивы против пневмококковой инфекции и высокая инфекции дозах, должны получить смертельную дозу, 50% (LD 50). В зависимости от дозы инфекции это сопротивление мышей может привести к снижению в реальном времени Bioimaging пневмококковой распространения в легкие или крови, так как пневмококки ограничены умножить таким образом, необходимой для обнаружения системой визуализации. Чтобы преодолеть это ограничение и, чтобы иметь возможность изображения распространения в реальном времени, высокие дозы инфекции должны быть использованы. Риск такого подхода может быть, что различия в восприимчивости хозяина не могут быть изучены также распространение прогрессирует слишком быстро.

через нос или внутрибрюшинно. Этот подход, в частности, подходит для сравнения вирулентности потенциал между дикого типа и мутантов S. пневмонии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования в лаборатории при поддержке грантов от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) и Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF) Медицинская инфекции геномики (ФКЗ 0315828A) в SH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1  
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2  
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A  
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2  
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376  
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151  
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500 mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany  
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany  
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok syringes with needle
Gel Loader Tips PeqLab 81-13790 MµltiFlex Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001  
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany  
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany  
Oligonucleotides  Eurofins MWG, Ebersberg, Germany  
Qiaprep Spin Midiprep Kit  Qiagen, Hilden, Germany 27104  
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106  
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
IVIS Spectrum Imaging System  Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
  2. WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
  3. Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
  4. Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
  5. Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
  6. Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
  7. Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
  8. Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
  9. Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
  10. Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
  11. Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
  12. Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
  13. Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
  14. Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
  15. Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
  16. Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
  17. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
  18. Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
  19. Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
  20. Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
  21. Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
  22. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
  23. Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
  24. Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
  25. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
  26. Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
  27. Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
  28. Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
  29. Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
  30. Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  31. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
  32. Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
  33. Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
  34. Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
  35. Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
  36. Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
  37. vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
  38. Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).

Tags

Инфекция выпуск 84 грам-положительных бактерий, Пневмония бактериальный респираторных заболеваниях животные модели внебольничная пневмония инвазивных пневмококковых заболеваний Пневмококки Bioimaging фактором вирулентности распространение биолюминесценции ИВИС спектра
После в режиме реального времени Влияние пневмококковой факторов вирулентности в острой Mouse пневмонии Модель Использование биолюминесцентных бактерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz,… More

Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter