Summary
폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.
Abstract
폐렴 개발의 주요 건강 문제와 선진국 중 하나이며 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이 질병의 지식, 중환자 실 (ICU)의 가용성, 강력한 항균제하고 효과적인 백신의 사용의 발전에도 불구하고, 사망률은 1 높은 수준으로 유지. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴의 주요 원인균 (CAP)입니다 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나. 이 병원체는 표면에 노출 된 adhesins 폐렴 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)에 기여 독성 요인의 armamentarium에 장착되어 있습니다. 세균의 적합성 또는 독성 인자의 생체 내 역할의 평가는 S.를 해결하는 것을 가장 중요합니다 폐렴 병원성 메커니즘. 폐렴, 균혈증 및 뇌막염 뮤린 모델 DIF에서 폐렴 구균 성 요인의 영향을 결정하기 위하여 사용되고감염의 단계를 ferent. 여기에서 우리는 비강 또는 생물 발광 박테리아와 복강 내 감염 후 마우스에서 실시간으로 폐렴 구균 보급에 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 결과는 묘화 시스템 및 첨부 된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각 및 평가 될 수 하부 호흡기 및 혈액에서 곱셈과 폐렴 구균의 확산을 보여준다.
Introduction
바이러스 나 세균에 의한 호흡기 감염은 전세계의 모든 사망의 약 삼분의 원인이 전 세계적으로 가장 일반적인 지역 사회 획득 임상 문제 중 하나가 남아있다. 키 세균 종은 헤 모필 러스 인플루엔자 및 폐렴 구균이 있습니다. 그러나 이러한 세균 종은 일반적으로 자연 호흡기 식물의 일반적인 성분이다. 따라서 세균 마차 침략 질환과 면역 상태 나 개인의 성향에 따라에 대한 특정 위험에 있습니다. 증상이 식민지는 침략적인 감염에 트리거됩니다. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴 (CAP)과 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나의 주요 원인균이다. 건강한 사람의 S. 폐렴 (폐렴 구균)는 종종 그들이 비병원성 박테리아에 직면 상부 호흡기의 증상 및 무해 식민지 개척자이다뿐만 아니라, 헤 모필 러스 종으로 병원균 상주 식물의. 또는 포도상 구균 및 인간의 면역 방어 체계의 첫번째 줄. 운송 요금은 어린이에서 가장 높은 (37 %)과 3-5 (58 %) 붐비는 보육 시설 내에서 더 높은. 젊은 인구와 노인, 사업자 및 비 인두 분비물 6에서 에어로졸 전송을 통해 폐렴을 받고, 폐렴 구균 결합되는 백신 (성인 어린이와 23 가의 다당류 PPSV23에서 PCV10이나 PCV13) 중 하나를 사용하여 위험이 높은 그룹과 예방 접종에 속하지 미국 (미국)과 많은 유럽 국가 4 추천합니다. PCVs 어린이에서 가장 널리 혈청 형을 포함하는 동안 PPSV23는, 성인에 따라서 효율적으로 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)을 방지하는 미국과 유럽의 bacteremic 폐렴 구균 질환의 90 % ~에 대한 책임 혈청 형을 포함한다. 결과적으로, IPD 인해 백신 유형 (VT)에 redu은높은 독성의 가능성과 항생제 내성을 표시 CED하지만 nonvaccine 혈청 형은 4,7-12을 등장했습니다. 저수지 인두 유해 지역 감염을 시작하는 부비동 또는 중간 귀를 확산 폐렴 구균의 출발점입니다. 생명을 위협하는 CAP 4,13의 결과로 기관지 및 폐에기도를 통해 직접 전파 더 중요한 것은, 폐렴 구균. 폐 감염은 종종 이렇게 혈액으로 확산 병원체를 활성화하고 IPD의 원인, 조직과 장벽의 파괴와 함께 제공됩니다. CAP 및 IPD의 발생 빈도는 면역 사람의 나이 4,13의 극단에서 가장 높다. 높은 독성을 가진 병원체에 공생의 변환을 담당하는 상황이 논쟁에서 아직도있다. 그러나, 높은 독성 항생제 저항의 증가와 함께 동반 호스트 감수성과 진화 적응의 변화 외에 PNE에 중요한 영향을 미칠 것으로 제안되었다umococcal 감염 14-16.
병원체는 상피 세포 점막 친밀한 접촉을 매개 adhesins의 다양성을 부여한다. 기도 점액을 극복 한 후, 세포를 호스팅하는 폐렴 구균 준수는 세포 수용체와 표면에 노출 된 adhesins의 직접적인 상호 작용을 통해 분자에게 4,17,18 가교로서 세포 외 기질의 구성 요소 또는 혈청 단백질을 이용하여 용이하게된다. 등의 다양한 병원체 폐렴 구균은 숙주 면역 방어 메커니즘의 회피에 관련된 요소를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 이러한 각각 폐, 혈액 및 뇌척수액 (CSF), 5,17,19,20와 같은 다양한 호스트 milieus에 적응하는 능력이있다.
발병 기전과 염증 호스트 반응에 세균 요인의 영향은 폐렴, 균혈증의 실험 동물 모델에서 조사, 또는 21-25 뇌막염됩니다. 인간의 병원체에도 불구하고,이 모델은 우리입니다폐렴 구균 조직의 굴곡 운동, 독성 메커니즘, 또는 폐렴 구균 백신 후보의 보호도를 해독 LL 설립. 근친 마우스 종자의 유전 적 배경은 폐렴 구균에 감수성을 결정한다. CBA / CA와 SJL 생쥐는 폐렴 구균 감염 (22)에 대해 더 민감 동안 비강 폐렴 구균에 감염된 BALB / c 마우스는, 저항하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 인간 유전 배경 및 숙주 방어 메카니즘과 유사한이 감염의 결과를 결정한다는 것을 의미한다. 따라서, 더 노력이 폐렴 구균 감염에 덜 민감 쥐의 게놈에 저항 궤적을 해명 할 필요합니다. 연구 결과는 생체 내 독성 프로토콜의 변화를 이끌고있다. 대신 종종 과거에 사용 근친 BALB / c 마우스의, 매우 민감 CD-1/MF1 비근 교계 마우스 종자는 요즘 종종 기능 상실 폐렴 구균 독성의 적합성에 26-28 요인의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 가용성생물 발광 폐렴 구균 및 광학 이미징 기술의 감염의 실시간 생물 발광 및 bioimaging는 허용한다. 폐렴 구균에 최적화 luxABCDE 유전자 카세트 (플라스미드 폴-A 테네시 luxABCDE 4001 km의 R)는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 염색체의 단일 통합 부위에 삽입되었다. 생물 발광 폐렴 구균은 독성의 적합성 요인과 다른 26,28-31 한 해부 사이트에서 자신의 전위 결핍 된 폐렴 구균 돌연변이 체의 감쇠를 평가하기 위해 사용되었다.
여기에서 우리는 쥐의 폐렴이나 패혈증 모델에서 폐렴 구균 감염의 및 bioimaging위한 프로토콜을 제공합니다. 비강 내 또는 복강 내 감염 생쥐의 증폭 및 생물 발광 폐렴 구균의 보급이 용이하게 상이한 시점에서 광학 이미징 시스템과 같은 동물을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있다.
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Protocol
여기에 설명 된 동물 감염 실험 지침과 척추 동물의 사용에 대한 규제 지역 및 국제 (실험 동물 과학 협회 (FELASA)의 연맹의 예를 들면 유럽의 건강 법률)에 따라 설치를 수행해야합니다. 실험은 지역 윤리적 보드 및 기관 동물 관리위원회의 승인을 받아야합니다. S. 모든 실험 실험실이나 동물의 감염 폐렴은 클래스 II 바이오 안전성 내각에서 실시하고 있습니다.
1. 생물 발광 Pneumocococi의 감염성 주식의 준비
- 80 ° C에서 (w / v)의 효모 추출물 및 유지 보수 20 % 글리세롤의 최종 농도 1 %로 보충 토드 휴이트 국물 재고의 폐렴 구균 문화를 준비
- 혈액 한천 플레이트에 깊은 냉동 재고 폐렴 구균 문화 소량의 플레이트와 5 % CO 2에서 37 ° C에서 10 시간 동안 박테리아를 배양한다. 티그는 혈액 한천 플레이트는 게놈에 luxABCDE 유전자 카세트의 트랜스포존 삽입 카나마이신 (150 ㎍ / ㎖)로 적절한 항생제가 포함되어 있습니다.
- 10 시간의 최대 새로운 혈액 한천 접시에 신선한 식민지를 하위 재배하고 있습니다.
- THY 매체는 10 % (V / V) 열 (56 ° C에서 30 분)를 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 폐렴 구균과 함께 보충 및 OD 0.05 ~ 600의 문화를 시작 접종한다.
- 문화 OD 0.35-0.40 600에 도달 할 때까지 37 ° C에서 교반 및 5 % CO 2없이 폐렴 구균을 배양한다. 성장은 3 ~ 4 시간 정도 소요됩니다.
- 10 분 동안 3,750 XG에 0.5 %의 FBS와 보충 인산염 완충 생리 식염수의 pH 7.4 (PBS)에서 발광 생물 폐렴 구균을 재현 탁 원심 분리하여 수확 폐렴 구균.
- PBS/10 %의 FBS에서 원하는 농도로 접종을 조정합니다. 감염 량은 사용 된 폐렴 구균 균주와 마이크의 유전 적 배경에 따라 달라집니다전자. S.과 비강 비근 교계 CD-1 마우스를 감염 폐렴 D39 감염 량은 90 단위의 히알루로 보충 20 μL의 현탁액에 1 × 10 7 CFU로 조정해야 럭스. 이 자기 분해를 트리거 때문에, 흔들거나 소용돌이 폐렴 구균하지 마십시오.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 후 혈액 한천과 식민지의 열거에 10 배 희석으로 도금하여 접종 농도를 확인합니다.
- 광학 영상 시스템을 이용하여 생물 발광을 측정함으로써 폐렴 구균 균액의 생물 발광을 확인한다.
2. 생물 발광 폐렴 구균과 비강 및 마우스의 복강 내 감염
- 급성 폐렴과 패혈증 모델 7 ~ 10 주 시대에 여성 비근 교계 마우스를 사용합니다. 이 마우스의 무게 20 ~ 30 g 인이어야한다.
- 케타민 (ketamine)과 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 혼합물 1.0 밀리그램을 준비100 ㎕의 멸균 0.9 %에서 케타민과 0.1 밀리그램 자일 라진 20g의 체중을 가진 마우스에 대한 (w / v)의 염화나트륨. 이것은 케타민위한 / kg 체중 50 MG 및 자일 라진 대해 5 ㎎ / kg 체중의 투여 량과 일치한다. 정확한, 마취제의 주입하기 전에 마우스의 무게를.
- 복막 캐비티에 혼합물을 주입하고 마취제 행동과 동물이 narcotized 때까지 다시 케이지에 동물을 배치합니다. 마우스의 호흡이 매우 느리고 일정한 될 것입니다. 마우스는 세균 현탁액의 비강 접종 및 흡입은, 따라서 접종의 손실을 재채기가 발생하지 않도록, 완전히 narcotized해야합니다. 이것은 그들의 꼬리의 끝에서 마우스를 곤란하게하여 평가 될 수 있으며, 완전히 narcotized 마우스 응답이 결여된다.
- 부드럽게 narcotized 마우스를 들고 똑바로 코 (그림 1)과 함께 손가락과 엄지 손가락 사이에 마우스를 누르고 있습니다.
- 좁고 긴 팁 (젤 로더와 피펫을 사용하여팁) 마우스 26-29의 콧 구멍 (10 μL / 콧 구멍)에 여러 개의 작은 물방울 생물 발광 폐렴 구균 놓습니다. 마우스는 무의식적으로 박테리아를 흡입합니다. 똑바로 마우스 1-2 분을 잡고 마우스가 재채기 또는 접종을 유지할지 여부를 관찰합니다.
- 실시간으로 감염을 모니터링하기 위해, 각각 변형 D39과 TIGR4, 1 × 10 7 7.5 × 10 7 폐렴 구균의 감염 량과 비강 7-10주 된 CD-1 마우스를 감염. 숙주 조직에 의한 흡수는없는 시스템에 대한 검출 한계가 약 1 × 106 생물 발광 박테리아이다.
- 복강 쥐를 감염 (IP)을 평가하고 패혈증 마우스 감염 모델에서 폐렴 구균의 바이오 이미지 독성합니다. 변형 D39의 100 μL에 5 × 10 3 CFU를 사용하여 변형 TIGR4의 1 × 10 4. IP 경로를 사용하는 경우 마우스를 마취하지 않습니다.
- PBS로 제어 마우스를 접종.
그림 1. S.와 CD-1 마우스의 비강 감염 폐렴. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
3. 이미징 시스템을 사용하여 폐 및 혈액에 폐렴 구균 전파를 시각화
생체 내 이미징 시스템을 이용하여 실시간으로 비근 교계 CD1 암컷 마우스의 비강 감염 후 폐렴 구균의 콘텐츠 보급.
- 영상 시스템에 전환하고 preconfigurated 컴퓨터에있는 이미지 분석 소프트웨어를 시작합니다.
- 촬상 시스템은 자동으로 초기화하고 CCD 카메라는 열전 활성화되기 전에 90 ° C로 냉각된다.
- 설정 및 비닝 측정 마우스의 수에 의존동시에 생물 발광 신호의 강도에. 동물의 생물 발광을 모니터하는 뷰 (FOV)의 필드는 가변이며, 배율은 가슴 같은 동물의 단일 마우스 또는 부위를 측정하기 위하여 오 생쥐를 측정하기 22.5 cm의 FOV 사이의 범위, 및 3.9 cm의 FOV 또는 머리.
- 정기적으로 1 분, 비닝 (binning)의 중간 정도, 22.5 cm의 FOV (세트 D)의 노출 시간을 사용합니다. 첫째, 발광 촬상 모드를 선택하고 촬상 파라미터를 설정.
- 신호의 방출은 박테리아 균주 및 사용 마우스 균주, 및 마우스의 안료에 의존 할 수있다. 예를 들어, C57BL / 6 마우스를 사용하는 경우이 마우스 폐렴의 발전을 이미징 할 때 유용 할 수있는 생쥐의 가슴을 면도.
- 이미지 prechosen 시간 간격으로 쥐를 감염. 최대 8 ~ 12 시간의 시간 간격으로 급성 폐렴 모델 마우스의 생물 발광을 측정합니다. observi에 의해 감염된 마우스의 복지를 모니터링자신의 외모, 행동, 체중의 손실의 결정을 겨.
- 이전 챔버의 측정에 영상 장비의 마취 시스템의 마약 챔버에 마우스를 마취. 이소 플루 란과 산소의 혼합물의 흡입을 시작하고 마우스는 천천히 규칙적으로 숨을 쉴 때까지 기다립니다.
- 시스템의 이미징 챔버로 마취 동물을 놓고 누운 위치에 마우스를 유지. 실 것입니다 다음 이미지 쥐의기도의 상단에 CCD 카메라.
- 마취제를 흡입 할 수 있도록 관에에 자신의 코를 가진 동물을 놓습니다.
- 가스 튜브를 통해 촬상 챔버로 이소 플루 란 마취 엔트리를 유지하도록 허용된다.
- 챔버의 상단에 CCD 카메라를 활성화하려면 및 이미징 소프트웨어의 생물 발광 광학 영상을 눌러 "획득"을 시작합니다. 즉시 폐쇄 챔버에 쥐의 사진이 화면에 나타납니다. 1 분 후 생물 발광 데이터의 오버레이를 측량하고 사진이 도시되어있다.
- 이미지 오버레이 소프트웨어의 창에 표시 한 후 마취를 중지하고 다시 자신의 새장에 쥐를 넣어.
- 마우스 복구를 위해 모니터링된다.
그림 2. 마취 배양 챔버에서 마취 배양 챔버와.) IVIS 스펙트럼 이미징 시스템. B) IVIS 마취 시스템. C) 마우스 각각 IVIS 마취 및 IVIS 스펙트럼 시스템을 사용하여 발광 생물 폐렴 구균에 감염된 생쥐의 모니터링 자신의 코가 마취제를 흡입과 IVIS 스펙트럼 이미징 챔버 내에 위치. D) 마우스._blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 생물 발광 S.에 감염 마우스의 생물 발광의 정량화 및 평가 폐렴
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 광자 (포톤 / 초)를 정량화하여 마우스 또는 마우스의 선택된 영역의 생물 발광 강도를 결정한다.
- 그래프를 준비하는 Excel 데이터 시트에서 제공하는 광자 방출의 값을 사용합니다. 데이터 변이는 종종 그룹화 생쥐 내의 높기 때문에, 상이한 폐렴 구균 균주로 감염된 마우스에서의 차이를 표시하는 박스 휘스커 그래프를 생성한다.
- 마우스 당 광자 또는 선택 영역의 복사 휘도의 평균 (광자 / 초 / cm 2 / SR)와 같은 대안 적 결과를 제공합니다.
- 포톤 모드 ROI (관심 영역)의 측정 데이터를 정량적으로 제공된 다른 생체 내 이미징 시스템에 걸쳐 다른 비교 될 수있다생기 단위로 측정이 자동으로 계정에 카메라 설정을 (예 : 통합 시간, 비닝 (binning), F / 중지하고, 시야) 가지고 있기 때문에 RA 설정.
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Representative Results
메티오닌의 수집 및 흡수는 자신의 호스트의 틈새 (32, 33)의 체력을 유지하기 위해 폐렴 구균에 대한 중앙 중요하다. 메티오닌 ABC 수송 단백은 SPD _ 0151 유전자 (TIGR4 : sp_0149)에 의해 D39으로 인코딩되어 MetQ 32라는 이름의. 폐렴 구균은 또한 메티오닌 생합성 효소 (-; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, 벼 및 METF Spd_0511 Spd_0510 D39)를 생산하고 있습니다. 화학적 매체에있는 메티오닌의 부족은 폐렴 구균과 유사한, 메티오닌 (32, 33)의 메티오닌 결합 단백 MetQ 장애인 이해의 부족의 성장에 영향을 미칩니다. 이 결함은 메티오닌의 고농도 첨가에 의해 복원 될 수있다. MetQ의 부족에 의해 도시로 패혈증과 폐렴의 마우스 모델에서 폐렴 구균을 감쇠 동안 마우스 식민지 실험에서 MetQ 결핍 돌연변이는 동질 야생형과 동시 감염 실험에서와 같이 독성 감쇠되지 않았습니다세균 부하 (32)를 결정하는 단계를 포함한다. 여기에 사용 된 IVIS 스펙트럼을 사용하여 실시간 광학 및 bioimaging는 서로 다른 시간 지점에서 하나의 감염된 동물의 곱셈과 박테리아의 확산을 모니터링 할 수 있습니다.
여기에 표시된 예에서, 우리는 급성 폐렴 감염 마우스 모델을 적용하여 식민지 독성에 지단백 MetQ 바인딩 메티오닌의 영향을 평가했다. CD-1 비근 교계 마우스 (N = 10) 야생형 균주 S. 1 × 10 7 박테리아 비강 감염 폐렴 D39 럭스 (PN149) 또는 동질 돌연변이 D39 럭스 Δ metQ (표 1). metQ 돌연변이 (PN252)는 발광 생물 D39의 폐렴 구균에 metQ 유전자의 삽입 - 삭제 돌연변이에 의해 건설되었다. 따라서 metQ 유전자 5 '서열 및'서열은 프라이머 (382) 및 (385)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물을 벡터에 클로닝 하였다 PGEMT-쉽게, 플라스미드 p559 (표 1)의 결과. 역 PCR에 의한 프라이머 383 및 384 (표 2) metQ 순서 (NT 58 NT 777)를 삭제하고 DNA를 주형으로 플라스미드 pE89 (표 1)를 사용하여 PCR로 증폭 에리스로 마이신 저항 유전자 카세트 테이프 (ermB)에 의해 대체되었다를 사용하여 프라이머 쌍 ermB_105/ermB_106 (표 2). 그 결과 플라스미드는 이전에 역량 자극 펩티드를 사용하여 설명 된대로 (34)가 폐렴 구균 변모했다 p563. 지단백질 MetQ (Spd_0151)가 결실 된 돌연변이 체 THY 또는 에리스로 마이신 (5 ㎍ / ml)로 보충 된 혈액 아가 플레이트 상에 배양 하였다.
마우스의 건강 상태를 연속적으로 모니터링 하였다. 더 적절한 응답이나 병적 상태의 징후를 보여주는 경우 동물이 희생되었다. 또한, 심한 폐렴과 패혈증으로 이어지는 폐와 혈액에 비 인두에서 폐렴 구균 보급, 과정 제어했다생물 발광에게 8 시간마다 측정하여 빨강. 다른 3 마우스는 어떤 생물 발광을 보여주지 및 (그림 3A)를 살아있는 동안 감염된 생쥐의 각 그룹에서 10 쥐 중 7, 질병의 심한 증상을 개발했다. 성공적으로 발광 생물 야생 형 D39 럭스에 감염된 마우스는 32시간에게 패혈증 (그림 3A)에 8-16 시간 내에 진행 감염 후 심각한 폐 감염을 개발. 시간 포인트 96 시간에 모든 마우스는 폐렴과 패혈증 D39 럭스와 후 감염을 개발했다가 굴복. 기능 상실 메티오닌 결합 단백의 크게 폐렴 구균의 독성을 손상. 다른 질환과 폐렴의 명백한 징후를 보이지 않았다 동안 32 시간 후 metQ 돌연변이에 감염 하나의 마우스, 약한 폐 감염을 보여 주었다. 그러나 48 시간 후 심각한 폐 감염은 돌연변이에 감염된 마우스에서 또한 명백하게되었다. 그 결과,이 마우스는 패혈증 72 시간을 개발후 감염과 급성 폐렴 감염 모델에서 MetQ의 결핍이 폐렴 구균을 감쇠 시연, 이후 72 시간 게시물 감염보다 죽어가는되었다.
표 1. 긴장과 플라스미드 목록.
표 2. 뇌관 목록. 제한 사이트는 밑줄이 그어집니다.
| 프라이머 사용 목적 | 프라이머 이름 | 서열 (5'-3 ') |
| 삽입 - 삭제 돌연변이 유발 | ||
| + 5 sp_0149 '의 증폭 3 '지역의 측면에 | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| 역 + 5 sp_0149의 PCR '와 3 '측면에서는 지역 (pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| 항생제 카세트 증폭 | ||
| 에리스로 마이신 (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
비강 감염 후 마우스에서 폐렴 구균 보급의 그림 3. 모니터링. D39 럭스 또는 동질 돌연변이 D39의 luxΔmetQ. B)와 비강 감염 마우스의 A) 바이오 루미 네 센트 광학 영상 분류 된 생쥐의 생물 발광 강도의 값은 (N = 10) 표시됩니다상자 수염 그래프에 표시된 시점에. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물에서 실시한 모든 실험은 지역 당국과 윤리위원회의 승인을 받아야합니다. 생체 내 감염 실험에서 감염된 동물의 다양한 호스트 틈새에 세균 부하는 다양한 시점 후 감염에서 결정되어야한다. 이러한 실험 조건 하에서 동물은 종래의 혈액, 인두, bronchoalvelar 세척, 또는 폐, 비장, 뇌 등의 장기에서 박테리아의 분리에 희생되어야한다. 호스트 틈새 당 세균 수를 계산하고 병원성 세균의 요인의 영향을 평가하기 위하여, 혈액이나 장기 세균성이어서 격리되어야하는 회수와 고체 매체에 도금. 세균 부하는 다음 CFU의 열거에 의해 정량화된다. 통계적으로 각 시점에서 특정 실험 조건 하에서 인해 마우스의 높은 숫자로 실험을 취급의 어려움에 이르게 쥐 그룹을 필요로 중요한 데이터 도달.
ove_content "> 반대로, 실시간 및 bioimaging 방법은 시간이 덜 요구하는 방식과 각 세균에 감염된 마우스가 일정 기간에 걸쳐 여러 번 모니터링 할 수있다. 이미징 기술은 다른에서 동물 내의 박테리아의 가시화를 허용 시간은 감염 후 또는 연장 기간 동안 포인트. 또한, 광학 영상 분석 소프트웨어로 측정 생물 발광 더욱 감염된 동물에 의해 방출되는 광자의 정량을 가능하게한다. 이것은 마우스 또는 전체의 정의 된 영역에 한정 될 수있다 동물이 고려 될 수있다. 폐렴 구균의 확산 비근 교계 CD-1 마우스에서 급속히 진행 수 있으므로 생체 내 감염 실험의 폐렴 구균에 감염된 마우스에서, 8-12 시간 간격으로 모니터 할 수있다. 실시간 이미징에 사용될 수있다 폐 및 혈액으로 비 인두에서 폐렴 구균의 윤회를 시각화하고,뿐만 아니라, 혈액에있는 폐렴 구균의 증식복강 내 감염은 생물 발광 강도 26,28,29의 극적인 증가로 모니터링 할 수있다 후에.야생형 폐렴 구균 및 동질 돌연변이 독성 잠재력을 비교할 경우 먼저 시험 관내 배양 조건 하에서 상실 유전자의 효과를 테스트하기 위해 필수적이다. 야생형 박테리아와 돌연변이 사이에 성장 차이는 화학적 매체, 특히 이미 감소 세균 피트니스 (26)를 나타냅니다. 따라서, 생체 내 조건에서 관찰 감쇠 식민지 침략 감염시 덜 강력한 폐렴 구균에 이르는 변경된 생리와 연관되어 있습니다.
그러나이 영상 법은 종종 병원성 폐렴에 유전자 녹아웃의 효과를 입증하기에 충분하지 않은 것으로 언급되어야한다. 다른 병원성 세균 폐렴과 유사하게 다양한 미생물과 다각적 인 메커니즘 (T)를 진화O 호스트가 발생하고 면역 체계를 회피. 결과적으로, 폐렴 구균은 히젼 PSPC하고, 다른 한편으로는 이에 의한 돌연변이 4,17,18에 단백질의 결함을 보상 할 수있는 유사한 기능을 나타내는 여러 단백질이 부여되는 것과 폴드 기능을 가진 한편 단백질을 생산할 35. 이러한 시나리오에서는 이러한 동시 감염의 접근과 같은 다른 생체 감염 실험은 식민지 침략적인 감염 (27, 28)에 대한 돌연변이의 손실의 단백질 기능의 효과를 해독하기 위해 사용되어야한다.
폐렴 구균은 우선적으로 인간뿐만 아니라 애완 동물이나 동물원의 동물 4,36,37에서 고립 된 정착 및 감염. 독성의 영향을 해독 또는 피트니스 요인 마우스 감염 모델이 사용됩니다. 그러나, 모든 폐렴 구균 균주는 마우스 독성이고, 더 중요한 것은, 마우스의 감수성은 동물 (22)의 유전 적 배경에 따라 달라진다. 폐렴 구균독성 연구 및 보호 연구는 요즘 CD-1 비근 교계 마우스를 실시하고 있습니다. 그러나 마우스를 녹아웃 또는 형질 전환 마우스는 침략 폐렴 구균 질환에 대한 호스트 요인의 역할을 해독 높은 관심 또한 있습니다. 녹아웃 또는 형질 전환 마우스는 종종 C57/BL6 또는을 Balb / C 마우스와 같은 변종으로 생성됩니다. 이 마우스 변종 폐렴 구균 감염과 높은 감염 량에 대해 덜 민감하다는 치사량, 50 % (LD 50)을 받아야합니다. 폐렴 구균은 영상 시스템의 탐지에 필요한 방식으로 번식 제한되어 있기 때문에 감염 량에 따라 마우스의이 저항은 폐나 혈액에 폐렴 구균 보급의 실시간 및 bioimaging하지 않을 수 있습니다. 이 한계를 극복하고 이미지를 실시간으로 보급 할 수있는, 높은 감염 복용 활용해야합니다. 이 접근법의 위험이 보급이 너무 빠르게 진행되는 숙주 감수성의 차이는 탐색 할 수 없다고 할 수있다.
통해 감염된 마우스에있는 폐렴 구균 감염을 모니터링 비교하고 특성화하는 우수한 방법을 나타낸다. 이 접근법은 특히 야생형과 돌연변이의 S. 사이 독성 잠재력을 비교할 적합 폐렴.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
실험실에서 연구 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) 및 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF) 의료 감염 유전체학 (FKZ 0315828A)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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