Summary
肺炎链球菌是导致病原体引起严重的社区获得性肺炎，负责超过200万世界各地的死亡。的牵连健身或致病细菌因素的影响，可以在实时中采用发光细菌急性小鼠肺炎或菌血症模型来监测。
Abstract
肺炎是发展中国家的主要医疗保健问题和工业化国家之一，具有相当的发病率和死亡率。尽管在知识这个疾病，重症监护病房（ICU）的可用性，并使用有效的抗菌药物和有效的疫苗的进步，死亡率仍然很高1。 肺炎链球菌是社区获得性肺炎的病原体领先（CAP）和菌血症的人类最常见的原因之一。这种病菌配备的表面暴露的黏附和毒力因素导致肺炎和侵入性肺炎球菌疾病（IPD）的医疗设备。细菌健身或毒力因子在体内的作用进行评估是最重要的解开S。肺炎链球菌致病机制。肺炎，菌血症和脑膜炎的小鼠模型已被用于确定肺炎球菌因素在昼夜温差的影响ferent感染的阶段。在这里，我们描述了一个协议来监控实时传播肺炎球菌在小鼠鼻腔或腹腔内感染发光细菌之后。该结果表明，繁殖和传播的肺炎球菌的下呼吸道和血液，从而可以可视化并进行评价使用成像系统和所附的分析软件。
Introduction
由病毒或细菌呼吸道感染仍然是全球最常见的社区获得性或临床问题引起全球所有死亡的大约三分之一之一。关键细菌物种是流感嗜血杆菌和肺炎链球菌 2。然而，这些细菌种类是通常的自然呼吸道菌群的常见成分。因此，细菌马车是一定风险的侵入性疾病，并根据免疫状况或个人的倾向也。无症状定植被触发侵袭性感染。 肺炎链球菌是社区获得性肺炎（CAP）和菌血症人类最常见的原因之一，主要病原体。在健康个体S。肺炎链球菌 （肺炎球菌）往往是上呼吸道，在那里他们都面临着非致病性细菌无症状和无害殖民者常住菌也与病原体如嗜血杆菌属的。或金黄色葡萄球菌和人的免疫防御系统的第一道防线。携带率最高的是年幼的孩子（37％），甚至在拥挤的日间护理中心（58％）高3-5。最年轻的人群和老人，通过空气传播的载体和鼻咽部分泌物6接受肺炎球菌，属于使用的肺炎球菌结合疫苗（PCV10或PCV13在儿童和23价多糖PPSV23成人）一个高危人群和疫苗接种建议在美国（美国）和许多欧洲国家4。在PPSV23涵盖负责〜90％的菌血症性肺炎球菌疾病在美国和欧洲，预防成人从而有效地侵入性肺炎球菌疾病（IPD）的血清型，而PCVS涵盖儿童中最常见的血清型。因此，瞳距由于疫苗的种类（VT）是热镀CED但非疫苗血清型显示高毒力潜力及耐药性已经出现4,7-12。鼻咽部的水库是起点肺炎蔓延到鼻窦或中耳引发有害的局部感染。更重要的是，肺炎球菌直接通过气道蔓延至支气管和肺部造成威胁生命的第4,13。肺部感染常常伴随着组织和屏障的破坏，从而使病原体传播到血液中，并造成IPD。 CAP和IPD的发病率最高，免疫功能低下者或在4,13年代的极端。负责从共生与高致病病原体转换的情况仍在争论。然而，除了改变宿主的易感性和进化适应伴随着较高的毒力和增加的抗生素抗性已建议对PNE至关重要的影响umococcal感染14-16。
病原体被赋予了黏附素介导的亲密接触粘膜上皮细胞的多样性。克服气道黏液后，肺炎球菌粘附于宿主细胞是通过表面暴露粘附素与细胞受体相互作用的直接并利用细胞外基质成分或血清蛋白的桥联分子4,17,18便利。多才多艺的病原体肺炎球菌还配备了参与宿主免疫防御机制回避的因素。此外，它们具有适应各种宿主milieus如肺，血液和脑脊液（CSF），分别为5,17,19,20的能力。
细菌因素对发病机制和炎性宿主反应的影响进行了研究中的肺炎，菌血症实验动物模型中，或脑膜炎21-25。尽管是人类的病原体，这些模型是我们LL成立的破译肺炎球菌组织嗜性，致病机制，或肺炎球菌疫苗候选保护性。近交系小鼠品系的遗传背景决定了易患肺炎。鼻内感染了肺炎球菌免疫BALB / c小鼠，结果为：耐腐蚀，而CBA / Ca和SJL小鼠抗肺炎球菌感染22更容易。这意味着，类似于人类的遗传背景和宿主防御机制确定感染的结果。因此，有必要进一步努力解开抗性基因座的小鼠不容易受到肺炎球菌感染的基因组中。该发现导致了变化的体内毒性的协议。而不是过去常常使用的近交系BALB / c小鼠后，极易受到CD-1/MF1远交小鼠品系人现在通常用来研究的功能丧失的肺炎球菌的致病性或适用性的因素26-28的效果。此外，可用生物发光性肺炎和光学成像技术的允许感染的实时生物发光生物成像。在肺炎球菌的优化luxABCDE基因盒（质粒保罗的TN 4001 luxABCDE公里R）已经插入到染色体中通过转座子诱变的单一整合位点。生物发光肺炎链球菌已被用来评估短少在致病性或适用性的因素及其易位从一个解剖部位到另一个26,28-31肺炎球菌突变体的衰减。
在这里，我们提供了一个协议，用于在小鼠肺炎或败血症模型肺炎球菌感染的生物成像。放大和传播生物发光肺炎球菌在鼻内或腹膜内感染的小鼠可以很容易地随着时间的推移，使用光学成像系统和相同的动物在不同时间点监测。
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Protocol
这里所描述的动物感染实验必须严格按照当地和国际准则和规定的使用脊椎动物（ 如欧洲健康实验动物科学协会（FELASA）的联邦法）进行。实验必须由当地的伦理板和机构动物护理委员会的批准。所有实验与S肺炎在实验室或动物感染的II类生物安全柜进行。
1。生物发光Pneumocococi的传染性股票的制备
- 准备在Todd-Hewitt肉汤补充有1％（重量/体积）酵母提取物和20％甘油进行维护的终浓度在80℃下的库存肺炎球菌培养物
- 板块少量速冻股票肺炎球菌文化到血琼脂平板上，并在5％CO 2培养细菌10小时，在37℃。 Ŧ他血液琼脂平板上包含用于luxABCDE基因盒插入基因组的转座子插入适当的抗生素如卡那霉素（150微克/毫升）。
- 子培养出了新的殖民地到一个新的血琼脂平板上最多10小时的。
- 接种THY培养基补充有10％（V / V）热失活（30分钟，56℃）胎牛血清（FBS）与肺炎双球菌，开始培养时的OD 600的0.05-0.07。
- 培养肺炎球菌，不加搅拌，在37℃和5％CO 2，直到培养物达到的OD 600的0.35-0.40。增长将需要3-4小时之间。
- 通过离心收获的肺炎球菌在3750×g离心10分钟，并重新悬浮生物发光性的肺炎球菌的磷酸盐缓冲盐水pH为7.4（PBS）中补充有0.5％FBS中。
- 调整接种物至所需浓度在PBS/10％FBS中。感染剂量取决于所用的肺炎链球菌菌株和麦克风的遗传背景Ë。感染远交CD-1小鼠滴鼻S。肺炎 D39 勒克斯感染剂量应在20微升补充有90单位的透明质酸酶的悬浮液调整到1×10 7 CFU。请勿摇晃或涡流肺炎双球菌，因为这将触发自溶。
- 通过电镀10倍连续稀释到血琼脂和菌落计数在37℃下在5％CO 2培养过夜后验证接种浓度。
- 用光学成像系统测量生物发光验证肺炎球菌接种物的生物发光。
2。鼻内和小鼠腹腔感染生物发光肺炎球菌
- 使用雌性远交小鼠在7-10周龄时为急性肺炎和败血症模型。这些小鼠的重量应该是20-30克。
- 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠。配制混合液1.0毫克在100μl无菌0.9％氯胺酮和0.1毫克甲苯噻嗪（重量/体积）的氯化钠对小鼠体重为20g。这与50毫克/公斤体重的氯胺酮和5毫克/公斤体重为甲苯噻嗪的剂量是一致的。要准确，注射了麻醉剂之前权衡小鼠。
- 注入混合物进入腹膜腔，然后将动物放回笼子，直到麻醉作用和动物是narcotized。小鼠的呼吸会变得非常缓慢，很有规律。小鼠必须充分narcotized，从而使鼻内接种细菌悬浮液和吸入不会导致打喷嚏，因此，接种物的损失。这可以通过捏鼠标在他们的尾巴末端进行评估;完全narcotized鼠标将缺乏响应。
- 轻轻拿起narcotized鼠标和保持手指和拇指与鼻子直立（ 图1）之间的鼠标。
- 用移液管与狭长的小技巧（凝胶装载机提示），把多个小液滴生物发光肺炎球菌到鼠标26-29的鼻孔（10微升/鼻孔）。鼠标会不由自主地吸入的细菌。按住鼠标1-2分钟直立，观察小鼠是否打喷嚏或保持接种。
- 感染7-10周龄的CD-1小鼠经鼻内用1×10 7或7.5×10 7个肺炎链球菌菌株D39和TIGR4，一种感染剂量分别监测感染的实时性。检出限为系统而不由宿主组织的任何吸收是约1×10 6个发光细菌。
- 感染小鼠腹腔注射（IP）来评估和肺炎球菌的败血症小鼠感染模型BioImage以毒性。使用5×10 3 CFU在100μl菌株D39和1×10 4株TIGR4的。使用IP路由时鼠标不麻醉。
- 接种对照组用PBS。
图1。鼻内感染CD-1小鼠的与S肺炎 。 点击这里查看大图 。
3。可视化肺炎球菌传播到肺和血液使用成像系统
肺炎双球菌的雌性远系繁殖的CD1小鼠中实时使用体内成像系统的鼻内感染后图像的传播。
- 切换所述成像系统上，并启动位于preconfigurated计算机上的图像分析软件。
- 所述成像系统自动初始化和CCD相机热电冷却至90℃，即活性之前。
- 的设置，分级取决于测量小鼠的数目同时且在生物发光信号的强度。视场（FOV）的字段来监控动物的生物发光是可变的，为22.5厘米FOV之间的放大倍数范围内测量五只小鼠，和3.9厘米FOV测量单个鼠标一样的胸部的动物或零件或头部。
- 使用常规的1分钟，分级的中等程度，和22.5厘米的FOV（组D）的曝光时间。首先，选择发光成像模式，然后设置图像参数。
- 的信号的发射可能依赖于细菌菌株和所用的小鼠品系，以及鼠标的颜料。剃鼠的胸使用例如 C57BL / 6小鼠时，成像肺炎在这些小鼠中的发展时，它可以是有利的。
- 在prechosen时间间隔形象感染小鼠。测量小鼠急性肺炎模型的生物发光在最大8-12小时的时间间隔。通过observi还监测感染小鼠的福利纳克自己的外表，行为和决心重量的损失。
- 在成像设备的腔室中的测量之前的麻醉系统的麻醉室麻醉小鼠。开始吸入异氟醚和氧气的混合物，等到老鼠缓慢地呼吸，并定期。
- 放置麻醉动物进入系统的成像室，并保持小鼠仰卧位。上腔，然后将图像中的小鼠呼吸道顶部的CCD相机。
- 将用自己的鼻子动物进入试管，使吸入的麻醉药。
- 通过气体管道异氟烷进入成像室被允许维持麻醉。
- 要激活在腔顶部的CCD摄像头，并在成像软件启动生物发光光学成像，按“采集”。紧接小鼠在封闭腔室中的照片显示在屏幕上。一分钟后测量生物发光数据的叠加和照片被示出。
- 停止麻醉的图像叠加显示在软件的窗口后，把老鼠放回笼子。
- 监测小鼠进行恢复。
图2。麻醉和监测使用IVIS麻醉和IVIS频谱系统，分别为A）的IVIS光谱成像系统B）的IVIS系统麻醉的孵化室。 三）麻醉小鼠在孵化室感染肺炎球菌生物发光小鼠D）小鼠位于IVIS光谱成像室中与自己的鼻子吸入麻醉剂。_blank“>点击这里查看大图。
4。定量感染小鼠生物发光S的生物发光及评价肺炎
- 通过使用图像分析软件定量的总光子发射（光子/秒）确定的小鼠的选定区域的小鼠或生物发光强度。
- 使用光子发射在Excel数据表中所提供的数值，制成曲线图。由于数据的变化往往是分组小鼠内高，产生一个盒子晶须图形显示在感染肺炎球菌不同品系的小鼠的差异。
- 提供每小鼠的光子或备选的结果作为辐射率的所选区域的平均值（光子/秒/ cm 2 / SR）。
- ROI（感兴趣区域的）在光子模式的测量数据可以在不同的定量比较在不同的体内成像系统来RA的设置，因为在四射的单位测量自动考虑相机设置（ 如积分时间，分级，F /停止，和视场）。
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Representative Results
蛋氨酸收购和吸收是对肺炎球菌，保持健康在他们的主机利基32,33至关重要。蛋氨酸ABC转运脂蛋白是由SPD _ 0151基因（TIGR4：sp_0149）编码在D39和命名MetQ 32。肺炎球菌进一步产生蛋氨酸合成酶（D39：Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586，丈量和metF的）。蛋氨酸在一个化学成分确定的培养基中缺乏影响肺炎和类似，缺乏蛋氨酸32,33的蛋氨酸结合脂蛋白MetQ受损摄取的增长。这种缺陷可以通过加入高浓度的蛋氨酸的恢复。在小鼠实验中定植的突变体中缺乏MetQ的毒力并没有减弱在合并感染的实验与同基因野生型的显示，同时缺乏MetQ减毒肺炎球菌败血症和肺炎小鼠模型由显示确定细菌负荷32。使用此处所用的IVIS光谱的实时光学生物成像允许监测乘法和传播细菌在一个被感染的动物在不同时间点。
在此处所示的例子中，我们评估了蛋氨酸结合脂蛋白MetQ上定植和致病力通过应用急性肺炎感染小鼠模型的影响。 CD-1远交系小鼠（n = 10），分别用1×10 7细菌野生型菌株S的鼻内感染肺炎 D39 勒克斯 （PN149）或它的同基因的突变体D39 勒克斯ΔmetQ（ 表1）。该metQ突变体（PN252），通过与metQ基因在生物发光D39肺炎球菌的插入缺失诱变构建。因此，metQ基因，5'序列和3'sequence通过PCR使用引物382和385扩增。将PCR产物克隆到载体PGEMT-容易的，这就造成了质粒P559（ 表1）。通过反向PCR使用引物383和384（ 表2）的metQ序列（nt 58至nt的777）中删除，并以红霉素抗性基因盒（ 为ermB）利用质粒pE89（ 表1）作为DNA模板，通过PCR扩增和替换的引物对ermB_105/ermB_106（ 表2）。所得质粒P563如先前使用权限刺激肽1所述的34转化为肺炎双球菌。突变体缺乏脂蛋白MetQ（Spd_0151）培养在THY或补充有红霉素（5微克/毫升）的血琼脂平板上。
小鼠的健康状况连续监测。没有表现出应有的反应或发病的迹象时，处死动物。此外，肺炎球菌的传播从鼻咽部进入肺部和血液，导致严重的肺炎和败血症，是MONITO通过测量生物发光每隔八小时红色。在各组感染小鼠的7列10只小鼠的开发疾病的严重迹象，而其他3只小鼠没有表现出生物发光和存活（ 图3A）。成功地感染了生物发光野生型D39 勒克斯老鼠了32小时后，感染严重的肺部感染，内8-16小时而进行至败血症（ 图3A）。在时间点96小时所有小鼠死于那曾出现肺炎及败血症等感染后与D39 勒克斯 。甲硫氨酸结合脂蛋白的功能丧失的显著受损的肺炎球菌的毒性。经过32小时只有一个鼠标感染了metQ突变体表现为肺部感染弱，而其他表现的疾病和肺炎无明显体征。然而，48小时后严重肺部感染也变得明显，感染突变小鼠。其结果是，这些小鼠发生败血症72小时感染后，成为不迟于72小时后感染奄奄一息，这表明在急性肺炎感染模型MetQ的不足衰减肺炎球菌。
表1菌株和质粒名单。
表2引物列表。限制性位点以下划线表示。
| 底漆，旨在使用 | 引物名称 | 序列（5'-3'） |
| 插入 - 缺失诱变 | ||
| 的sp_0149 + 5'放大和 3'侧翼区 | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3' |
| 的sp_0149 +5反向PCR“和 3'侧翼区（pGEMTeasy） | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3' |
| 抗生素卡带放大 | ||
| 红霉素（ 为ermB） | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3' |
鼻腔感染后如图3所示。监测肺炎球菌的传播小鼠。小鼠A）生物发光成像光学用D39 勒克司或同基因的突变体D39luxΔmetQB）鼻内感染小鼠分组的生物发光强度（N =的值10）被示在一个盒子晶须图指定的时间点。 点击这里查看大图。
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Discussion
在动物身上进行的所有实验必须由地方当局和伦理委员会的批准。在体内实验感染的细菌负荷在感染动物的各种宿主龛，必须在不同时间点在感染后确定。在这些实验条件的动物具有从血液，鼻咽，bronchoalvelar灌洗或器官如肺，脾和脑细菌的隔离之前被牺牲掉。计算每个主机小生细菌的数量，并评估细菌因素对毒力的影响时，血液或器官必须由细菌分离随之恢复和电镀在固体培养基上。细菌负荷，然后由CFU的枚举量化。达到统计学上的每个时间点需要一组小鼠，这在一定的实验条件下导致在处理的实验，由于高数小鼠的困难显著数据。
ove_content“>相反，在实时生物成像方法是一种更短的时间要求苛刻的方法和每个单独的细菌感染的小鼠可以在一段时间内监视数次。成像技术允许动物内细菌的可视化在不同时间点后感染，甚至在相当长的一段时间，而且，与光学图像分析软件测定的生物发光进一步使由受感染的动物发射的光子的量化，这可以被限制在一个限定的鼠标或全部区域动物可以认为，在体内实验感染的肺炎球菌感染的小鼠在8-12小时的时间间隔进行监测，由于肺炎球菌的传播可以在远系繁殖的CD-1小鼠迅速进展的实时成像可以被用来可视化的肺炎球菌的轮回从鼻咽部进入肺和血液，此外，肺炎双球菌的血液中的乘法后腹腔感染可通过生物 发光强度26,28,29的急剧增加被监控。当比较的野生型肺炎球菌和同基因的突变体的致病潜力至关重要第一测试缺失型基因在体外培养条件下的效果。野生型菌和突变体之间的生长差异，特别是在化学上确定的培养基中，已经表明一个减少细菌的健身26。由此，衰减在体内条件下观察到的是具有改变的生理学导致较不稳健的肺炎球菌中定殖和侵入性感染。
然而，它必须提及的是，这种成像技术是经常不足以证明基因敲除对肺炎链球菌毒力的影响。类似于其他致病菌肺炎链球菌是多功能微生物和已经发展多方面的机制吨Ø遇到主机和逃避免疫系统。因此，肺炎球菌产生一方面蛋白与歧管功能，如粘附PSPC并且，在另一方面，它们被赋予了几种蛋白质具有类似的功能，而由此可补偿的蛋白质的缺陷是由于突变4,17,18 ，35。在这些场景中其他体内感染实验，如合并感染的方法已被采用来破译缺失型蛋白的功能的突变定植或侵袭性感染27,28的效果。
肺炎球菌定植和感染优先人类，但也分离到宠物或动物园动物4,36,37。破译致病力的影响性或适用性的因素小鼠感染模型的使用。然而，并非所有肺炎球菌菌株是鼠毒性，并且更重要的是，老鼠的敏感性依赖于动物22的遗传背景。肺炎球菌毒力的研究和保护的研究与时下的CD-1小鼠远交进行。然而，基因敲除小鼠或转基因小鼠高息也破译的宿主因素的侵入性肺炎球菌疾病的作用。基因敲除或转基因小鼠中经常小鼠品系如C57/BL6或BALB / c小鼠产生。这些小鼠品系是肺炎球菌感染和感染高剂量不易受须取得致死剂量，50％（LD 50）。根据感染剂量的小鼠的这种阻力可能会损害肺炎传播的实时生物成像到肺或血中，由于肺炎球菌仅限于由成像系统所需要的检测的方式繁殖。为了克服这一限制，并能够以图像在实时的传播，感染高剂量必须予以确认。这种方法的风险可能是在宿主易感性的差异作为传播的进展太快不能进行探讨。
经鼻内或腹膜内途径被感染。这种方法是特别合适的野生型和S的突变体之间的比较的致病潜力肺炎 。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
研究在实验室被授予由德意志研究联合会（DFG医管局3125/3-2，DFG医管局3125/4-2）和德国联邦教育与研究部（BMBF）医疗感染基因组学（FKZ 0315828A）到上海的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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