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Immunology and Infection

Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/51174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department Genetics of Microorganisms, Interfaculty Institute for Genetics and Functional Genomics, University of Greifswald

Summary

स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया गंभीर समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया और दुनिया भर में 2 लाख से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार के कारण प्रमुख रोगज़नक़ है. फिटनेस या डाह में फंसा बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग कर एक तीव्र माउस निमोनिया या bacteremia मॉडल में वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है.

Abstract

निमोनिया के विकास में प्रमुख स्वास्थ्य देखभाल की समस्याओं और औद्योगिक देशों में से एक है और काफी रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. इस बीमारी का ज्ञान, गहन चिकित्सा इकाई (आईसीयू) की उपलब्धता, और शक्तिशाली रोगाणुरोधी एजेंटों और प्रभावी टीके के प्रयोग में प्रगति के बावजूद, मृत्यु दर 1 अधिक रहती है. स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया के प्रमुख रोगज़नक़ (कैप) है और मनुष्यों में bacteremia का सबसे सामान्य कारणों में से एक. इस रोगज़नक़ सतह उजागर adhesins और निमोनिया और आक्रामक न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) के लिए योगदान विषैलापन कारकों में से एक साधन के साथ सुसज्जित है. बैक्टीरियल फिटनेस या विषैलापन कारकों के vivo भूमिका का आकलन एस को जानने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है निमोनिया pathogenicity तंत्र. निमोनिया, bacteremia, और दिमागी बुखार के murine मॉडल अलग पर न्यूमोकोकल कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हैसंक्रमण के चरणों अलग. यहाँ हम intranasal या bioluminescent बैक्टीरिया के साथ intraperitoneal संक्रमण के बाद चूहों में वास्तविक समय न्यूमोकोकल प्रसार में नजर रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. परिणाम एक इमेजिंग प्रणाली और साथ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कल्पना और मूल्यांकन किया जा सकता है, जो कम श्वसन तंत्र और रक्त में गुणन और pneumococci के प्रसार, दिखाते हैं.

Introduction

वायरस या बैक्टीरिया की वजह से श्वसन तंत्र में संक्रमण दुनिया भर में सभी की मौत का लगभग एक तिहाई के कारण दुनिया भर में सबसे आम समुदाय उपार्जित या नैदानिक ​​समस्याओं के रहते हैं. कुंजी बैक्टीरियल प्रजातियों हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 2 हैं. हालांकि, इन प्रजातियों के जीवाणु सामान्य रूप से प्राकृतिक श्वसन तंत्र वनस्पति के आम घटक हैं. इस प्रकार बैक्टीरियल गाड़ी आक्रामक रोग और प्रतिरक्षा स्थिति या व्यक्तियों के predispositions पर निर्भर करता है के लिए कुछ जोखिम का भी है. स्पर्शोन्मुख बसाना आक्रामक संक्रमण के लिए शुरू हो रहा है. स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया (कैप) और मानव में bacteremia का सबसे सामान्य कारणों में से एक के प्रमुख रोगज़नक़ है. स्वस्थ व्यक्तियों में एस निमोनिया (pneumococci) अक्सर वे nonpathogenic बैक्टीरिया के साथ सामना कर रहे हैं, जहां ऊपरी श्वास नलिका, का स्पर्शोन्मुख और हानिरहित उपनिवेशवादियों हैंलेकिन ऐसे भी हेमोफिलस एसपीपी के रूप में रोगजनकों के साथ निवासी वनस्पतियों की. या Staphylococcus aureus और मानव प्रतिरक्षा रक्षा प्रणाली की पहली पंक्ति. कैरिज दरों छोटे बच्चों में सबसे अधिक हैं (37%) और 3-5 (58%) भीड़ दिन देखभाल केंद्रों के भीतर भी अधिक है. सबसे कम उम्र की आबादी और बुजुर्ग, वाहक और nasopharyngeal स्राव 6 से एयरोसोल प्रसारण के जरिए pneumococcus प्राप्त, न्यूमोकोकल संयुग्म टीके (वयस्कों में बच्चों और 23-valent polysaccharide PPSV23 में PCV10 या PCV13) में से एक का उपयोग उच्च जोखिम वाले समूहों और टीकाकरण के हैं संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) और कई यूरोपीय देशों 4 में सिफारिश की है. PCVs बच्चों में सबसे अधिक प्रचलित सीरमप्रकारों कवर जबकि PPSV23, वयस्कों में इस प्रकार कुशलता से आक्रामक न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) को रोकने के अमेरिका और यूरोप में bacteremic न्यूमोकोकल रोग, के 90% ~ के लिए जिम्मेदार सीरमप्रकारों को शामिल किया गया. नतीजतन, आईपीडी कारण वैक्सीन प्रकार (वीटी) को redu हैंएक उच्च डाह क्षमता और एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदर्शित CED लेकिन nonvaccine सीरमप्रकारों 4,7-12 उभरा है. जलाशय के रूप में nasopharynx हानिकारक स्थानीय संक्रमण की शुरुआत साइनस या मध्य कान में फैल pneumococci के लिए प्रारंभ बिंदु है. जीवन के लिए खतरा कैप 4,13 में जिसके परिणामस्वरूप ब्रोन्किया और फेफड़ों को airway के माध्यम से सीधे फैल अधिक महत्वपूर्ण है, pneumococci. फेफड़ों में संक्रमण अक्सर इस प्रकार रक्त में प्रसार करने के लिए रोगज़नक़ सक्षम और आईपीडी, जिससे ऊतक और बाधा विनाश के साथ साथ कर रहे हैं. कैप और आईपीडी की घटनाओं immunocompromised व्यक्तियों में या उम्र 4,13 के चरम पर सबसे अधिक हैं. उच्च डाह के साथ एक रोगाणु एक खानेवाला से रूपांतरण के लिए जिम्मेदार परिस्थितियों बहस के तहत अब भी कर रहे हैं. हालांकि, उच्च डाह और एंटीबायोटिक प्रतिरोध में वृद्धि के साथ साथ मेजबान संवेदनशीलता और विकासवादी अनुकूलन में परिवर्तन के अलावा PNE पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है सुझाव दिया गया हैumococcal संक्रमण 14-16.

रोगज़नक़ उपकला कोशिकाओं mucosal को घनिष्ठ संपर्क में मध्यस्थता adhesins की बहुलता के साथ संपन्न है. Airway बलगम surmounting के बाद, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए न्यूमोकोकल पालन सेलुलर रिसेप्टर्स के साथ सतह उजागर adhesins का प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से और अणुओं 4,17,18 सेतु के रूप में बाह्य मैट्रिक्स घटकों या सीरम प्रोटीन शोषण से मदद की है. के रूप में बहुमुखी रोगजनकों pneumococci भी मेजबान प्रतिरक्षा सुरक्षा तंत्र की चोरी में शामिल घटकों के साथ सुसज्जित हैं. इसके अलावा, वे इस तरह के क्रमशः फेफड़े, रक्त, और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), 5,17,19,20 के रूप में विभिन्न मेजबान milieus के लिए अनुकूल करने की क्षमता है.

रोगजनन और भड़काऊ मेजबान प्रतिक्रियाओं पर बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव को निमोनिया, bacteremia की प्रयोगात्मक पशु मॉडल में जांच की, या 21-25 मैनिंजाइटिस है. एक मानव रोगज़नक़ होने के बावजूद, इन मॉडलों हम कर रहे हैंन्यूमोकोकल ऊतक tropism, डाह तंत्र, या न्यूमोकोकल वैक्सीन उम्मीदवारों की protectivity समझने के लिए करूँगा की स्थापना की. जन्मजात माउस उपभेदों के आनुवंशिक पृष्ठभूमि pneumococci के लिए संवेदनशीलता को निर्धारित करता है. CBA / सीए और SJL चूहों न्यूमोकोकल संक्रमण 22 लोगों के खिलाफ अधिक अतिसंवेदनशील थे जबकि intranasally pneumococci से संक्रमित BALB / ग चूहों, प्रतिरोधी होना पाया गया है. यह मनुष्य, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और मेजबान सुरक्षा तंत्र के लिए इसी तरह के संक्रमण के परिणाम तय, कि निकलता है. इसलिए, आगे प्रयास न्यूमोकोकल संक्रमण को कम अतिसंवेदनशील चूहों के जीनोम में प्रतिरोध स्थलों को जानने के लिए आवश्यक हैं. निष्कर्ष में विवो डाह प्रोटोकॉल में परिवर्तन भी आया है. इसके बजाय अक्सर अतीत में इस्तेमाल जन्मजात BALB / ग चूहों की, अत्यधिक अतिसंवेदनशील CD-1/MF1 outbred माउस उपभेदों आजकल अक्सर नुकसान के समारोह न्यूमोकोकल डाह या फिटनेस 26-28 कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, उपलब्धताbioluminescent pneumococci और ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के संक्रमण की वास्तविक समय bioluminescence bioimaging अनुमति देता है. Pneumococci में अनुकूलित luxABCDE जीन कैसेट (प्लाज्मिड पॉल एक TN 4001 luxABCDE किमी नि.) transposon mutagenesis के द्वारा गुणसूत्र का एक भी एकीकरण साइट में डाला गया है. Bioluminescent pneumococci डाह या फिटनेस कारकों और एक अन्य 26,28-31 के लिए एक संरचनात्मक साइट से उनके स्थानान्तरण में कमी न्यूमोकोकल म्यूटेंट की क्षीणन का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया है.

यहाँ हम एक murine निमोनिया या पूति मॉडल में न्यूमोकोकल संक्रमण के bioimaging के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. Intranasally या intraperitoneally संक्रमित चूहों में प्रवर्धन और bioluminescent pneumococci के प्रसार को आसानी से अलग समय बिंदुओं पर एक ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम और एक ही जानवर का उपयोग कर समय पर नजर रखी जा सकती है.

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Protocol

यहाँ वर्णित पशु संक्रमण प्रयोगों दिशा निर्देशों और हड्डीवाला जानवरों के उपयोग के लिए नियमों को स्थानीय और अंतरराष्ट्रीय (प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघ (FELASA) के संघ के जैसे यूरोपीय स्वास्थ्य कानून) के साथ सख्त अनुसार किया जाना चाहिए. प्रयोगों स्थानीय नैतिक बोर्ड और संस्थागत पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना है. एस के साथ सभी प्रयोगों प्रयोगशाला या जानवर संक्रमण में निमोनिया एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित की जाती हैं.

1. Bioluminescent Pneumocococi के संक्रामक शेयर की तैयारी

  1. 80 डिग्री सेल्सियस पर (w / v) खमीर निकालने और रखरखाव के लिए 20% ग्लिसरॉल के अंतिम एकाग्रता 1% के साथ पूरक टोड-हेविट शोरबा में शेयर न्यूमोकोकल संस्कृतियों की तैयारी
  2. एक रक्त अगर प्लेट पर गहरे जमी शेयर न्यूमोकोकल संस्कृति की एक छोटी राशि की थाली और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 घंटे के लिए बैक्टीरिया सेते हैं. टीवह रक्त अगर प्लेट जीनोम में luxABCDE जीन कैसेट की transposon प्रविष्टि के लिए इस तरह के केनामाइसिन (150 माइक्रोग्राम / एमएल) के रूप में उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं में शामिल है.
  3. 10 घंटा की अधिकतम के लिए एक नई रक्त अगर प्लेट पर एक ताजा कॉलोनी उप खेती.
  4. तुम्हारा मध्यम 10% (v / v) गर्मी (56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) pneumococci साथ साथ पूरक और एक आयुध डिपो 0.05-0.07 के 600 में संस्कृति शुरू टीका लगाना.
  5. संस्कृति एक आयुध डिपो 0.35-0.40 के 600 तक पहुँच जाता है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन और 5% सीओ 2 के बिना pneumococci सेते हैं. ग्रोथ 3-4 घंटे के बीच ले जाएगा.
  6. 10 मिनट के लिए 3,750 XG पर और 0.5% FBS के साथ पूरक फॉस्फेट बफर खारा 7.4 पीएच (पीबीएस) में bioluminescent pneumococci resuspend centrifugation द्वारा हार्वेस्ट pneumococci.
  7. PBS/10% FBS में वांछित एकाग्रता के लिए inoculum समायोजित करें. संक्रमण खुराक इस्तेमाल किया न्यूमोकोकल तनाव और mic के आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता हैई. एस के साथ intranasally outbred सीडी -1 चूहों को संक्रमित निमोनिया D39 संक्रमण खुराक 90 इकाइयों hyaluronidase के साथ पूरक 20 μl के निलंबन में 1 एक्स 10 7 CFU करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए लक्स. इस आत्म - विनाश ट्रिगर किया जाएगा, के बाद से हिला या भंवर pneumococci मत करो.
  8. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात वृद्धि के बाद रक्त अगर और कालोनियों की गणना पर 10 गुना धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा inoculum एकाग्रता की जाँच करें.
  9. एक ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर bioluminescence मापने के द्वारा न्यूमोकोकल inoculum के bioluminescence सत्यापित करें.

2. Bioluminescent pneumococci साथ intranasal और चूहे की intraperitoneal संक्रमण

  1. तीव्र निमोनिया और पूति मॉडल के लिए 7-10 सप्ताह की आयु में महिला outbred चूहों का प्रयोग करें. इन चूहों का वजन 20-30 ग्राम के बीच होना चाहिए.
  2. Ketamine और xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize. एक मिश्रण 1.0 मिलीग्राम की तैयारी100 μl बाँझ 0.9% में ketamine और 0.1 मिलीग्राम xylazine 20 ग्राम की एक शरीर के वजन के साथ चूहों के लिए (w / v) सोडियम क्लोराइड. इस ketamine के लिए / किग्रा शरीर के वजन के 50 मिलीग्राम और xylazine के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक के साथ संगत है. सटीक करने के लिए, anesthetics के इंजेक्शन से पहले चूहों का वजन.
  3. Intraperitoneal गुहा में मिश्रण इंजेक्षन और एनेस्थेटिक्स कार्य और जानवरों narcotized हैं जब तक वापस पिंजरे में पशुओं जगह है. चूहों की सांस लेने की बहुत धीमी है और नियमित रूप से हो जाएगा. चूहे जीवाणु निलंबन की intranasal टीका और साँस लेना, इसलिए inoculum का नुकसान छींकने और में परिणाम नहीं होगा, इसलिए है कि पूरी तरह से narcotized रहना होगा. यह अपनी पूंछ के अंत में माउस pinching द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, एक पूरी तरह से narcotized माउस जवाबदेही की कमी होगी.
  4. धीरे एक narcotized माउस लेने और ईमानदार नाक (चित्रा 1) के साथ उंगलियों और अंगूठे के बीच माउस पकड़.
  5. लंबी संकीर्ण सुझावों (जेल लोडर के साथ एक विंदुक का प्रयोग करेंयुक्तियाँ) और माउस 26-29 की nares (10 μl / नथना) पर कई छोटे बूंदों में bioluminescent pneumococci ड्रॉप. माउस अनायास बैक्टीरिया श्वास जाएगा. ईमानदार माउस 1-2 मिनट पकड़ो और माउस छींक या inoculum रहता है कि क्या निरीक्षण करते हैं.
  6. वास्तविक समय में संक्रमण पर नजर रखने के लिए क्रमश: तनाव D39 और TIGR4, 1 x 10 7 या 7.5 x 10 7 pneumococci का एक संक्रमण खुराक के साथ intranasally 7-10 सप्ताह पुरानी सीडी -1 संक्रमित चूहों. मेजबान ऊतक द्वारा किसी भी अवशोषण के बिना सिस्टम के लिए सीमा का पता लगाने के लिए लगभग 1 एक्स 10 6 bioluminescent बैक्टीरिया है.
  7. Intraperitoneally संक्रमित चूहों (आईपी) का आकलन और एक पूति माउस संक्रमण मॉडल में pneumococci की bioimage डाह करने के लिए. तनाव D39 के 100 μl में 5 एक्स 10 3 CFU का प्रयोग करें और तनाव TIGR4 के 1 एक्स 10 4. आईपी ​​मार्ग का उपयोग करते समय चूहे anesthetized नहीं कर रहे हैं.
  8. पीबीएस के साथ नियंत्रण चूहों टीका लगाना.
    चित्रा 1 चित्रा 1. एस के साथ सीडी -1 चूहों की Intranasal संक्रमण निमोनिया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

3. इमेजिंग प्रणाली का उपयोग फेफड़े और रक्त में न्यूमोकोकल प्रसार Visualizing

एक vivo इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर वास्तविक समय में महिला outbred CD1 चूहों की intranasal संक्रमण के बाद pneumococci की छवि प्रसार.

  1. इमेजिंग प्रणाली पर स्विच और preconfigurated कंप्यूटर पर स्थित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं.
  2. इमेजिंग प्रणाली स्वतः initializes और सीसीडी कैमरा thermoelectrically सक्रिय होने से पहले 90 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है.
  3. सेटिंग्स और binning मापा चूहों की संख्या पर निर्भरएक साथ और bioluminescent संकेत के बल पर. जानवरों के bioluminescence नजर रखने के लिए दृश्य (FOV) के क्षेत्र चर रहा है और बढ़ाई छाती जैसे पशु की एक माउस या भागों को मापने के लिए पांच चूहों को मापने के लिए 22.5 सेमी की एक FOV के बीच पर्वतमाला, और 3.9 सेमी की एक FOV या सिर.
  4. नियमित तौर पर 1 मिनट, binning का एक माध्यम डिग्री, और 22.5 सेमी की एक FOV (सेट डी) के एक जोखिम समय का उपयोग करें. सबसे पहले, luminescent इमेजिंग मोड का चयन करें और फिर इमेजिंग मानकों सेट.
  5. संकेत का उत्सर्जन बैक्टीरियल तनाव और इस्तेमाल माउस तनाव, और माउस के रंग पर निर्भर हो सकता है. जैसे C57BL 6 / चूहों का उपयोग करते समय इन चूहों में निमोनिया का विकास जब इमेजिंग फायदेमंद हो सकता है, जो चूहों के सीने दाढ़ी.
  6. छवि prechosen समय अंतराल पर चूहों संक्रमित. अधिकतम 8-12 घंटे के समय अंतराल पर तीव्र निमोनिया मॉडल में चूहों के bioluminescence उपाय. Observi से भी संक्रमित चूहों के कल्याण की निगरानीउनकी उपस्थिति, व्यवहार, और वजन के नुकसान के निर्धारण एनजी.
  7. पूर्व कक्ष में मापन के लिए इमेजिंग उपकरण के संज्ञाहरण प्रणाली की मादक कक्ष में चूहों anesthetize. Isoflurane और ऑक्सीजन के मिश्रण से साँस लेना शुरू करें और चूहों धीरे धीरे और नियमित रूप से साँस लेने तक इंतजार.
  8. प्रणाली की इमेजिंग कक्ष में anesthetized जानवरों प्लेस और लापरवाह स्थिति में चूहों रहते हैं. चैम्बर होगा तो छवि murine श्वसन तंत्र के शीर्ष पर सीसीडी कैमरा.
  9. निश्चेतक की साँस लेना अनुमति देने के लिए ट्यूबों के लिए में अपनी नाक के साथ जानवरों रखें.
  10. एक गैस टयूबिंग के माध्यम से इमेजिंग कक्ष में isoflurane प्रविष्टि संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए अनुमति दी है.
  11. चैम्बर के शीर्ष पर सीसीडी कैमरा सक्रिय करने के लिए और इमेजिंग सॉफ्टवेयर में bioluminescent ऑप्टिकल इमेजिंग, प्रेस "मोल" शुरू करने के लिए. तुरंत बंद कक्ष में चूहों की एक तस्वीर स्क्रीन पर दिखाई देता है. के एक मिनट के बाद bioluminescence डेटा के ओवरले माप और तस्वीर में दिखाया गया है.
  12. छवि ओवरले सॉफ्टवेयर की खिड़की में प्रकट होता है के बाद संज्ञाहरण बंद करो और वापस अपने पिंजरों में चूहों डाल दिया.
  13. चूहे वसूली के लिए निगरानी कर रहे हैं.
    चित्रा 2
    चित्रा 2. संज्ञाहरण और ऊष्मायन कक्ष में anesthetized ऊष्मायन कक्ष के साथ. ए) IVIS स्पेक्ट्रम इमेजिंग प्रणाली. बी) IVIS संज्ञाहरण प्रणाली. सी) चूहे क्रमशः, IVIS संज्ञाहरण और IVIS स्पेक्ट्रम प्रणाली का उपयोग कर bioluminescent pneumococci से संक्रमित चूहों की निगरानी उनकी नाक संवेदनाहारी inhaling साथ IVIS स्पेक्ट्रम इमेजिंग कक्ष के भीतर स्थित है. डी) चूहे._blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

4. Bioluminescent एस से संक्रमित चूहों की Bioluminescence की मात्रा और मूल्यांकन निमोनिया

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कुल फोटान उत्सर्जन (फोटॉनों / सेक) बढ़ाता द्वारा चूहों की या चूहों के एक चयनित क्षेत्र के bioluminescence तीव्रता का निर्धारण करते हैं.
  2. एक ग्राफ तैयार करने के लिए एक एक्सेल डाटा शीट में प्रदान की जाती हैं कि फोटान उत्सर्जन के मूल्यों का प्रयोग करें. डेटा भिन्नता अक्सर समूहीकृत चूहों के भीतर उच्च है, अलग न्यूमोकोकल उपभेदों से संक्रमित चूहों में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए एक बॉक्स गलमुच्छा ग्राफ उत्पन्न करते हैं.
  3. चूहों प्रति फोटॉनों या किसी चयनित क्षेत्र की चमक के औसत (फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / आर) के रूप में वैकल्पिक रूप से परिणाम प्रदान करते हैं.
  4. फोटोन मोड में रॉय (क्षेत्र के हित) की माप डेटा मात्रात्मक आया विभिन्न साथ vivo इमेजिंग सिस्टम में अलग भर में तुलना की जा सकतीचमक की इकाइयों में माप स्वचालित रूप से खाते में कैमरा सेटिंग्स (उदाहरण के एकीकरण के समय, binning, एफ / बंद करो, और देखने के क्षेत्र) लेने के बाद आरए सेटिंग्स,.

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Representative Results

methionine के अधिग्रहण और तेज उनके मेजबान आला 32,33 में फिटनेस बनाए रखने के लिए pneumococci के लिए केंद्रीय महत्व का है. methionine एबीसी ट्रांसपोर्टर लिपोप्रोटीन एसपीडी _ 0151 जीन (TIGR4: sp_0149) द्वारा D39 में इनकोडिंग है और MetQ 32 नाम दिया है. Pneumococci आगे methionine जैवसंश्लेषण एंजाइमों (: -; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, परिधि और MetF Spd_0511 Spd_0510 D39) का उत्पादन. एक रासायनिक परिभाषित मध्यम में methionine के अभाव pneumococci और इसी तरह, methionine 32,33 के methionine बाध्यकारी लिपोप्रोटीन MetQ बिगड़ा तेज की कमी की वजह से विकास को प्रभावित करता है. इस दोष methionine के उच्च सांद्रता के अलावा द्वारा बहाल किया जा सकता है. MetQ के अभाव के कारण के रूप में दिखाया पूति और निमोनिया के माउस मॉडल में pneumococci तनु जबकि माउस बसाना प्रयोगों में MetQ में कमी उत्परिवर्ती, isogenic जंगली प्रकार के साथ coinfection प्रयोगों के रूप में दिखाया डाह में तनु नहीं किया गया थाजीवाणु लोड 32 का निर्धारण. यहां इस्तेमाल IVIS स्पेक्ट्रम का उपयोग वास्तविक समय ऑप्टिकल bioimaging अलग समय बिंदुओं पर एक भी संक्रमित जानवर में गुणन और बैक्टीरिया के प्रसार की निगरानी की अनुमति देता है.

यहाँ दिखाए गए उदाहरण में, हम तीव्र निमोनिया संक्रमण माउस मॉडल लागू करने से बसाना और डाह पर लिपोप्रोटीन MetQ बाध्यकारी methionine के प्रभाव का आकलन किया है. सीडी -1 outbred चूहों (n = 10) जंगली प्रकार तनाव एस के 1 10 x 7 बैक्टीरिया के साथ intranasally संक्रमित थे निमोनिया D39 लक्स (PN149) या अपने isogenic उत्परिवर्ती D39 लक्स Δ metQ (1 टेबल). metQ उत्परिवर्ती (PN252) bioluminescent D39 pneumococci में metQ जीन की प्रविष्टि विलोपन mutagenesis के द्वारा निर्माण किया गया था. इसलिए, metQ जीन, 5 'अनुक्रम और 3'sequence प्राइमरों 382 और 385 का उपयोग करते हुए पीसीआर से परिलक्षित किया गया. पीसीआर उत्पाद वेक्टर PGE में क्लोन किया गया थामीट्रिक टन आसान, प्लाज्मिड p559 (1 टेबल) में हुई है. उलटा पीसीआर द्वारा प्राइमरों 383 और 384 (तालिका 2) metQ अनुक्रम (NT 58 NT 777) नष्ट कर दिया और डीएनए टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड pE89 (1 टेबल) का उपयोग करते हुए पीसीआर से परिलक्षित एक इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध जीन कैसेट (ermB) द्वारा बदल दिया गया था का उपयोग और प्राइमर जोड़ी ermB_105/ermB_106 (2 तालिका). जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड पहले से क्षमता उत्तेजक पेप्टाइड -1 का उपयोग कर के रूप में वर्णित 34 pneumococci में तब्दील हो गया था p563. लिपोप्रोटीन MetQ (Spd_0151) में कमी म्यूटेंट तुम्हारा में या इरिथ्रोमाइसिन (5 ग्राम / एमएल) के साथ पूरक रक्त अगर प्लेटों पर खेती की जाती थी.

चूहों के स्वास्थ्य की स्थिति लगातार नजर रखी थी. कोई उचित प्रतिक्रिया या रुग्णता के संकेत दे रहा है जब पशु बलिदान किया गया. इसके अलावा, गंभीर निमोनिया और पूति के लिए अग्रणी फेफड़े और रक्त में nasopharynx से न्यूमोकोकल प्रसार, monito थाbioluminescence हर आठ घंटे मापने के द्वारा लाल. अन्य 3 चूहों कोई bioluminescence दिखाया और (चित्रा 3) बच गया, जबकि संक्रमित चूहों के प्रत्येक समूह में 10 चूहों में से 7, बीमारी के गंभीर लक्षण विकसित की है. सफलतापूर्वक bioluminescent जंगली प्रकार D39 लक्स से संक्रमित चूहों 32 घंटे पूति (चित्रा 3) को 8-16 घंटे के भीतर प्रगति जो बाद संक्रमण गंभीर फेफड़ों में संक्रमण, विकसित की है. समय बिंदु 96 घंटा में सभी चूहों निमोनिया और पूति D39 लक्स के साथ के बाद संक्रमण विकसित की थी कि आगे घुटने टेक दिए. नुकसान के समारोह methionine बाध्यकारी लिपोप्रोटीन की काफी pneumococci की डाह बिगड़ा. दूसरों बीमारी और निमोनिया का कोई स्पष्ट संकेत नहीं दिखाया है, जबकि 32 घंटा बाद metQ उत्परिवर्ती से संक्रमित केवल एक माउस, एक कमजोर फेफड़ों के संक्रमण से पता चला है. हालांकि, 48 घंटा के बाद गंभीर फेफड़ों में संक्रमण उत्परिवर्ती से संक्रमित चूहों में भी स्पष्ट हो गया. नतीजतन, इन चूहों पूति 72 घंटा विकसितबाद संक्रमण और तीव्र निमोनिया संक्रमण मॉडल में MetQ की कमी pneumococci attenuates प्रदर्शन है कि बाद में 72 घंटे के बाद संक्रमण से मरणासन्न हो गया.

तालिका 1. तनाव और प्लाज्मिड सूची.

तालिका 1

तालिका 2. प्राइमर सूची. प्रतिबंध साइटों को रेखांकित कर रहे हैं.

प्राइमर का उपयोग करना है प्राइमर नाम अनुक्रम (5'-3 ')
निवेशन विलोपन mutagenesis
+ 5 sp_0149 'के प्रवर्धन और
3 'क्षेत्र flanking
382
385
5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC -3 '
5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG -3 '
उलटा + 5 sp_0149 की पीसीआर 'और
3 'flanking क्षेत्र (pGEMTeasy)
383

384
5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT
GCGACTGTAG -3 '
5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA
CCACACAGA -3 '
एंटीबायोटिक कैसेट प्रवर्धन
इरिथ्रोमाइसिन (ermB) ermB_105

ermB_106 		5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA
ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG -3 '
5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT
GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC -3 '
ntent "> इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा bioluminescence भी गणना की गई. संक्रमण के दृश्य के लिए इसी प्रकार, bioluminescent प्रवाह की मात्रा का ठहराव, इस प्रकार. जंगली प्रकार के संक्रमित और metQ संक्रमण के बाद चूहों में 32 और 40 घंटा संक्रमित के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाया नुकसान के समारोह MetQ के आक्रामक संक्रमण का एक महत्वपूर्ण देरी में pneumococci और परिणाम attenuates, लेकिन अप्रचण्डी बैक्टीरिया में परिणाम नहीं करता है.

चित्रा 3
Intranasal संक्रमण के बाद चूहों में न्यूमोकोकल प्रसार का आंकड़ा 3. निगरानी. D39 लक्स या isogenic उत्परिवर्ती D39 luxΔmetQ. बी) के साथ intranasally संक्रमित चूहों के एक) Bioluminescent ऑप्टिकल इमेजिंग समूहीकृत चूहों के bioluminescence तीव्रता के मूल्यों (n = 10) दिखाए जाते हैंएक बॉक्स गलमुच्छा ग्राफ में संकेत समय अंक के लिए. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पशुओं में आयोजित सभी प्रयोगों स्थानीय अधिकारियों और नैतिकता आयोग द्वारा अनुमोदित किया जाना है. Vivo में संक्रमण प्रयोगों में संक्रमित पशुओं की विभिन्न मेजबान आलों में बैक्टीरियल लोड विभिन्न समय अंक के बाद संक्रमण पर निर्धारित किया है. इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत जानवरों के पूर्व रक्त, nasopharynx, bronchoalvelar पानी से धोना, या फेफड़ों, तिल्ली, और मस्तिष्क के रूप में अंगों से बैक्टीरिया के अलगाव के लिए बलिदान किया जाना है. मेजबान आला प्रति जीवाणुओं की संख्या की गणना और डाह पर बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए, रक्त या अंगों जीवाणु द्वारा पीछा पृथक किया जाना है उबरने और ठोस मीडिया पर चढ़ाना. जीवाणु लोड तो CFU की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित है. सांख्यिकीय हर समय बिंदु कुछ प्रयोगात्मक परिस्थितियों की वजह से चूहों की उच्च संख्या के लिए प्रयोग से निपटने में कठिनाइयों की ओर जाता है, जो चूहों के एक समूह की जरूरत है, महत्वपूर्ण डेटा तक पहुँचने के लिए.

ove_content "> इसके विपरीत, वास्तविक समय bioimaging विधि एक कम समय की मांग दृष्टिकोण और प्रत्येक व्यक्ति के बैक्टीरिया से संक्रमित माउस समय की अवधि में कई बार नजर रखी जा सकती है. इमेजिंग तकनीक अलग पर जानवर के भीतर बैक्टीरिया के दृश्य की अनुमति देता समय के बाद संक्रमण या यहां तक ​​कि एक विस्तारित समय अवधि के लिए अंक. इसके अलावा, ऑप्टिकल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मापा bioluminescence आगे संक्रमित जानवर द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है. यह माउस या पूरे का एक निर्धारित क्षेत्र तक सीमित किया जा सकता है पशु माना जा सकता है. pneumococci के प्रसार outbred CD-1 चूहों में तेजी से प्रगति कर सकते हैं क्योंकि vivo में संक्रमण प्रयोगों pneumococci संक्रमित चूहों में, 8-12 घंटे के अंतराल में निरीक्षण किया जा रहा है. वास्तविक समय इमेजिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है फेफड़े और रक्त में nasopharynx से pneumococci की स्थानांतरगमन कल्पना, और इसके अलावा, रक्त में pneumococci का गुणनintraperitoneal संक्रमण bioluminescence तीव्रता 26,28,29 में नाटकीय वृद्धि से नजर रखी जा सकती है.

जंगली प्रकार pneumococci और isogenic म्यूटेंट की डाह क्षमता की तुलना करते समय यह पहली बार में इन विट्रो संस्कृति परिस्थितियों में नुकसान के जीन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है. जंगली प्रकार के बैक्टीरिया और म्यूटेंट के बीच विकास मतभेद, रासायनिक परिभाषित मध्यम में विशेष रूप से, पहले से ही एक कम बैक्टीरियल फिटनेस 26 से संकेत मिलता है. इस प्रकार, vivo परिस्थितियों में मनाया क्षीणन बसाना और आक्रामक संक्रमण के दौरान कम मजबूत pneumococci के लिए अग्रणी एक बदल शरीर क्रिया विज्ञान के साथ जुड़ा हुआ है.

हालांकि, यह इस इमेजिंग तकनीक अक्सर न्यूमोकोकल डाह पर जीन knockouts के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि उल्लेख किया जाना है. अन्य रोगजनक बैक्टीरिया pneumococci के लिए इसी तरह बहुमुखी सूक्ष्मजीवों कर रहे हैं और बहुपक्षीय तंत्र टी विकसित किया हैओ मेजबान मुठभेड़ और प्रतिरक्षा प्रणाली से बचने. नतीजतन, pneumococci ऐसे adhesin PSPC और, दूसरे हाथ पर, वे इस प्रकार की वजह से म्यूटेशन 4,17,18 के लिए एक प्रोटीन का दोष क्षतिपूर्ति कर सकते हैं जो इसी तरह के कार्यों का प्रदर्शन कई प्रोटीन के साथ संपन्न हो के रूप में कई गुना कार्यों के साथ एक हाथ प्रोटीन पर उत्पादन , 35. इन स्थितियों में इस तरह के coinfection दृष्टिकोण के रूप में अन्य vivo में संक्रमण प्रयोगों बसाना या आक्रामक संक्रमण 27,28 के लिए उत्परिवर्ती में घाटे का प्रोटीन समारोह के प्रभाव को समझने के लिए नियोजित किया गया है.

Pneumococci preferentially मनुष्य लेकिन यह भी पालतू जानवर या चिड़ियाघर जानवरों 4,36,37 से अलग थे उपनिवेश और संक्रमित. डाह के प्रभाव को समझने के लिए या फिटनेस कारकों माउस संक्रमण मॉडल का इस्तेमाल कर रहे हैं. लेकिन, नहीं सभी न्यूमोकोकल उपभेदों माउस ज़हरीले हैं, और अधिक महत्वपूर्ण बात, चूहों की संवेदनशीलता जानवरों 22 की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है. न्यूमोकोकलडाह अध्ययन और संरक्षण पढ़ाई आजकल सीडी -1 outbred चूहों के साथ आयोजित की जाती हैं. हालांकि, चूहों पीटकर या ट्रांसजेनिक चूहों आक्रामक न्यूमोकोकल रोगों के लिए मेजबान कारकों की भूमिका को समझने के लिए उच्च ब्याज की भी हैं. पीटकर या ट्रांसजेनिक चूहों अक्सर ऐसे C57/BL6 या Balb / सी के रूप में माउस उपभेदों में उत्पन्न कर रहे हैं. ये माउस उपभेदों न्यूमोकोकल संक्रमण और उच्च संक्रमण खुराक के खिलाफ कम संभावना है एक घातक खुराक, 50% (एलडी 50) प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. Pneumococci इमेजिंग प्रणाली द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक एक तरह से गुणा करने के लिए सीमित कर रहे हैं के बाद से संक्रमण खुराक पर निर्भर करता है कि चूहों के इस प्रतिरोध, फेफड़े या रक्त के लिए न्यूमोकोकल प्रसार का वास्तविक समय bioimaging क्षीण हो सकता है. इस सीमा को पार करने के लिए और छवि वास्तविक समय में प्रसार करने में सक्षम हो, उच्च संक्रमण खुराक का उपयोग किया जाना है. इस दृष्टिकोण का जोखिम प्रसार भी तेजी से प्रगति के रूप में मेजबान संवेदनशीलता में मतभेद का पता लगाया जा सकता है कि नहीं हो सकता है.

के माध्यम से संक्रमित चूहों में न्यूमोकोकल संक्रमण पर नजर रखने की तुलना और चिह्नित करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. यह दृष्टिकोण विशेष रूप से जंगली प्रकार और एस के म्यूटेंट के बीच द्वेष संभावित तुलना करने के लिए उपयुक्त है निमोनिया.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

प्रयोगशाला में अनुसंधान एसएच लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG हा 3125/3-2, DFG हा 3125/4-2) और शिक्षा और अनुसंधान के संघीय मंत्रालय (BMBF) मेडिकल संक्रमण जीनोमिक्स (FKZ 0315828A) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1  
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2  
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A  
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2  
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376  
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151  
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500 mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany  
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany  
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok syringes with needle
Gel Loader Tips PeqLab 81-13790 MµltiFlex Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001  
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany  
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany  
Oligonucleotides  Eurofins MWG, Ebersberg, Germany  
Qiaprep Spin Midiprep Kit  Qiagen, Hilden, Germany 27104  
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106  
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
IVIS Spectrum Imaging System  Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany  
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany  

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References

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