التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Summary

العقدية الرئوية هي الرائدة الممرض تسبب الالتهاب الرئوي الحاد المكتسبة من المجتمع ومسؤولة عن أكثر من 2 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. تأثير العوامل البكتيرية المتورطين في اللياقة البدنية أو الفوعة يمكن رصدها في الوقت الحقيقي في الماوس الالتهاب الرئوي الحاد أو تجرثم نموذج باستخدام البكتيريا للإضاءة الحيوية.

Abstract

الالتهاب الرئوي هو واحد من مشاكل الرعاية الصحية الرئيسية في البلدان النامية والبلدان الصناعية ويترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات كبيرة. على الرغم من التقدم في المعرفة من هذا المرض، وتوافر وحدات العناية المركزة (ICU)، واستخدام العوامل المضادة للجراثيم قوية واللقاحات فعالة، لا تزال معدلات وفيات عالية ^1. العقدية الرئوية هو الممرض الرئيسي للالتهاب الرئوي المكتسبة من المجتمع (CAP) واحد من الأسباب الأكثر شيوعا لتجرثم الدم لدى البشر. وقد تم تجهيز هذا الممرض مع عتاد من adhesins المعرضة للسطح وعوامل الفوعة تساهم في الالتهاب الرئوي والأمراض الرئوية الغازية (IPD). تقييم دور في الجسم الحي من اللياقة البدنية أو الفوعة العوامل البكتيرية أمر في غاية الأهمية لكشف S. الآليات الإمراضية الرئوية. وتستخدم نماذج الفئران من الالتهاب الرئوي، وتجرثم الدم، والتهاب السحايا لتحديد تأثير العوامل المتنوعة في المكورات الرئويةخمتلفة مراحل العدوى. نحن هنا وصف بروتوكول لرصد في الوقت الحقيقي نشر المكورات الرئوية في الفئران بعد الأنف أو التهابات داخل الصفاق مع البكتيريا للإضاءة الحيوية. أظهرت النتائج تكاثر ونشر المكورات الرئوية في الجهاز التنفسي السفلي والدم، الأمر الذي يمكن تصور وتقييمها باستخدام نظام التصوير وبرامج التحليل المرفقة.

Introduction

التهابات الجهاز التنفسي التي تسببها الفيروسات أو البكتيريا لا تزال واحدة من المشاكل المكتسبة من المجتمع أو السريرية الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم مما تسبب في ما يقرب من ثلث جميع وفاة في العالم. الأنواع البكتيرية الرئيسية هي المستدمية النزلية والعقدية الرئوية ^2. ومع ذلك، هذه الأنواع البكتيرية عادة ما تكون المكونات المشتركة من النباتات الطبيعية الجهاز التنفسي. وبالتالي نقل البكتيرية هي أيضا من بعض المخاطر لمرض الغازية واعتمادا على الحالة المناعية أو الاستعداد للأفراد. يتم تشغيل الاستعمار أعراض للعدوى الغازية. العقدية الرئوية هو الممرض الرئيسي للالتهاب الرئوي المكتسبة من المجتمع (CAP) واحدة من أكثر الأسباب شيوعا للتجرثم الدم لدى البشر. في الأفراد الأصحاء S. الرئوية (المكورات الرئوية) وغالبا ما تكون أعراض المستعمرين وغير ضارة من الجهاز التنفسي العلوي، حيث تصدى لهم مع بكتيريا غير إمراضيةمن الفلورا ولكن أيضا مع مسببات الأمراض مثل المستدمية النيابة. أو المكورات العنقودية الذهبية والسطر الأول من نظام الدفاع المناعي للإنسان. معدلات نقل أعلى في الأطفال الصغار (37٪) وأعلى حتى داخل مراكز الرعاية النهارية مزدحمة (58٪) ^3-5. أصغر السكان وكبار السن، وحصل على المكورة الرئوية عن طريق نقل الهباء الجوي من الناقلين وإفرازات البلعوم ^6، تنتمي إلى الفئات المعرضة لمخاطر عالية والتطعيم باستخدام أحد قاحات المكورات الرئوية (PCV10 أو قاح PCV13 في الأطفال و 23 التكافؤ السكاريد PPSV23 في البالغين) ويوصى في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) والعديد من البلدان الأوروبية ^4. يغطي PPSV23 الأنماط المصلية المسؤولة عن ~ 90٪ من أمراض المكورات الرئوية bacteremic في الولايات المتحدة وأوروبا، والوقاية من الأمراض الرئوية الغازية بالتالي بكفاءة (IPD) في البالغين، في حين تغطي PCVs الأنماط المصلية الأكثر انتشارا في الأطفال. بالتالي، IPD بسبب أنواع اللقاح (VT) هي reduظهرت الأنماط المصلية دائرة الهندسة المدنية ولكن nonvaccine عرض إمكانات الفوعة العالية والمقاومة للمضادات الحيوية ^4،7-12. البلعوم الأنفي كما الخزان هو نقطة الانطلاق لالمكورات الرئوية ينتشر في الجيوب الأنفية أو التهابات الأذن الوسطى الشروع المحلية الضارة. الأهم من ذلك، تنتشر مباشرة عبر مجرى الهواء إلى شعب هوائية والرئة مما يؤدي إلى مهددة للحياة CAP ^4،13 المكورات الرئوية. وغالبا ما يصحب التهابات الرئة مع الأنسجة وتدمير الحاجز، وبالتالي تمكين الممرض أن تنتشر في الدم وتسبب IPD. حوادث CAP وIPD هي أعلى في الأشخاص المناعة أو في النقيضين من العمر ^4،13. الظروف المسؤولة عن التحويل من المتعايشة على الممرض مع الفوعة العالية لا تزال قيد النقاش. ولكن، إلى جانب التغيرات في قابلية المضيف والتكيف التطوري ترافق مع ارتفاع الفوعة وزيادة في المقاومة للمضادات الحيوية وقد اقترحت أن يكون لها تأثير حاسم على PNEالتهابات umococcal ^14-16.

وهبت الممرض مع تعدد adhesins التوسط اتصال حميم إلى الخلايا الظهارية المخاطية. بعد التغلب على مخاط مجرى الهواء، مما يسهل الالتزام المكورات الرئوية إلى الخلايا المضيفة عبر التفاعل المباشر من adhesins المعرضة للسطح مع المستقبلات الخلوية وذلك من خلال استغلال مكونات المصفوفة خارج الخلية أو البروتينات في الدم كما سد جزيئات ^4،17،18. كما تم تجهيز مسببات الأمراض الرئوية تنوعا أيضا مع العوامل التي تدخل في التهرب من المضيف المناعي آليات الدفاع. وعلاوة على ذلك، لديهم القدرة على التكيف مع مختلف الأوساط المضيفة مثل الرئة، والدم، والسائل النخاعي (CSF)، على التوالي ^{5،17،19،20.}

يتم التحقيق في تأثير العوامل البكتيرية والمرضية على المضيف التهابات الردود في النماذج الحيوانية التجريبية من الالتهاب الرئوي، وتجرثم الدم، أو التهاب السحايا ^21-25. على الرغم من كونه الممرض الإنسان، وهذه النماذج نحنليرة لبنانية تأسيس فك tropism المكورات الرئوية الأنسجة، آليات الفوعة، أو protectivity المرشحين لقاح المكورات الرئوية. الخلفية الوراثية للسلالات الفطرية الماوس يحدد القابلية للالمكورات الرئوية. تم العثور على BALB / ج الفئران المصابة الأنف مع المكورات الرئوية لتكون مقاومة، في حين كانت CBA / الكالسيوم وSJL الفئران أكثر عرضة ضد الالتهابات الرئوية ^22. هذا يعني أنه، على غرار البشر، والخلفية الوراثية وآليات الدفاع المضيف تحديد نتيجة العدوى. وبالتالي، من الضروري لكشف مواضع المقاومة في جينوم الفئران أقل عرضة للعدوى المكورات الرئوية بذل المزيد من الجهود. وقد أدت النتائج إلى تغييرات في الجسم الحي في بروتوكولات الفوعة. بدلا من الفئران الفطرية BALB / ج غالبا ما تستخدم في الماضي، وغالبا ما تستخدم في الوقت الحاضر CD-1/MF1 سلالات الفئران الأباعد عرضة لدراسة تأثير الخسارة من وظيفة الفوعة المكورات الرئوية أو الملاءمة عوامل ^26-28. علاوة على ذلك، توفرمن المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية وتقنيات التصوير الضوئي يسمح في الوقت الحقيقي تلألؤ بيولوجي bioimaging من الالتهابات. في المكورات الرئوية تم إدراج الأمثل luxABCDE كاسيت الجين (البلازميد بول-A تينيسي 4001 كم luxABCDE ^ص) في موقع التكامل واحد من كروموسوم من قبل ينقول الطفرات. وقد استخدمت المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية لتقييم التوهين من المسوخ المكورات الرئوية نقص في الفوعة أو الملاءمة العوامل وإزفاء بهم من موقع واحد التشريحية ^ل26،28-31 آخر.

ونحن هنا نقدم بروتوكول للالتهابات الرئوية bioimaging في الفئران التهاب رئوي أو نموذج الإنتان. يمكن بسهولة رصد والتضخيم، ونشر المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية في الفئران المصابة الأنف أو الغشاء البريتونى مع مرور الوقت باستخدام نظام التصوير الضوئي ونفس الحيوان عند نقاط زمنية مختلفة.

Protocol

التجارب العدوى الحيوانية وصفها هنا يجب أن يؤديها بما يتفق بدقة مع (مثل قانون الصحة الأوروبية لاتحاد الجمعيات مختبر الحيوان العلوم (FELASA)) المحلية والدولية والمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية. التجارب يجب أن يكون وافق عليها المجلس المحلي الأخلاقية والمؤسسية جنة رعاية الحيوان. جميع التجارب مع S. وتجرى الرئوية في المختبر أو الإصابات الحيوانية في الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

1. إعداد المخزون المعدية من إضاءة الحيوية Pneumocococi

1. إعداد الثقافات الأسهم المكورات الرئوية في تود هيويت مرق تستكمل مع 1٪ (ث / ت) خلاصة الخميرة وتركيز النهائي من 20٪ الجلسرين للصيانة في 80 درجة مئوية.
2. لوحة كمية صغيرة من ثقافة الأسهم المكورات الرئوية مجمدة على لوحة أجار الدم واحتضان البكتيريا لمدة 10 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2. Tانه وحة آغار الدم يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مثل الكانامايسين (150 ميكروغرام / مل) لينقول الإدراج من الكاسيت الجينات في جينوم luxABCDE.
3. دون زراعة، مستعمرة جديدة على لوحة آغار الدم الجديد لمدة أقصاها 10 ساعة.
4. تطعيم THY المتوسطة تستكمل مع 10٪ (V / V) الحرارة المعطل (30 دقيقة عند 56 درجة مئوية) مصل بقري جنيني (FBS) مع المكورات الرئوية وبدء الثقافة في لOD ₆₀₀ من 0.05-0.07.
5. احتضان المكورات الرئوية دون الانفعالات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ حتى يصل إلى ثقافة OD ₆₀₀ من 0،35-0،40. سوف يستغرق ما بين 3-4 النمو ساعة.
6. الحصاد المكورات الرئوية بواسطة الطرد المركزي في 3،750 x ج لمدة 10 دقيقة و resuspend المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية في الفوسفات مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة (PBS) تستكمل مع FBS 0.5٪.
7. ضبط اللقاح إلى التركيز المطلوب في PBS/10٪ FBS. جرعة العدوى يعتمد على سلالة الرئوية المستخدمة والخلفية الوراثية من هيئة التصنيع العسكريه. لتصيب الأباعد CD-1 الفئران الأنف مع S. وكس الرئوية D39 ينبغي تعديل جرعة العدوى إلى 1 × 10 ⁷ كفو في تعليق 20 ميكرولتر تستكمل مع 90 وحدات هيالورونيداز. لا تهزه أو دوامة المكورات الرئوية، لأن هذا من شأنه أن يؤدي انحلال ذاتي.
8. تحقق من تركيز اللقاح عن طريق طلي 10 أضعاف التخفيفات المسلسل على أجار الدم وتعداد المستعمرات بعد نمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
9. التحقق من تلألؤ بيولوجي من اللقاح المكورات الرئوية عن طريق قياس تلألؤ بيولوجي باستخدام نظام التصوير الضوئي.

2. الأنف والعدوى داخل الصفاق من الفئران مع إضاءة الحيوية الرئوية

1. استخدام الفئران الإناث الأباعد في سن 7-10 أسابيع لالتهاب رئوي حاد ونموذج الإنتان. وينبغي أن يكون وزن هذه الفئران بين 20-30 غرام.
2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين وزيلازين. إعداد خليط 1.0 ملغالكيتامين و 0.1 ملغ زيلازين في 100 ميكرولتر العقيمة 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم للفئران مع وزن الجسم من 20 غراما. وهذا يتفق مع جرعة من 50 ملغ / كغ من وزن الجسم للالكيتامين و 5 ملغ / كغ من وزن الجسم لزيلازين. أن تكون دقيقة، وزن الفئران قبل حقن التخدير.
3. حقن الخليط في تجويف داخل الصفاق ووضع الحيوانات مرة أخرى إلى القفص حتى يتصرف التخدير والحيوانات مخدر. والتنفس من الفئران تصبح بطيئة جدا ومنتظمة. الفئران يجب أن تكون مخدر تماما، بحيث التلقيح داخل الأنف واستنشاق تعليق البكتيرية لا يؤدي إلى العطس وبالتالي فقدان اللقاح. هذا يمكن تقييمها من قبل معسر الماوس في نهاية الذيل، وسوف ماوس مخدر بالكامل تفتقر الاستجابة.
4. اختيار بلطف صعودا ماوس مخدر مع الاستمرار على الماوس بين الأصابع والإبهام مع الأنف تستقيم (الشكل 1).
5. استخدام ماصة مع نصائح ضيقة طويلة (جل لودرنصائح) وإسقاط المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية في قطرات صغيرة متعددة على فتحتي الأنف (10 ميكرولتر / الأنف) من الفأرة ^26-29. سوف الماوس يستنشق كرها البكتيريا. عقد الماوس 1-2 دقيقة تستقيم ومراقبة ما إذا كان الماوس العطس أو تحافظ على اللقاح.
6. تصيب 7-10 أسبوع من العمر CD-1 الفئران الأنف مع جرعة العدوى من 1 × 10 ⁷ أو 7.5 × 10 ⁷ المكورات الرئوية من سلالة D39 وTIGR4، على التوالي، لرصد العدوى في الوقت الحقيقي. حد الكشف عن النظام دون أي امتصاص الأنسجة المضيف هو ما يقرب من 1 × 10 ⁶ البكتيريا للإضاءة الحيوية.
7. تصيب الغشاء البريتونى الفئران (IP) لتقييم وbioimage الفوعة من المكورات الرئوية في نموذج عدوى تعفن الدم الماوس. استخدام 5 × 10 ³ كفو في 100 ميكرولتر من سلالة D39 و 1 × 10 ⁴ من سلالة TIGR4. لا يتم تخدير الفئران عند استخدام الطريق IP.
8. تطعيم السيطرة على الفئران مع برنامج تلفزيوني.
   الشكل 1. عدوى الأنف من CD-1 الفئران مع S. الرئوية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

3. تصور المكورات الرئوية نشر في الرئة والدم باستخدام نظام التصوير

نشر صورة المكورات الرئوية بعد العدوى داخل الأنف من الفئران الإناث CD1 الأباعد في الوقت الحقيقي باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي.

1. التبديل على نظام التصوير والبدء في برنامج تحليل الصور الموجودة على الكمبيوتر preconfigurated.
2. نظام التصوير تهيئة تلقائيا ويتم تبريد كاميرا CCD الحرارية لل90 درجة مئوية قبل ممارسة النشاط.
3. تعتمد الإعدادات وbinning على عدد من الفئران قياسفي وقت واحد وعلى قوة إشارة للإضاءة الحيوية. مجال الرؤية (فوف) لرصد تلألؤ بيولوجي من الحيوانات هو متغير ويتراوح بين التكبير فوف من 22.5 سم إلى قياس خمسة فئران، ومجال الرؤية من 3.9 سم لقياس ماوس واحدة أو أجزاء من الحيوانات مثل الصدر أو الرأس.
4. تستخدم بشكل روتيني ومدة التعرض من 1 دقيقة، وعلى درجة متوسطة من binning، ومجال الرؤية من 22.5 سم (مجموعة D). أولا، اختيار وضع التصوير الانارة ومن ثم تعيين المعلمات التصوير.
5. انبعاث إشارة قد تعتمد على السلالة البكتيرية وسلالة الماوس المستخدمة، والصباغ من الفأرة. حلق الصدر من الفئران عند استخدام مثل C57BL / 6 الفئران، والتي يمكن أن تكون مفيدة عند التصوير تطوير الالتهاب الرئوي في هذه الفئران.
6. صورة المصابة الفئران على فترات زمنية prechosen. قياس تلألؤ بيولوجي من الفئران في نموذج الالتهاب الرئوي الحاد في فترات زمنية من 8-12 ساعة كحد أقصى. رصد أيضا رفاهية الفئران المصابة بواسطة observiنانوغرام مظهرها، والسلوك، وتقرير لفقدان الوزن.
7. تخدير الفئران في غرفة المخدرة من نظام التخدير لمعدات التصوير قبل القياسات في الغرفة. بدء استنشاق خليط من الأكسجين وisoflurane ووانتظر حتى تنفس الفئران ببطء وبشكل منتظم.
8. وضع الحيوانات تخدير في غرفة التصوير من النظام والحفاظ على الفئران في موقف ضعيف. الكاميرا CCD على الجزء العلوي من الغرفة سوف ثم صورة الجهاز التنفسي الفئران.
9. وضع الحيوانات مع أنوفهم في لأنابيب للسماح استنشاق مواد التخدير.
10. يسمح دخول isoflurane والى غرفة التصوير عن طريق أنابيب الغاز للحفاظ على التخدير.
11. لتفعيل اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا على رأس الغرفة والبدء في التصوير الضوئي للإضاءة الحيوية، اضغط على "اكتساب" في برامج التصوير. على الفور صورة من الفئران في غرفة مغلقة يظهر على الشاشة. بعد دقيقة واحدة من القياس تراكب البيانات تلألؤ بيولوجي ويظهر في الصورة.
12. وقف التخدير بعد ظهور تراكب الصور في نافذة البرنامج ووضع الفئران مرة أخرى إلى أقفاصها.
13. ويتم رصد الفئران لتحقيق الانتعاش.
    
    الشكل 2. التخدير ورصد الفئران المصابة مع المكورات الرئوية للإضاءة الحيوية باستخدام التخدير IVIS ونظام IVIS الطيف، على التوالي. A) نظام IVIS الطيف التصوير. B) نظام التخدير IVIS مع غرفة الحضانة. C) الفئران تخدير في غرفة الحضانة دال) الفئران تقع داخل غرفة التصوير IVIS الطيف مع أنوفهم استنشاق مخدر._blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

4. الكمي وتقييم ضوء بارد من الفئران المصابة مع إضاءة الحيوية S. الرئوية

1. تحديد شدة تلألؤ بيولوجي من الفئران أو من المنطقة المحددة من الفئران عن طريق قياس انبعاث الفوتون الإجمالي (الفوتونات / ثانية) باستخدام برنامج تحليل الصور.
2. استخدام القيم من انبعاث الفوتون التي يتم توفيرها في ورقة بيانات Excel إلى إعداد الرسم البياني. منذ تباين البيانات غالبا ما تكون مرتفعة في الفئران مجمعة، إنشاء رسم بياني مربع الخط الطولي لعرض الاختلافات في الفئران المصابة مع سلالات المكورات الرئوية المختلفة.
3. توفير الفوتونات في الفئران أو بدلا من ذلك نتائج على أنه متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سم ² / ريال سعودي) من المساحة المحددة.
4. بيانات قياس العائد على الاستثمار (منطقة المصالح) في وضع الفوتون يمكن كميا مقارنة عبر مختلف في نظم التصوير الجسم الحي مع مختلف وجاءإعدادات را، منذ القياسات في وحدات من وهج تلقائيا تأخذ في الاعتبار إعدادات الكاميرا (مثل الوقت والتكامل، binning، و / إيقاف، ومجال الرؤية).

Representative Results

اقتناء وامتصاص الميثيونين هو من الأهمية المركزية لالمكورات الرئوية للحفاظ على اللياقة البدنية في مكانه المضيفة ^32،33. يتم ترميز ميثيونين ABC البروتين الدهني نقل في D39 من قبل الحزب الديمقراطي الاشتراكي _ 0151 الجين (TIGR4: sp_0149) واسمه MetQ ^32. المكورات الرئوية مزيد من انتاج الانزيمات ميثيونين الحيوي (D39: Spd_0510 - Spd_0511؛ TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586، ميتي وMetF). عدم وجود ميثيونين في وسط محددة كيميائيا يؤثر نمو المكورات الرئوية ومماثلة، وعدم وجود ميثيونين ملزمة البروتين الدهني MetQ ضعف الإقبال على ميثيونين ^32،33. يمكن استعادة هذا العيب عن طريق إضافة تركيزات عالية من الميثيونين. في التجارب الماوس الاستعمار لم الموهن متحولة من نقص في MetQ في الفوعة كما هو مبين في التجارب عدوى مرافقة مع إسوي من النوع البري، في حين أن عدم وجود MetQ الموهن المكورات الرئوية في نماذج الماوس من الإنتان والالتهاب الرئوي كما هو مبين من قبلتحديد الحمولة الجرثومية ^32. في الوقت الحقيقي bioimaging البصرية باستخدام الطيف IVIS المستخدمة هنا يسمح برصد الضرب ونشر البكتيريا في الحيوانات المصابة واحدة في نقاط زمنية مختلفة.

في المثال الموضح هنا، قمنا بتقييم تأثير ميثيونين البروتين الدهني MetQ ملزمة للاستعمار والفوعة من خلال تطبيق نموذج الفأر العدوى والالتهاب الرئوي الحاد. CD-1 الفئران الأباعد (ن = 10) أصيبوا الأنف مع 1 × 10 ⁷ البكتيريا من نوع السلالة البرية S. الرئوية D39 لوكس (PN149) أو إسوي متحولة D39 لوكس لها Δ metQ (الجدول 1). شيد متحولة metQ (PN252) من خلال الإدراج الحذف الطفرات في الجين metQ في إضاءة الحيوية D39 المكورات الرئوية. لذلك، تم تضخيم الجين metQ، 'تسلسل 5 و3'sequence بواسطة PCR باستخدام بادئات 382 و 385. تم استنساخ المنتج PCR في ناقلات PGEMT-سهلة، مما أدى إلى p559 البلازميد (الجدول 1). بواسطة العكسية PCR باستخدام بادئات 383 و 384 تم حذف تسلسل metQ (الإقليم الشمالي 58 إلى الإقليم الشمالي 777) والاستعاضة عنها كاسيت الاريثروميسين المقاومة الجين (ermB) تضخيمها من قبل PCR باستخدام البلازميد pE89 (الجدول 1)، والحمض النووي القالب (الجدول 2) و الزوج ermB_105/ermB_106 التمهيدي (الجدول 2). البلازميد الناتجة p563 تحولت ³⁴ في المكورات الرئوية كما هو موضح سابقا باستخدام تحفيز الكفاءة الببتيد-1. تم الانتهاء من زراعة المسوخ نقص في البروتين الدهني MetQ (Spd_0151) في الخطوط الجوية التركية أو على لوحات أجار الدم تستكمل مع الاريثروميسين (5 ميكروغرام / مل).

تم رصد الحالة الصحية للالفئران بشكل مستمر. تم التضحية الحيوانات عندما تظهر أي استجابة صحيحة أو علامات الاعتلال. علاوة على ذلك، نشر المكورات الرئوية من البلعوم الأنفي إلى الرئتين والدم، مما يؤدي إلى التهاب رئوي حاد والإنتان، وكان رصد ومراقبةأحمر عن طريق قياس تلألؤ بيولوجي كل ثماني ساعات. في كل مجموعة من الفئران المصابة 7 من أصل 10 الفئران وضعت علامات شديدة من المرض، في حين أظهرت 3 الفئران الأخرى لا تلألؤ بيولوجي ونجا (الشكل 3A). الفئران المصابة بنجاح مع إضاءة الحيوية البرية من نوع D39 لوكس وضعت 32 ساعة بعد الإصابة التهابات الرئة الحادة، والتي تقدم ضمن 8-16 ساعة إلى تعفن الدم (الشكل 3A). في وقت نقطة 96 ساعة استسلمت جميع الفئران التي وضعت الالتهاب الرئوي وتعفن الدم بعد الإصابة بفيروس D39 لوكس. ضعاف الخسارة من وظيفة البروتين الدهني ملزمة ميثيونين كبير في الفوعة من المكورات الرئوية. بعد 32 ساعة واحدة فقط الماوس المصابين متحولة metQ أظهرت عدوى الرئة ضعيفة، في حين أظهر البعض الآخر لا توجد مؤشرات واضحة على المرضى والالتهاب الرئوي. ومع ذلك، وبعد 48 ساعة أصبحت التهابات الرئة الحاد واضحا أيضا في الفئران المصابة مع متحولة. ونتيجة لذلك، وضعت هذه الفئران الإنتان 72 ساعةبعد الإصابة، وأصبح في وقت لاحق إلى الزوال من 72 ساعة بعد الإصابة، مما يدل على أن في نموذج عدوى الالتهاب الرئوي الحاد ونقص MetQ خفف المكورات الرئوية.

الجدول 1. الانفعال وقائمة البلازميد.

الجدول 2. قائمة التمهيدي. يتم تسطير مواقع تقييد.

الاستخدام المقصود التمهيدي	اسم التمهيدي	تسلسل (5'-3 ')
الإدراج الحذف الطفرات
التضخيم من sp_0149 + 5 'و 3 'المرافقة المنطقة	382 385	5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 '
PCR معكوس sp_0149 + 5 'و 3 'المنطقة المحيطة (pGEMTeasy)	383 384	5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 '
المضادات الحيوية التضخيم كاسيت
الاريثروميسين (ermB)	ermB_105 ermB_106	5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 '

ntent "> تم حساب تلألؤ بيولوجي قياسها باستخدام برامج التصوير أيضا. على غرار التصور من العدوى، وأظهرت الكمي لتدفق إضاءة الحيوية فروق ذات دلالة إحصائية بين نوع البرية المصابة وmetQ إصابة الفئران 32 و 40 ساعة بعد الإصابة، وهكذا، و الخسارة من وظيفة من MetQ خفف المكورات الرئوية والنتائج في تأخير كبير من العدوى الغازية، ولكن لا يؤدي في البكتيريا الفوعة.

الرقم 3. رصد نشر المكورات الرئوية في الفئران بعد العدوى داخل الأنف. قيم شدة تلألؤ بيولوجي من الفئران مجمعة (ن = 10 وتظهر A) التصوير الضوئي للإضاءة الحيوية من الفئران المصابة الأنف مع لوكس D39 أو D39 إسوي متحولة luxΔmetQ. B))للحصول على نقاط الوقت المشار إليه في الرسم البياني مربع ضئيلة للغاية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

كل التجارب التي أجريت على الحيوانات أن تتم الموافقة عليها من قبل السلطات المحلية واللجان الأخلاق. في التجارب المجراة في العدوى البكتيرية الحمل في مختلف المنافذ مجموعة من الحيوانات المصابة لابد من تحديد نقاط مختلفة في الوقت بعد الإصابة. في ظل هذه الظروف التجريبية على الحيوانات لديها لا بد من التضحية قبل عزل البكتيريا من الدم، والبلعوم الأنفي، غسيل bronchoalvelar، أو أجهزة مثل الرئتين والطحال، والدماغ. لحساب عدد من البكتيريا في مكانة المضيف وتقييم تأثير العوامل البكتيرية على الفوعة، دم أو أعضاء يجب أن تكون معزولة تليها البكتيرية يتعافى والطلاء على وسائل الاعلام الصلبة. ثم يتم كميا الحمولة الجرثومية التي كتبها تعداد كفو. للوصول إلى بيانات هامة إحصائيا كل نقطة زمنية يحتاج إلى مجموعة من الفئران، والتي تحت ظروف تجريبية معينة يؤدي إلى صعوبات في التعامل مع التجربة بسبب العدد الكبير من الفئران.

ove_content "> وفي المقابل، فإن طريقة bioimaging الوقت الحقيقي هو نهج تطالب وقتا أقل وكل فأر البكتيريا المصابة الفردية يمكن رصد عدة مرات على مدى فترة من الزمن. تقنية التصوير يسمح التصور من البكتيريا داخل الحيوانية في مختلف الساعة تشير آخر عدوى أو حتى لفترة زمنية ممتدة. وعلاوة على ذلك، وتلألؤ بيولوجي قياس مع برنامج تحليل الصور البصرية يمكن كذلك الكمي من الفوتونات المنبعثة من الحيوانات المصابة، وهذا يمكن أن تقتصر على منطقة محددة من الفأرة أو كله يمكن اعتبار الحيوان. في التجارب المجراة عدوى المكورات الرئوية الفئران المصابة يجب أن يتم رصدها في فترات من 8-12 ساعة، منذ انتشار المكورات الرئوية يمكن التقدم بسرعة في الأباعد CD-1 الفئران. يمكن استخدام التصوير في الوقت الحقيقي ل تصور التهجير من المكورات الرئوية من البلعوم الأنفي إلى الرئة والدم، وبالإضافة إلى ذلك، تكاثر المكورات الرئوية في الدمبعد العدوى داخل الصفاق يمكن رصدها من خلال الزيادة الكبيرة في كثافة تلألؤ بيولوجي ^26،28،29.

عند مقارنة المحتملة الفوعة البرية من نوع المكورات الرئوية والمسوخ إسوي فمن الضروري أن أول اختبار تأثير الجينات الخسارة من تحت ظروف المختبر في الثقافة. الاختلافات بين نمو البكتيريا من النوع البري والمسوخ، ولا سيما في المتوسط ​​محددة الصفات كيميائيا، تشير بالفعل اللياقة البدنية البكتيرية انخفضت ^26. وبالتالي، يرتبط توهين وحظ تحت ظروف في الجسم الحي مع علم وظائف الأعضاء مما يؤدي إلى تغير المكورات الرئوية أقل قوة خلال العدوى الاستعمار والغازية.

ومع ذلك، فإنه لابد من الإشارة إلى أن هذه التقنية التصوير غالبا ما تكون غير كافية للتدليل على تأثير الجينات على بالضربة القاضية الفوعة المكورات الرئوية. مماثلة لغيرها من البكتيريا المسببة للأمراض المكورات الرئوية هي الكائنات الدقيقة تنوعا وتطورت آليات متعددة الأوجه رس تواجه المضيف والتهرب من الجهاز المناعي. بالتالي، المكورات الرئوية إنتاج البروتينات على يد واحدة مع وظائف متعددة مثل PSPC adhesin، وعلى الجانب الآخر، وهبوا أنهم مع العديد من البروتينات واظهار وظائف مماثلة والتي بالتالي يمكن أن تعوض الخلل من البروتين بسبب الطفرات ^{4،17،18 ، 35.} في هذه السيناريوهات الأخرى في التجارب المجراة عدوى مثل عدوى مرافقة النهج يجب أن يعمل على فك تأثير وظيفة الخسارة من البروتين في متحولة للاستعمار أو التهابات الغازية ^27،28.

المكورات الرئوية استعمار وتصيب البشر تفضيلي ولكن تم عزل أيضا عن الحيوانات الأليفة أو الحيوانات حديقة الحيوان ^4،36،37. فك تأثير الفوعة أو تستخدم نماذج العدوى عوامل اللياقة البدنية الماوس. ومع ذلك، ليس كل سلالات المكورات الرئوية هي الماوس ضراوة، والأهم من ذلك، حساسية من الفئران يعتمد على الخلفية الوراثية للحيوانات ^22. المكورات الرئوية وتجرى دراسات الفوعة والدراسات الحماية في الوقت الحاضر مع CD-1 الفئران الأباعد. ومع ذلك، بالضربة القاضية أو الفئران الفئران المعدلة وراثيا هي أيضا ذات فائدة عالية على فك دور العوامل المضيفة لأمراض المكورات الرئوية الغازية. وغالبا ما يتم إنشاء أو خروج المغلوب الفئران المعدلة وراثيا في سلالات الفئران مثل C57/BL6 أو BALB / ج. هذه سلالات الفئران هي أقل عرضة ضد الالتهابات الرئوية وجرعة عالية العدوى والمطلوبة للحصول على الجرعة المميتة، 50٪ (LD _50). اعتمادا على جرعة عدوى هذه المقاومة من الفئران قد تضعف bioimaging الوقت الحقيقي من نشر المكورات الرئوية إلى الرئتين أو الدم، منذ المكورات الرئوية تقتصر على مضاعفة بطريقة اللازمة للكشف من قبل نظام التصوير. للتغلب على هذا القيد وتكون قادرة على نشر الصورة في الوقت الحقيقي، وجرعات عالية العدوى لا بد من الاستفادة منها. مخاطر هذا النهج يمكن أن تكون الاختلافات في قابلية المضيف لا يمكن استكشافها كما تقدم نشرها بسرعة كبيرة.

ق = "jove_content"> وفي الختام، واستخدام نظام التصوير يمثل نهجا ممتازا لمراقبة، قارن وتوصيف الإصابات الرئوية في الفئران المصابة عن طريق الأنف أو المسار داخل الصفاق. هذا النهج هو بشكل خاص مناسبة لمقارنة الفوعة المحتملة بين النوع البري والمسوخ من S. الرئوية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd Hewitt broth	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X936.1
Yeast extract	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2363.2
Blood agar plates	Oxoid, Wesel, Germany	PB5039A
Kanamycin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	T832.2
Erythromycin	Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany	E6376
Fetal bovine serum (FBS)	PAA Laboratories, Coelbe, Germany	A11-151
CD-1 mice, female	Charles River, Sulzfeld, Germany	CD1SIFE06W08W	female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500 mg, Curamed injection solution	Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution	Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes	Becton Dickinson, Heidelberg, Germany	300015	sterile Luer-Lok syringes with needle
Gel Loader Tips	PeqLab	81-13790	MµltiFlex Tips
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884-100mg	Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen	Air Liquide, Düsseldorf, Germany	M1001L50R2A001
Isoflurane	Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy	Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides	Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit	Qiagen, Hilden, Germany	27104
PCR DNA purification kit	Qiagen, Hilden, Germany	28106
Living Image 4.1 software	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer	Eppendorf AG, Hamburg, Germany