Summary
Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.
Abstract
דלקת ריאות היא אחת הבעיות הגדולות הבריאות במדינות מתפתחים ומתועשות והיא קשורה עם תחלואה ותמותה ניכרות. למרות התקדמות בידע של מחלה זו, הזמינות של יחידות לטיפול נמרץ (ICU), והשימוש בסוכני מיקרוביאלית חזקים וחיסונים יעילים, שיעורי התמותה עדיין גבוהים 1. Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל של דלקת ריאות שנרכשה בקהילה (CAP) ואחת הסיבות השכיחות ביותר של קטרמיה בבני אדם. פתוגן זה מצויד בארסנל של adhesins משטח חשוף וגורמים ארסי תורמים לדלקת ריאות ומחלת ריאות פולשנית (IPD). ההערכה של תפקיד vivo של גורמי כושר או ארסי חיידקים היא בעל חשיבות עליונה לפענח ס מנגנוני פתוגניות דלקת ריאות. מודלים עכבריים של דלקת ריאות, בקטרמיה, ודלקת קרום מוח נמצאים בשימוש כדי לקבוע את ההשפעה של גורמי דלקת ריאות בdifferent שלבים של הזיהום. כאן אנו מתארים פרוטוקול לפקח בהפצת דלקת ריאות בזמן אמת בעכברים לאחר אפי או זיהומי intraperitoneal עם חיידקי bioluminescent. התוצאות מראות כפל והפצת pneumococci בדרכי נשימה התחתונה ודם, אשר ניתן דמיינו והוערכו באמצעות מערכת הדמיה וניתוח התוכנה הנלווית.
Introduction
זיהומים בדרכי נשימה הנגרמים על ידי וירוסים או חיידקים נשארים אחת בעיות הקהילה רכשה או קליניות הנפוצות ביותר בעולם גורמות כלשליש מכל המוות בכל עולם. מיני החיידקים העיקריים הם Haemophilus influenzae וStreptococcus pneumoniae 2. עם זאת, מיני חיידקים אלה הם בדרך כלל מרכיבים משותפים של הצמחייה בדרכי נשימה הטבעית. כך מרכבת חיידקים גם היא מסיכון מסוים למחלה פולשנית ובהתאם למצב או נטיות של יחידים חיסוניים. קולוניזציה אסימפטומטיים מופעלת לזיהומים פולשניים. Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל של דלקת ריאות שנרכשו בקהילה (CAP) ואחד הגורמים השכיחים ביותר של קטרמיה בבני אדם. אצל אנשים בריאים ס pneumoniae (pneumococci) הם לעתים קרובות מתיישבים ללא תסמינים ובלתי מזיקים של דרך הנשימה העליונה, שבו הם מתמודדים עם חיידקי nonpathogenicשל צמחיית תושב, אלא גם עם פתוגנים כגון spp Haemophilus. או Staphylococcus aureus והשורה הראשונה של מערכת ההגנה החיסונית של האדם. שיעורי מרכבה הם הגבוהים ביותר בילדים צעירים (37%) ואף גבוהים יותר במעונות יום צפופות (58%) 3-5. האוכלוסייה הצעירה והקשישים, שקיבל את pneumococcus באמצעות שידור תרסיס מנישאים ופרשות האף והלוע 6, שייכות לקבוצות סיכון הגבוה וחיסון באמצעות אחת מהחיסונים המצומד pneumococcal (PCV10 או PCV13 בילדים וPPSV23 פוליסכריד 23 הערכי במבוגרים) מומלץ בארצות הברית (ארה"ב) ומדינות רבות באירופה 4. PPSV23 מכסה קפסיד אחראים ל~ 90% מהמחלות bacteremic pneumococcal בארה"ב ובאירופה, מניעת מחלות ובכך יעילות פולשנית pneumococcal (IPD) במבוגרים, בעוד PCVs לכסות קפסיד הנפוץ ביותר בילדים. כתוצאה מכך, IPD בשל סוגי חיסון (VT) הוא Reduקפסיד CED אבל nonvaccine מוצגות פוטנציאל אלימות גבוה ועמידות לאנטיביוטיקה צמחו 4,7-12. לוע האף כמאגר הוא הנקודה מוצא לpneumococci להתפשט להסינוסים או אוזני אמצע ייזום זיהומים מקומיים מזיקים. יותר חשוב, pneumococci להפיץ ישירות דרך דרכי הנשימה אל הסימפונות וריאות וכתוצאה מכך CAP סכנת החיים 4,13. דלקות ריאה הם מלווים לעתים קרובות ברקמות והרס מכשול, וכך לאפשר את הפתוגן להתפשט לדם וגורם לIPD. מקרים של CAP וIPD הם הגבוהים ביותר באנשים מדוכאי חיסון או על הקצוות של גיל 4,13. הנסיבות אחראי להמרה מcommensal לפתוגן עם ארסיות גבוהה הן עדיין תחת דיון. עם זאת, מלבד שינויים ברגישות המארח והסתגלות אבולוציונית מלווה באלימות גבוהה יותר והעלייה בהתנגדויות אנטיביוטיקה הוצעו להיות השפעה מכרעת על PNEזיהומי umococcal 14-16.
הפתוגן הוא ניחן בריבוי adhesins תיווך מגע אינטימי לריריים תאי האפיתל. לאחר ההתגברות על הליחה בדרכי הנשימה, דלקת ריאות היצמדות לתאי מארח היא הקלה על דרך אינטראקציות ישירות של adhesins משטח חשוף עם קולטנים תאיים ועל ידי ניצול רכיבי מטריצה תאיים או חלבונים בסרום כגישור מולקולות 4,17,18. פתוגנים כתכליתיים pneumococci מצוידים גם עם גורמים מעורבים בהתחמקות ממנגנוני הגנת מארחת חיסונית. יתר על כן, יש להם את היכולת להסתגל לחוגי מארח שונים, כגון ריאות, דם ונוזל השדרה (CSF), בהתאמה 5,17,19,20.
ההשפעה של גורמי חיידקים על תגובות פתוגנזה ומארח דלקתי הוא נחקר במודלים של בעלי חיים ניסיוני של דלקת ריאות, בקטרמיה, או דלקת קרום המוח 21-25. למרות היותו הפתוגן אנושי, המודלים האלה הם אנחנומבוסס ll לפענח כמיהות pneumococcal רקמות, מנגנוני אלימות, או protectivity של מועמדי חיסון נגד דלקת ריאות. הרקע הגנטי של זנים טהורים עכבר קובע את הרגישות לpneumococci. עכברי BALB / ג intranasally נגוע בpneumococci נמצאו להיות עמיד, ואילו עכברי CBA / Ca וSJL היו רגישים יותר נגד זיהומי pneumococcal 22. משמעות הדבר הוא כי, בדומה לבני אדם, הרקע הגנטי ומנגנוני הגנת המארח לקבוע את התוצאה של הזיהום. לפיכך, מאמצים נוספים נדרשים כדי לפענח לוקוסי התנגדות בגנום של עכברים פחות רגישים לזיהומים pneumococcal. הממצאים הובילו לשינויים בin vivo פרוטוקולי ארסיות. במקום עכברי BALB / ג טהורים משמשים לעתים קרובות בעבר, זני העכבר רגישים מאוד CD-1/MF1 outbred כיום הם משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעה של ארסיות אובדן-of-פונקצית ריאות או כושר גורמי 26-28. יתר על כן, על הזמינותשל pneumococci bioluminescent וטכניקות הדמיה אופטיות מאפשרת bioimaging פליטת אור בזמן אמת של זיהומים. בpneumococci הקלטת מותאמת luxABCDE הגן (פלסמיד Paul-r luxABCDE ק"מ Tn 4001) הוכנסה לאתר אינטגרציה יחיד של כרומוזום ידי mutagenesis transposon. pneumococci bioluminescent להיות מועסק על מנת להעריך את הנחתה של מוטציות pneumococcal החסרות בגורמים ארסי או כושר וטרנסלוקציה שלהם מאתר אחד אנטומיים ל26,28-31 אחר.
כאן אנו מספקים פרוטוקול לbioimaging של דלקות ריאות בדלקת ריאות עכבריות או מודל אלח דם. הגברה והפצה של pneumococci bioluminescent בעכברי intranasally או intraperitoneally נגועים בקלות יכולות להיות במעקב לאורך זמן באמצעות מערכת הדמיה אופטית והחיה אותו בנקודות זמן שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי החיים הזיהום המתוארים כאן יש לבצע בהתאם קפדן עם (למשל חוק הבריאות האירופית של הפדרציה של מדעי מעבדה עמותות בעלי חיים (FELASA)) המקומי ובינלאומי הנחיות ותקנות לשימושם של בעלי חיים בעלי חוליות. הניסויים צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית והוועדה טיפול בבעלי חיים מוסדית. כל הניסויים עם ס ' דלקת ריאות במעבדה או בזיהומים בבעלי החיים מתבצעות בClass II בטיחות ביולוגית קבינט.
1. הכנת מלאי זיהומיות של Bioluminescent Pneumocococi
- הכן תרבויות pneumococcal המניה במרק טוד יואיט בתוספת 1% (w / v) תמצית שמרים וריכוז סופי של גליצרול 20% לתחזוקה ב80 ° C.
- צלחת כמות קטנה של תרבות pneumococcal המניה בהקפאה עמוקה על צלחת אגר דם ודגירת החיידקים ל10 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2. Tהוא צלחת אגר הדם מכילה אנטיביוטיקה המתאימה כגון kanamycin (150 מיקרוגרם / מיליליטר) להחדרת transposon של קלטת גן luxABCDE לתוך הגנום.
- תת לטפח מושבה טרי על צלחת אגר דם חדש לתקופה מקסימלית של 10 שעה.
- לחסן הבינוני THY תוספת 10% (v / v) חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) בסרום שור העובר (FBS) עם pneumococci ולהתחיל התרבות בOD 600 של 0.05-.07.
- דגירה pneumococci ללא תסיסה ב37 ° C ו 5% CO 2 עד התרבות מגיעה OD של 600 .35-.40. צמיחה תיקח בין 3-4 HR.
- pneumococci קציר על ידי צנטריפוגה ב3,750 XG עבור 10 דקות ו resuspend pneumococci bioluminescent בpH שנאגרו מלוח פוספט 7.4 (PBS) בתוספת FBS 0.5%.
- התאם את הבידוד לריכוז הרצוי בFBS PBS/10%. מינון הזיהום תלוי בזן pneumococcal משמש והרקע הגנטי של המיקרופוןדואר. כדי להדביק עכברי CD-1 outbred intranasally עם ס ' pneumoniae D39 LUX מינון הזיהום צריך להיות מותאם ל1 x 10 7 CFU בהשעיה של 20 μl בתוספת hyaluronidase 90 יחידות. אין לנער או pneumococci מערבולת, שכן זה יפעיל autolysis.
- בדוק את ריכוז הבידוד על ידי ציפוי 10 דילולים סדרתי של פי על אגר דם וספירה של המושבות לאחר צמיחת הלילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2.
- בדוק את פליטת אור של הבידוד pneumococcal על ידי מדידת פליטת אור באמצעות מערכת הדמיה אופטית.
2. Intranasal וזיהום Intraperitoneal של עכברים עם Bioluminescent Pneumococci
- השתמש בעכברי outbred נשיים בגיל 7-10 שבועות לדלקת ריאות חריפות ומודל אלח דם. משקלם של עכברים אלה צריך להיות בין 20-30 גרם.
- הרדימי עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine. הכן מ"ג 1.0 תערובתxylazine קטמין ו0.1 מ"ג ב100 0.9% μl סטרילי (w / v) נתרן כלורי לעכברים עם משקל גוף של 20 גרם. זה עולה בקנה אחד עם מנה של 50 מ"ג / קילוגרם משקל גוף לקטמין ו5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף לxylazine. כדי להיות מדויק, שוקלים עכברים לפני ההזרקה של חומרי ההרדמה.
- הזרק את התערובת לתוך חלל intraperitoneal ולמקם את בעלי החיים בחזרה לכלוב עד שחומרי ההרדמה לפעול ובעלי החיים הם השפעה הנרקוטית. נשימה של עכברים תהיה מאוד איטית וקבועה. עכברים צריכים להיות השפעה הנרקוטית באופן מלא, כך שהחיסון אפי ושהאיפה של ההשעיה החיידקים לא יגרמו להתעטשות ולכן, אובדן של הבידוד. זה יכול להיות מוערך על ידי צובט את העכבר בסוף הזנב שלהם; עכבר השפעה הנרקוטית באופן מלא יהיה חוסר היענות.
- בעדינות להרים את עכבר השפעה הנרקוטית והחזק את העכבר בין האצבעות והאגודל עם האף זקוף (איור 1).
- השתמש פיפטה עם טיפים צרים וארוכים (ג'ל Loaderטיפים) ושחרר pneumococci bioluminescent בטיפין קטנות מרובות על nares (10 μl / נחיר) של העכבר 26-29. העכבר שלא מרצון יהיה לשאוף את החיידקים. החזק את דקות 1-2 העכבר זקוף ולראות אם העכבר מתעטש או שומר על הבידוד.
- להדביק עכברי CD-1 7-10 בן השבוע intranasally עם מינון זיהום של 1 x 10 x 7 או 7.5 10 7 pneumococci של D39 המתח וTIGR4, בהתאמה, כדי לפקח על הזיהום בזמן אמת. גבול הגילוי של המערכת ללא כל ספיג של רקמת המארח הוא כ 1 x 10 6 חיידקים bioluminescent.
- להדביק עכברי intraperitoneally (IP) כדי להעריך וארסיות bioimage של pneumococci במודל עכבר זיהום אלח דם. השתמש 5 x 10 3 CFU בD39 של מתח 100 μl ו1 x 10 4 של מתח TIGR4. עכברים אינם מורדמים בעת שימוש במסלול ה-IP.
- לחסן עכברי שליטה עם PBS.
איור 1. זיהום Intranasal של עכברי CD-1 עם ס ' דלקת ריאות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
3. חזותי דלקת ריאות הפצה לריאות והדם באמצעות מערכת ההדמיה
הפצת דימוי של pneumococci לאחר הדבקה אפי של נקבות עכברי outbred CD1 בזמן אמת באמצעות מערכת הדמיה vivo ב.
- הפעל את מערכת ההדמיה ולהפעיל את תוכנת ניתוח תמונה נמצאת על מחשב preconfigurated.
- מערכת ההדמיה מאתחלת באופן אוטומטי ומצלמת CCD מקוררת thermoelectrically 90 מעלות צלזיוס לפני להיות פעיל.
- ההגדרות וbinning תלויות במספר העכברים נמדדבו זמנית, ועל כוחו של אות bioluminescent. שדה הראייה (FOV) כדי לפקח על פליטת אור של בעלי החיים משתנה ונעה בין הגדלת שדה ראייה של 22.5 סנטימטר למדוד חמישה עכברים, ושדה ראייה של 3.9 סנטימטר למדוד עכבר או חלקים בודדים של בעלי החיים כמו החזה או בראש.
- משתמש באופן שגרתי זמן חשיפה של 1 דקות, במידת מדיום של binning, ושדה ראייה של 22.5 סנטימטר (ד 'סט). ראשית, בחר את מצב ההדמיה זורח ולאחר מכן להגדיר את הפרמטרים ההדמיה.
- הפליטה של האות עשויה להיות תלויה בזן החיידקים וזן עכבר בשימוש, והפיגמנט של העכבר. לגלח את החזה של עכברים בעת שימוש לדוגמא: עכברי C57BL / 6, אשר יכולה להיות יתרון כאשר ההדמיה התפתחות דלקת הריאות בעכברים אלו.
- תמונת עכברים נגועה במרווחי זמן prechosen. למדוד את פליטת אור של עכברים במודל דלקת הריאות החריף במרווחים של שעות 8-12 מקסימום זמן. לפקח גם את רווחתם של עכברים נגועים בobserving המראה שלהם, התנהגות, ונחישות של הירידה במשקל.
- הרדימי עכברים בתא נרקוטיים של מערכת ההרדמה של ציוד ההדמיה לפני המדידות בחדר. התחל משאיפת תערובת של isoflurane וחמצן ולחכות עד שהעכברים לנשום לאט ובאופן קבוע.
- הנח חיות מורדמים לחדר ההדמיה של המערכת ולשמור על עכברים במצב שכיבה. מצלמת CCD בחלק העליון של החדר תהיה לאחר מכן תמונה בדרכי נשימה העכברית.
- הנח את החיות עם האף שלהם לתוך צינורות כדי לאפשר שאיפה של חומרי ההרדמה.
- כניסת Isoflurane לחדר ההדמיה באמצעות צינורות גז מותר לשמור על הרדמה.
- כדי להפעיל את מצלמת CCD בחלק העליון של החדר ולהתחיל הדמיה אופטית bioluminescent, "לרכוש" עיתונות בתוכנת ההדמיה. מייד תצלום של העכברים בחדר הסגור מופיע על המסך. לאחר דקה אחת של מדידת כיסוי של נתוני פליטת אור והתמונה מוצגת.
- תפסיק הרדמה לאחר שכבת התמונה מופיעה בחלון של התוכנה ולשים את העכברים בחזרה לכלובים שלהם.
- עכברים מנוטרים להתאוששות.
איור 2. הרדמה וניטור של עכברים נגועים בpneumococci bioluminescent באמצעות מערכת IVIS ספקטרום ההרדמה וIVIS, בהתאמה.) מערכת IVIS ספקטרום ההדמיה. ב ') מערכת ההרדמה IVIS עם תא הדגירה. C) עכברים מורדמים בתא הדגירה עכברים. ד ') הממוקמים בתוך תא IVIS ספקטרום ההדמיה עם האף שלהם שאף את חומר ההרדמה._blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
4. כימות והערכה של פליטת אור של עכברים נגועים Bioluminescent ס pneumoniae
- לקבוע את עוצמות פליטת אור של העכברים או מאזור הנבחר של העכברים על ידי הכימותים סך כל פליטת הפוטון (פוטונים / sec) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
- השתמש בערכים של פליטת הפוטונים המסופקים בגיליון נתוני Excel להכין גרף. מאז הווריאציה נתונים היא לעתים קרובות גבוהה בעכברי מקובצים, ליצור גרף זיף תיבה כדי להציג את ההבדלים בעכברים נגועים בזני pneumococcal השונים.
- לספק את הפוטונים לעכברים או לחלופין תוצאות כממוצע של זוהר (2 / SR פוטונים / sec / סנטימטר) של אזור שנבחר.
- נתוני מדידה של החזר על השקעה (אזור של ריבית) במצב פוטון ניתן להשוות כמותית על פני שונה במערכות הדמיה vivo עם שונה באוהגדרות ra, מאז המדידות ביחידות של זוהר לוקחות בחשבון באופן אוטומטי את הגדרות מצלמה (למשל זמן אינטגרציה, binning, f / לעצור, ושדה הראייה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרכישה והספיגה של מתיונין היא בעלת חשיבות המרכזית לpneumococci כדי לשמור על כושר בנישה של המארח שלהם 32,33. ליפופרוטאין טרנספורטר מתיונין ABC מקודד בD39 ידי SPD _ גן 0151 (TIGR4: sp_0149) ושם MetQ 32. Pneumococci לייצר עוד אנזימי ביוסינתזה מתיונין (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, תחרוץ וMetF). חוסר מתיונין במדיום הגדרה כימית משפיע על צמיחה של pneumococci ודומה, חוסר ספיגת מתיונין מחייבת MetQ ליפופרוטאין לקוי של מתיונין 32,33. פגם זה יכול להיות משוחזר על ידי התוספת של ריכוזים גבוהים של מתיונין. בניסויים קולוניזציה עכבר המוטציה חסרת MetQ לא נחלשו בארסיות כפי שמוצג בניסויי coinfection עם wild-type isogenic, ואילו חוסר MetQ נחלש pneumococci במודלים של עכברים של אלח דם ודלקת ריאות, כפי שמוצג על ידיקביעת עומס חיידקי 32. bioimaging האופטית בזמן אמת תוך שימוש בספקטרום IVIS משמש כאן מאפשרת ניטור הכפל וההפצה של חיידקים בחיים נגועים אחת בנקודות זמן שונות.
בדוגמא המוצגת כאן, יש לנו להעריך את ההשפעה של מתיונין מחייב MetQ ליפופרוטאין בקולוניזציה וארסיות על ידי יישום מודל עכבר זיהום בדלקת ריאות החריף. CD-1 עכברי outbred (n = 10) נדבקו intranasally עם 1 x 10 7 חיידקים מזן פראי סוג S. סוויטה דה לוקס pneumoniae D39 (PN149) או סוויטה דה לוקס המוטציה isogenic D39 Δ metQ (טבלת 1). המוטציה metQ (PN252) נבנתה על ידי mutagenesis החדרת המחיקה של גן metQ בpneumococci D39 bioluminescent. לכן, גן metQ, רצף 5 'ו3'sequence היו מוגבר על ידי PCR באמצעות primers 382 ו385. מוצר ה-PCR שובט לתוך הווקטור PGEMT-קל, אשר הביא p559 פלסמיד (טבלת 1). על ידי PCR ההפוך באמצעות פריימרים 383 ו384 (טבלה 2) רצף metQ (NT 58 לNT 777) נמחק והוחלף על ידי קלטת גן התנגדות אריתרומיצין (ermB) מוגברת על ידי ה-PCR באמצעות פלסמיד pE89 (טבלת 1), כמו ה-DNA תבנית ו ermB_105/ermB_106 פריימר הזוג (טבלת 2). פלסמיד וכתוצאה p563 34 הפכו לpneumococci כפי שתוארו באמצעות מגרה יכולת פפטיד-1 בעבר. מוטנטים חסרים MetQ ליפופרוטאין (Spd_0151) עובדו ברצונך, או על צלחות אגר דם בתוספת אריתרומיצין (5 מיקרוגרם / מיליליטר).
מצב הבריאות של העכברים היה פיקוח ברציפות. בעלי חיים הוקרבו כאשר מראים שום תגובה או סימנים לתחלואה ראויות. יתר על כן, הפצת pneumococcal מלוע האף לריאות והדם, מה שמוביל לדלקת ריאות ואלח דם חמורים, הייתה monitoאדום על ידי מדידת פליטת אור כל שמונה שעות. בכל קבוצה של עכברים נגועים 7 מתוך 10 עכברים פיתחו סימנים חמורים של מחלה, תוך 3 עכברים האחרים לא הראו שום פליטת אור ושרדו (איור 3 א). עכברים נגועים בהצלחה עם סוויטה דה לוקס D39 פראי מסוג bioluminescent פיתחו 32 שעות זיהומים לאחר הזיהום חמורים ריאות, אשר מתפתח בתוך 8-16 שעה ל( איור 3 א) אלח דם. בנקודת זמן 96 שעה כל העכברים נכנעו שפתחו דלקת ריאות ואלח דם לאחר זיהום עם סוויטה דה לוקס D39. הפסד של פונקציה של ליפופרוטאין מחייב מתיונין לקוי באופן משמעותי את הארסיות של pneumococci. אחרי 32 שעה אחת בלבד עכבר נדבק במוטצית metQ הראה דלקת ריאות חלשה, ואילו אחרים לא הראו סימנים ברורים של מחלה ודלקת ריאות. עם זאת, לאחר 48 שעות דלקות ריאות חמורות הפכו ניכרו גם בעכברים נגועים במוטציה. כתוצאה מכך, עכברים אלה פיתחו אלח דם 72 שעותלאחר זיהום והפך גוססים יאוחר מ 72 לאחר זיהום שעה, הוכחת כי במודל זיהום דלקת ריאות החריף החסר של MetQ פוחתת pneumococci.
טבלת 1. הזנים ורשימת פלסמיד.
טבלה 2. רשימת פריימר. אתרי הגבלה הם קו תחתי.
| שימוש מיועד פריימר | שם פריימר | רצף (5'-3 ") |
| mutagenesis החדרת המחיקה | ||
| הגברה של sp_0149 + 5 'ו 3 'איגוף האזור | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 " 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 " |
| PCR ההופכי של sp_0149 + 5 'ו אזור איגוף 3 '(pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 " 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 " |
| הגברה קלטת אנטיביוטיקה | ||
| אריתרומיצין (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 " 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 " |
איור 3. ניטור של הפצת ריאות בעכברים לאחר הדבקה אפי. א) הדמיה אופטית Bioluminescent של עכברים הנגועים intranasally עם סוויטה דה לוקס D39 או luxΔmetQ D39 המוטציה isogenic. B) הערכים של עוצמות פליטת אור של עכברי מקובצים (n = 10) מוצגיםלנקודות זמן שצוינו בגרף זיף תיבה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כל הניסויים שנערכו בבעלי חיים צריכים להיות מאושרים על ידי הרשויות המקומיות וועדות אתיקה. בניסויי in vivo זיהום עומס החיידקים בנישות המארח השונות של בעלי חיים נגועים צריך להיקבע בנקודות זמן שונות לאחר פגיעה. תחת תנאי ניסויים אלה בעלי החיים צריכים להיות מוקרבים לפני הבידוד של החיידקים מהדם, לוע האף, שטיפת bronchoalvelar, או באיברים כגון ריאות, הטחול, והמוח. כדי לחשב את מספר החיידקים לנישת מארח ולהעריך את השפעתם של גורמי חיידקים על הארסיות, הדם או איברים צריכים להיות מבודד ואחריו חיידקים מתאושש וציפוי על תקשורת מוצקה. עומס החיידקים הוא לכמת לאחר מכן על ידי ספירה של CFU. כדי להגיע לנתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בכל נקודת זמן צריכה קבוצה של עכברים, שתחת תנאי ניסוי מסוימים מובילה לקשיים בטיפול בניסוי בשל המספר הגבוה של עכברים.
ove_content "> לעומת זאת, שיטת bioimaging בזמן אמת היא גישה תובענית פחות זמן וכל עכבר חיידקים נגוע אדם יכול להיות במעקב מספר פעמים על פני תקופה של זמן. טכניקת ההדמיה מאפשרת הדמיה של החיידקים בתוך החיה בשונה זמן מציין שלאחר זיהום או אפילו לתקופת זמן ממושכת. יתר על כן, פליטת אור נמדד עם תוכנת ניתוח תמונה האופטית נוספת מאפשרת כימות של פוטונים הנפלטים על ידי החיה נגועה. זה יכול להיות מוגבל לאזור מוגדר של העכבר או כל בעלי חיים יכולים להיחשב. בin vivo העכברים הנגוע בpneumococci ניסויי הזיהום צריך להיות במעקב במרווחים של 8-12 לשעה, שכן התפשטות pneumococci יכולה להתקדם במהירות בעכברי CD-1 outbred. ההדמיה בזמן אמת יכולה להיות מועסקת על מנת לדמיין גלגול pneumococci מלוע האף לריאות ודם, ובנוסף, ההכפלה של pneumococci בדםלאחר הדבקת intraperitoneal יכולה להיות פיקוח על ידי העלייה הדרמטית בעוצמת פליטת אור 26,28,29.כאשר משווים את פוטנציאל האלימות של pneumococci wild-type ו מוטנטים isogenic זה חיוני כדי לבחון תחילה את ההשפעה של גן הפסד של תחת במבחנה תנאי תרבות. הבדלי צמיחה בין חיידקי wild-type ו מוטציות, בפרט במדיום הגדרה כימית, כבר מצביעים על כושר חיידקי ירד 26. לפיכך, הנחתה נצפתה תחת in vivo תנאים קשור לפיזיולוגיה שינתה מוביל לpneumococci חזק פחות במהלך זיהומי קולוניזציה ופולשני.
עם זאת, יש בו כדי לציין כי טכניקת הדמיה זו היא לעתים קרובות לא מספיק כדי להדגים את ההשפעה של knockouts הגן בארסיות ריאות. בדומה לpneumococci חיידקים פתוגניים האחר הם מיקרואורגניזמים תכליתיים והתפתח מנגנונים רב פנים לאo נתקל המארח ולהתחמק ממערכת החיסון. כתוצאה מכך, pneumococci לייצר בחלבוני יד אחת עם פונקציות מגוונות כגון PspC adhesin ו, ומצד שני, הם ניחן בכמה חלבונים מציגים פונקציות דומות שלכן יכולים לפצות את הפגם של חלבון עקב מוטציות 4,17,18 , 35. בתרחישים אלה בניסויי vivo זיהום אחרים, כגון גישת coinfection צריך להיות מועסקים על מנת לפענח את ההשפעה של פונקצית הפסד של חלבון במוטציה להתיישבות או זיהומים פולשניים 27,28.
Pneumococci ליישב ולהדביק מעדיפים בני אדם, אלא גם היו מבודד מחיות מחמד או חיות בגן חיות 4,36,37. כדי לפענח את ההשפעה של אלימות או מודלים זיהום עכבר גורמי כושר משמשים. עם זאת, לא כל זני pneumococcal הם ארסיים עכבר, וחשוב יותר, את הרגישות של עכברים תלויים ברקע הגנטי של בעלי החיים 22. דלקת ריאות מחקרי ארסיות ומחקרי הגנה מתנהלים כיום עם CD-1 עכברי outbred. עם זאת, מפסיד יוצא, עכברים או עכברים הטרנסגניים גם הם בריבית גבוהה כדי לפענח את תפקידם של גורמי מארח למחלות pneumococcal פולשני. נוקאאוט או העכברים הטרנסגניים לעתים קרובות נוצרו בזני עכבר כגון C57/BL6 או BALB / ג. זני עכבר אלה הם פחות רגישים נגד זיהומי pneumococcal ומינונים גבוהים זיהום נדרשים לקבל מנה קטלנית, 50% (LD 50). בהתאם למינון זיהום התנגדות זו של עכברים עלולה לפגוע bioimaging זמן אמת של הפצת pneumococcal לריאות או הדם, שכן pneumococci מוגבל להתרבות באופן דרוש לזיהוי על ידי מערכת ההדמיה. כדי להתגבר על מגבלה זו ולהיות מסוגל דימוי ההפצה בזמן אמת, מינוני זיהום גבוהים צריכים להיות מנוצלים. הסיכון של גישה זו יכול להיות שהבדלים ברגישות המארח לא יכולים להיחקר כהפצה מתקדמת מהר מדי.
s = "jove_content"> לסיכום, השימוש במערכת ההדמיה מייצג גישה מצוינת כדי לפקח, להשוות ולאפיין זיהומי pneumococcal בעכברים הנגועים דרך אינטרה או מסלול intraperitoneal. גישה זו היא בעיקר מתאימה כדי להשוות את פוטנציאל האלימות בין wild-type ו מוטציות של ס ' דלקת ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר במעבדה נתמכה על ידי מענקים מ( DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) והמשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF) Genomics זיהום רפואי (FKZ 0315828A) לSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G.
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J.
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E.
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
