Summary
Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.
Abstract
A pneumonia é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento e países industrializados e está associada com morbidade e mortalidade considerável. Apesar dos avanços no conhecimento desta doença, a disponibilidade de unidades de terapia intensiva (UTI), eo uso de antimicrobianos potentes e vacinas efetivas, as taxas de mortalidade continuam altas 1. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Este patógeno é equipado com um arsenal de adesinas de superfície exposta e fatores de virulência que contribuem para pneumonia e doença pneumocócica invasiva (DPI). A avaliação do papel in vivo de aptidão ou de virulência fatores bacterianos é de extrema importância para desvendar S. mecanismos de patogenicidade pneumoniae. Modelos murinos de pneumonia, bacteremia e meningite estão sendo usados para determinar o impacto de fatores pneumocócicas em difrente fases da infecção. Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar em tempo real a divulgação pneumocócica em ratos após intranasal ou infecções intraperitoneais com bactérias bioluminescentes. Os resultados mostram a multiplicação e difusão de pneumococos no tracto respiratório inferior e do sangue, que pode ser visualizado e avaliada utilizando um sistema de imagem e o software de análise que a acompanha.
Introduction
Infecções respiratórias causadas por vírus ou bactérias continuam a ser um dos problemas adquiridas na comunidade ou clínicas mais comuns em todo o mundo, causando cerca de um terço de todas as mortes no mundo inteiro. As espécies de bactérias principais são o Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. No entanto, estas espécies de bactérias são normalmente constituintes comuns da flora natural do tracto respiratório. Assim, a carga bacteriana também é de certo risco para doença invasiva e, dependendo do estado imunitário ou predisposições dos indivíduos. A colonização assintomática é acionado para infecções invasivas. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Em indivíduos saudáveis S. pneumoniae (pneumococo) são muitas vezes assintomáticas colonizadores e inofensivos do trato respiratório superior, onde são confrontados com bactérias não patogênicasda flora residente, mas também com agentes patogênicos, como Haemophilus spp. ou de Staphylococcus aureus e a primeira linha de defesa do sistema imunitário humano. A freqüência de colonização são os mais altos em crianças pequenas (37%) e ainda mais dentro de creches lotadas (58%) 3-5. A população mais jovem e os idosos, que recebe o pneumococo através da transmissão aerossol de operadoras e secreções nasofaríngeas 6, pertencem aos grupos de alto risco e vacinação utilizando uma das vacinas conjugadas pneumocócicas (PCV10 ou PCV13 em crianças e polissacarídica 23-valente PPSV23 em adultos) É recomendado nos Estados Unidos (EUA) e muitos países europeus 4. O PPSV23 cobre sorotipos responsáveis por ~ 90% das doenças pneumocócicas bacteremia em os EUA e na Europa, evitando, assim, doenças pneumocócicas invasivas de forma eficiente (IPD) em adultos, enquanto as PCVs cobrir os sorotipos mais prevalentes em crianças. Consequentemente, IPD devido a tipos de vacinas (VT) são redusorotipos não incluídos na vacina ced mas exibindo um elevado potencial de virulência e resistência a antibióticos surgiram 4,7-12. A nasofaringe como o reservatório é o ponto de partida para pneumococos a se espalhar para os seios ou orelhas médias iniciando infecções locais prejudiciais. Mais importante ainda, pneumococos espalhar diretamente através das vias aéreas ao brônquios e pulmão, resultando em CAP risco de vida 4,13. Infecções pulmonares são frequentemente acompanhadas com e destruição do tecido de barreira, permitindo que o agente patogénico a propagar-se no sangue e causar IPD. As incidências de PAC e IPD são mais elevados em pessoas imunocomprometidas ou nos extremos da idade 4,13. As circunstâncias responsáveis pela conversão de um comensal a um patógeno com alta virulência ainda estão em debate. No entanto, têm sido sugeridas, além mudanças na suscetibilidade do hospedeiro e adaptação evolutiva acompanhado com maior virulência eo aumento da resistência a antibióticos para ter um impacto crucial sobre PNEinfecções umococcal 14-16.
O patógeno é dotado de uma multiplicidade de adesinas mediando o contato íntimo com as células epiteliais da mucosa. Depois de superar o muco das vias aéreas, a adesão às células hospedeiras pneumocócica é facilitada através de interações diretas de adesinas de superfície exposta com receptores celulares e através da exploração de componentes da matriz extracelular ou proteínas séricas como ponte moléculas 4,17,18. Patógenos tão versátil pneumococos também estão equipados com fatores envolvidos na evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro imune. Além disso, eles têm a capacidade de se adaptar a ambientes diversos hospedeiros, tais como o pulmão, sangue e fluido cerebrospinal (CSF), respectivamente 5,17,19,20.
O impacto dos fatores bacterianos sobre patogênese e inflamatória do hospedeiro respostas é investigada em modelos animais experimentais de pneumonia, bacteremia ou meningite 21-25. Apesar de ser um patógeno humano, estes modelos são nósll-estabelecidos para decifrar tropismo pneumocócica tecidos, mecanismos de virulência, ou protectivity de vacinas pneumocócicas. O fundo genético de linhagens puras determina a susceptibilidade a pneumococos. Ratinhos BALB / c por via intranasal infectados com pneumococos foram consideradas resistentes, enquanto que a CBA / Ca e SJL ratinhos eram mais susceptíveis às infecções pneumocócicas 22. Isto implica que, semelhante aos seres humanos, o fundo genético e os mecanismos de defesa do hospedeiro determinar o resultado da infecção. Por isso, são necessárias para desvendar locos de resistência no genoma de ratinhos menos susceptíveis a infecções por pneumococos esforços suplementares. Os resultados levaram a mudanças na in vivo protocolos de virulência. Em vez dos ratinhos BALB / c consanguíneos muitas vezes utilizados no passado, as estirpes de ratinho outbred CD-1/MF1 altamente sensíveis são hoje em dia, muitas vezes utilizado para estudar o efeito de virulência ou aptidão pneumocócica perda de função factores 26-28. Além disso, a disponibilidadede pneumococos bioluminescente e técnicas de imagem óptica permite que o tempo real de bioluminescência bioimaging de infecções. Em pneumococos a cassete do gene luxABCDE optimizado (plasmídeo Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) foi inserido num local de integração único de cromossoma por mutagénese por transposões. Pneumococos bioluminescente têm sido empregados para avaliar a atenuação de mutantes pneumocócicas deficientes em virulência ou aptidão fatores e sua translocação de um sítio anatômico para outro 26,28-31.
Aqui nós fornecemos um protocolo para a bioimaging das infecções pneumocócicas em uma pneumonia ou modelo murino sepse. A amplificação e disseminação de pneumococos bioluminescente em ratinhos por via intranasal ou por via intraperitoneal infectadas podem ser facilmente monitorizados ao longo do tempo utilizando um sistema de imagiologia óptica e do mesmo animal em diferentes pontos de tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os experimentos de infecção de animais aqui descritos devem ser executados em estrita conformidade com o (por exemplo, o direito europeu de Saúde da Federação das Associações de Laboratório Ciência Animal (FELASA)) local e internacional diretrizes e normas para o uso de animais vertebrados. Os experimentos têm de ser aprovados pelo conselho de ética local e do Comitê Animal Care Institucional. Todas as experiências com S. pneumoniae no laboratório ou as infecções animais são conduzidos em uma Classe II Biossegurança Gabinete.
1. Preparação de Doenças Infecciosas da Bolsa de Bioluminescent Pneumocococi
- Prepare culturas estoque de pneumococos em caldo de Todd-Hewitt suplementado com 1% (w / v) de extracto de levedura e uma concentração final de 20% de glicerol para a manutenção a 80 ° C.
- Placa de uma pequena quantidade de cultura de pneumococos ultracongelado sobre uma placa de agar de sangue e incubar as bactérias durante 10 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. Tele placa de ágar de sangue contém os antibióticos adequados, tais como canamicina (150 ng / ml) para a inserção de transposões da cassete do gene luxABCDE no genoma.
- Sub-cultivar uma nova colônia para uma nova placa de ágar sangue para um máximo de 10 horas.
- THY inocular meio suplementado com 10% (v / v) inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de soro fetal bovino (FBS) com pneumococos e iniciar a cultura a uma DO 600 de 0,05-0,07.
- Incubar pneumococos, sem agitação, a 37 ° C e 5% de CO 2 até a cultura atingir uma OD 600 de 0,35-0,40. Crescimento levará entre 3-4 horas.
- Colheita pneumococos por centrifugação a 3750 xg durante 10 min e ressuspender pneumococos bioluminescente em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS) suplementada com 0,5% de FBS.
- Ajustar o inoculo para a concentração desejada em PBS/10% de FBS. A dose infecção depende da cepa de pneumococo utilizado eo fundo genético do microfonee. Para infectar outbred ratinhos CD-1 por via intranasal com S. pneumoniae D39 lux a dose de infecção deve ser ajustada a 1 x 10 7 UFC de uma suspensão de 20 ul suplementados com 90 unidades de hialuronidase. Não agite ou vórtice pneumococo, uma vez que este irá desencadear autólise.
- Verificar a concentração de inoculo por plaqueamento de 10 diluições em série de dobragem em agar de sangue e contagem das colónias após crescimento durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Verifique a bioluminescência do inoculo pneumocócica medindo a bioluminescência utilizando um sistema de imagem óptica.
2. Intranasal e Infecção intraperitoneal de camundongos com Bioluminescent pneumococos
- Utilizar ratos fêmea consanguíneos na idade de 7-10 semanas para o modelo de pneumonia aguda e sépsis. O peso destes ratinhos deve estar entre 20-30 g.
- Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de ketamina e xilazina. Prepara-se uma mistura de 1,0 mgde cetamina e xilazina 0,1 mg em 100 ul estéril a 0,9% (w / v) de cloreto de sódio para os ratinhos com um peso corporal de 20 g. Isto é consistente com uma dose de 50 mg / kg de peso corporal para a cetamina e 5 mg / kg de peso corporal para a xilazina. Para ser exato, pesar camundongos antes da injeção do anestésico.
- Injectar a mistura na cavidade intraperitoneal e colocar os animais de volta para dentro da gaiola, até os anestésicos agem e os animais são narcotizada. A respiração dos ratos se tornará muito lento e regular. Os ratos têm de ser totalmente narcotizado, de modo que a inoculação intranasal e inalação da suspensão bacteriana não vai resultar em espirros e, portanto, a perda de inoculo. Isso pode ser avaliado por beliscar o mouse no final de sua cauda; um mouse totalmente narcotizada faltará capacidade de resposta.
- Gentilmente pegar um rato narcotizada e segure o mouse entre os dedos eo polegar, com o nariz em pé (Figura 1).
- Use uma pipeta com longas pontas estreitas (Gel CarregadorDicas) e soltar pneumococos bioluminescente em várias gotas pequenas para as narinas (10 mL / narina) do mouse 26-29. O rato vai involuntariamente inalar as bactérias. Segure o mouse 1-2 min na posição vertical e observar se o mouse espirra ou mantém o inóculo.
- Infect 7-10 semanas de idade ratinhos CD-1 por via intranasal com uma dose de infecção de 1 x 10 7 ou 7,5 x 10 7 pneumococos da estirpe D39 e TIGR4, respectivamente, para monitorar a infecção em tempo real. O limite de detecção para o sistema sem qualquer absorção pelo tecido do hospedeiro é de cerca de 1 x 10 6 bactérias bioluminescentes.
- Infectar camundongos por via intraperitoneal (IP) para avaliar e BioImage virulência do pneumococo em um modelo de infecção sepsis mouse. Use 5 x 10 3 UFC em 100 ul de D39 tensão e 1 x 10 4 de tensão TIGR4. Ratos não são anestesiados quando se utiliza a via IP.
- Inocular camundongos controle com PBS.
Figura 1. Infecção intranasal de murganhos CD-1 com S. pneumoniae. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
3. Visualizando pneumocócica Divulgação no Pulmão e Sangue Utilizando o Sistema de Imagem
Imagem de divulgação de pneumococos após a infecção intranasal de camundongos fêmeas outbred CD1 em tempo real usando um sistema de imagem in vivo.
- Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de análise de imagem localizado no computador pré-configuração.
- O sistema de imagem inicia automaticamente e a câmara CCD é termoelectricamente arrefecido a 90 ° C antes de ser activo.
- As configurações e binning depender do número de ratinhos medidoe, simultaneamente, com a força do sinal bioluminescente. O campo de visão (FOV) para monitorar a bioluminescência dos animais é variável ea ampliação varia entre um FOV de 22,5 cm a medir cinco ratos, e um FOV de 3,9 cm para medir um único rato ou partes do animal como o peito ou na cabeça.
- Use rotineiramente um tempo de exposição de 1 min, um grau médio de binning, e um FOV de 22,5 cm (conjunto D). Em primeiro lugar, selecione o modo de imagem luminescente e, em seguida, definir os parâmetros de imagem.
- A emissão do sinal pode depender da estirpe bacteriana e estirpe de ratinhos utilizada, e o pigmento do rato. Raspar o peito dos ratos quando se utiliza por exemplo, ratinhos C57BL / 6, o que pode ser vantajoso na obtenção de imagens do desenvolvimento da pneumonia nestes ratinhos.
- Imagem ratinhos infectados, a intervalos de tempo previamente escolhida. Medir a bioluminescência de ratos no modelo de pneumonia aguda em intervalos de tempo de 8-12 horas no máximo. Monitorar também o bem-estar de camundongos infectados por observing sua aparência, comportamento e determinação da perda de peso.
- Anestesiar os ratos na câmara narcótico do sistema de anestesia do equipamento de imagem antes das medições na câmara. Comece a inalação de uma mistura de isoflurano e oxigênio e esperar até que os camundongos respirar lenta e regularmente.
- Coloque animais anestesiados para a câmara de formação de imagens do sistema e manter os ratos na posição supina. A câmara CCD sobre a parte superior da câmara será então a imagem do tracto respiratório murino.
- Colocar os animais com o seu nariz em tubos para permitir a inalação do anestésico.
- Isoflurano entrada para a câmara de imagiologia por meio de uma tubagem de gás é permitido para manter a anestesia.
- Para ativar a câmera CCD no topo da câmara e começar a imagem óptica bioluminescente, pressione "Acquire" no software de imagem. Imediatamente uma fotografia dos ratinhos na câmara fechada, aparece no ecrã. Após um minuto de medição uma sobreposição dos dados bioluminescência ea foto é mostrada.
- Pare de anestesia após a sobreposição de imagem aparece na janela do software e colocar os ratos de volta em suas gaiolas.
- Ratos são monitorados para a recuperação.
Figura 2. Anestesia e monitoramento de camundongos infectados com pneumococos bioluminescente utilizando a anestesia eo sistema IVIS IVIS Spectrum, respectivamente. A) O sistema IVIS Spectrum imagem. B) O sistema de anestesia IVIS com a câmara de incubação. C) Ratos anestesiados na câmara de incubação . D) Ratos localizado no interior da câmara IVIS Espectro de imagem com o nariz a inalação do anestésico._blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
4. Quantificação e Avaliação da bioluminescência de camundongos infectados com S. Bioluminescent pneumoniae
- Determinar as intensidades de bioluminescência dos ratos ou de uma região seleccionada dos ratinhos por quantificar a emissão de fotões totais (fotões / sec) usando o software de análise de imagem.
- Use os valores da emissão de fótons que são fornecidos em uma folha de dados do Excel para preparar um gráfico. Uma vez que a variação de dados é frequentemente elevado nos ratinhos agrupados, gerar um gráfico de caixa suiça para mostrar as diferenças de ratinhos infectados com diferentes estirpes de pneumococos.
- Proporcionar os fotões por ratinhos ou alternativamente os resultados como a média de brilho (fotões / sec / cm 2 / SR) de uma área seleccionada.
- Os dados de medição de ROI (região de interesse) no modo de fóton pode ser quantitativamente comparados entre diferentes em sistemas de imagem in vivo com diferente veioconfigurações ra, uma vez que as medidas em unidades de irradiação têm automaticamente em conta as definições da câmara (por exemplo, o tempo de integração, binning, f / stop, e campo de visão).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A aquisição e absorção de metionina é de importância central para pneumococos para manter a forma em seu nicho de acolhimento 32,33. A metionina ABC transportador lipoproteína é codificado em D39 pelo SPD _ 0151 gene (TIGR4: sp_0149) e nomeado METQ 32. Os pneumococos produzir mais enzimas de biossíntese de metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). A falta de metionina num meio quimicamente definido afecta o crescimento de pneumococos e semelhante, a falta da metionina ligação lipoproteína METQ auditivos absorção de metionina 32,33. Este defeito pode ser restaurada através da adição de elevadas concentrações de metionina. Nas experiências de colonização do rato mutante deficiente em METQ não foi atenuado em virulência, como demonstrado em experiências de co-infecção com o tipo selvagem isogénica, enquanto a falta de METQ atenuada pneumococos em modelos de ratos de septicemia e pneumonia como mostrado peladeterminar a carga bacteriana, 32. Bioimaging óptica em tempo real usando o Spectrum IVIS usado aqui permite monitorar a multiplicação e disseminação de bactérias em um único animal infectado em momentos diferentes.
No exemplo mostrado aqui, avaliamos o impacto da ligação lipoproteína METQ na colonização e virulência através da aplicação do modelo de rato infecção pneumonia aguda metionina. Ratinhos CD-1 não consanguíneos (n = 10) foram infectados por via intranasal com 1 x 10 7 de bactérias de tipo selvagem estirpe de S. pneumoniae lux D39 (PN149) ou seu isogênico lux D39 mutante Δ METQ (Tabela 1). O mutante METQ (PN252) foi construído por inserção-deleção mutagénese do gene METQ em bioluminescente pneumococos D39. Portanto, o gene METQ, a sequência 5 'e 3'sequence foram amplificados por PCR utilizando os iniciadores 382 e 385. O produto de PCR foi clonado no vector de PGEMT-fácil, o que resultou no plasmídeo p559 (Tabela 1). A técnica de PCR inversa utilizando os iniciadores 383 e 384 (Tabela 2), a sequência METQ (nt 58 a nt 777) foi eliminada e substituída por uma cassete de gene de resistência à eritromicina (ermB) amplificado por PCR usando o plasmídeo pE89 (Tabela 1) como ADN-molde e o par ermB_105/ermB_106 iniciador (Tabela 2). O plasmídeo resultante P563 34 foi transformado em pneumococos como descrito anteriormente utilizando-estimulante competência péptido-1. Os mutantes deficientes na METQ lipoproteína (Spd_0151) foram cultivadas em THY ou em placas de agar suplementadas com sangue de eritromicina (5 mg / ml).
O estado de saúde dos ratos foi monitorada continuamente. Os animais foram sacrificados ao mostrar nenhuma resposta ou sinais de morbidade adequada. Além disso, a divulgação pneumocócica da nasofaringe para os pulmões e no sangue, levando à pneumonia grave e sepse, foi monitovermelho através da medição da bioluminescência cada oito horas. Em cada grupo de ratinhos infectados 7 de 10 ratinhos desenvolveram sinais graves de doença, enquanto os outros três ratinhos não mostraram bioluminescência e sobreviveram (Figura 3A). Ratos infectados com sucesso com o bioluminescente do tipo selvagem D39 lux desenvolveu 32 horas infecções pulmonares graves pós-infecção, que progride dentro de 8-16 horas para sepse (Figura 3A). Na hora do ponto 96 h todos os ratos que tinham sucumbido desenvolveu pneumonia e sepse pós-infecção com o D39 lux. A perda de função de ligação à lipoproteína de metionina prejudicada significativamente a virulência dos pneumococos. Depois de 32 horas apenas um rato infectado com o mutante METQ mostrou uma infecção pulmonar fraco, enquanto os outros não mostrou sinais evidentes de doença e pneumonia. No entanto, após 48 horas de infecções pulmonares graves tornaram-se também evidente em ratos infectados com o mutante. Como resultado, esses camundongos desenvolveram sepse 72 hrpós-infecção e tornou-se moribunda até 72 horas após a infecção, o que demonstra que, no modelo de infecção pneumonia aguda deficiência de METQ atenua pneumococos.
Tabela 1. Coe e lista plasmídeo.
Lista Primer Tabela 2.. Locais de restrição estão sublinhados.
| Uso pretendido Primer | Nome do iniciador | Sequência (5'-3 ') |
| Mutagênese de Inclusão-exclusão | ||
| A amplificação de sp_0149 + 5 'e 3 'que flanqueiam a região | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| PCR inverso de sp_0149 + 5 'e Região 3 'flanqueando (pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-AAGCTT ATCATCATCATCG AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-AAGCTT ACTCACTCACTG ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| Amplificação cassete antibióticos | ||
| eritromicina (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
Figura 3. Monitoramento de disseminação pneumocócica em ratos após a infecção intranasal. A) imagiologia óptica Bioluminescent de camundongos infectados por via intranasal com lux D39 ou a isogénico luxΔmetQ D39 mutante. B) Os valores das intensidades de bioluminescência de ratinhos em grupos (n = 10) são apresentadaspara pontos de tempo indicado no gráfico uma caixa de bigodes. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Todos os experimentos realizados em animais têm de ser aprovados pelas autoridades locais e comissões de ética. Em experiências in vivo de infecção a carga bacteriana nos vários nichos hospedeiras de animais infectados tem de ser determinada a diferentes pontos de tempo após a infecção. Sob estas condições experimentais, os animais têm de ser sacrificados antes do isolamento de bactérias a partir do sangue, a nasofaringe, lavado bronchoalvelar, ou órgãos tais como os pulmões, baço e cérebro. Para calcular o número de bactérias por nicho hospedeiro e avaliar o efeito de factores bacterianos na virulência, do sangue ou órgãos tem que ser isolado, seguido de recuperação de bactérias e de plaqueamento em meios sólidos. A carga bacteriana é então quantificada por contagem de CFU. Para alcançar dados significativos cada ponto de tempo necessita de um grupo de ratinhos, o que em determinadas condições experimentais leva a dificuldades no manuseamento da experiência, devido ao elevado número de ratinhos estatisticamente.
ove_content "> Em contraste, o método bioimaging em tempo real é uma abordagem menos exigente do tempo e cada rato bactérias indivíduo infectado pode ser monitorizada por diversas vezes ao longo de um período de tempo. A técnica de imagem permite a visualização das bactérias dentro do animal, diferente pontos de tempo após a infecção, ou mesmo por um período de tempo prolongado. Além disso, a bioluminescência medido com o software de análise de imagem óptica permite ainda a quantificação de fotões emitidos pelo animal infectado. Isto pode ser limitada a uma área definida do rato ou a totalidade animal pode ser considerado. Nos experimentos in vivo de infecção ratos infectados com pneumococos têm de ser monitorizadas em intervalos de 8-12 horas, uma vez que a propagação de pneumococos pode progredir rapidamente em outbred ratinhos CD-1. A imagem em tempo real pode ser utilizado para visualizar a transmigração de pneumococos da nasofaringe para o pulmão e no sangue, e para além disso, a multiplicação de pneumococos no sangueapós infecção intraperitoneal pode ser monitorizado pelo aumento dramático em intensidade bioluminescência 26,28,29.Quando se compara o potencial de virulência dos pneumococos do tipo selvagem e mutantes isogénicas é essencial testar o primeiro efeito da perda de genes-de-sob as condições de cultura in vitro. Diferenças de crescimento entre as bactérias de tipo selvagem e mutantes, em particular, em meio quimicamente definido, já indicam uma aptidão bacteriana diminuiu 26. Assim, a atenuação observada sob condições in vivo está associada a uma fisiologia alterada levando a pneumococos menos robusta durante a colonização e infecções invasivas.
No entanto, tem que ser mencionado que esta técnica de imagem muitas vezes não é suficiente para demonstrar o efeito de marcação do gene de virulência do pneumococo. Semelhante a outros pneumococos bactérias patogênicas são microrganismos versáteis e evoluíram mecanismos multifacetadas to encontro o anfitrião e iludir o sistema imunológico. Consequentemente, os pneumococos em produzir as proteínas de uma mão com funções múltiplas, tais como a PspC adesina e, por outro lado, eles são dotadas com várias proteínas que exibem funções semelhantes, que podem assim compensar o defeito de uma proteína, devido a mutações 4,17,18 , 35. Nessas situações outras experiências in vivo de infecção, tais como a abordagem de co-infecção tem de ser empregue para decifrar o efeito da perda de função da proteína no mutante de colonização ou infecções invasivas 27,28.
Os pneumococos colonizar e infectar os seres humanos, mas, preferencialmente, também foram isoladas de animais de estimação ou animais do jardim zoológico 4,36,37. Para decifrar o impacto da virulência ou modelos de infecção fatores de aptidão do mouse são usados. No entanto, nem todas as cepas de pneumococo são mouse virulento, e mais importante, a susceptibilidade de camundongos depende da herança genética dos animais 22. Pneumocócicaestudos de virulência e estudos de proteção são hoje realizados com camundongos CD-1 outbred. No entanto, camundongos knockout ou camundongos transgênicos também são de grande interesse para decifrar o papel de fatores do hospedeiro para doenças pneumocócicas invasivas. O nocaute ou camundongos transgênicos são muitas vezes gerada em linhagens de camundongos, como C57/BL6 ou Balb / c. Estas linhagens de camundongos são menos suscetíveis às infecções pneumocócicas e doses de infecção alta são obrigados a obter uma dose letal, 50% (LD 50). Dependendo da dose de infecção esta resistência de ratinhos pode prejudicar bioimaging de difusão pneumocócica tempo real para os pulmões ou no sangue, uma vez que os pneumococos estão limitados a multiplicar-se de um modo preciso para a detecção pelo sistema de imagiologia. Para ultrapassar esta limitação e de ser capaz de imagem a divulgação em tempo real, as doses elevadas de infecção tem que ser utilizado. O risco desta abordagem poderia ser que as diferenças na suscetibilidade do hospedeiro não pode ser explorado como a divulgação progride muito rapidamente.
via intranasal ou por via intraperitoneal. Esta abordagem é, em particular, adequado para comparar o potencial de virulência entre o tipo selvagem e mutantes de S. pneumoniae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Pesquisas em laboratório foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) Genomics Infecção Médico (FKZ 0315828A) para SH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G.
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J.
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E.
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
