Summary
Streptococcus pneumoniae ciddi toplum kökenli pnömoni ve dünya çapında 2 milyondan fazla kişinin ölümünden sorumludur neden lider patojen olduğunu. Spor ya da virülans karıştığı bakteriyel faktörlerin etkisi biyolüminesens bakterileri kullanarak akut fare pnömoni veya bakteriyemi modelinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
Abstract
Pnömoni geliştirilmesinde önemli sağlık sorunları ve sanayileşmiş ülkelerden biridir ve önemli morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Bu hastalık bilgisi, yoğun bakım üniteleri (YBÜ) kullanılabilirliği ve güçlü antimikrobiyal ajanların ve etkili aşıların kullanımı ilerlemelere rağmen, ölüm oranları 1 yüksek kalır. Streptococcus pneumoniae toplum kökenli pnömoni önde gelen patojen (CAP) 'dir ve insanlarda bakteremi en yaygın nedenlerinden biridir. Bu patojen yüzey-açık adhesinler ve pnömoni ve invasif pnömokok hastalığının (IPD) katkıda hastalık oluşturma faktörlerinin bir usul ve araçları ile donatılmıştır. Bakteriyel spor veya hastalık oluşturma faktörlerinin in vivo rolünün değerlendirilmesi S. çözmek için büyük önem taşımaktadır pneumoniae patojenik mekanizmalar. Pnömoni, bakteriyemi ve menenjit fare modelleri Değişik at pnömokok faktörlerin etkisini belirlemek için kullanılmaktadırenfeksiyon aşamaları ferent. Burada burun içi veya biyolüminesens bakteri ile karın içi enfeksiyonlar sonrasında farelerde gerçek-zamanlı pnömokok yayılmasında izlemek için bir protokol açıklar. Sonuçlar, bir görüntüleme sistemi ile beraberindeki analiz yazılımı kullanılarak görüntülenmiştir ve değerlendirilebilir alt solunum yolu ve kandaki çarpma ve pnömokok yayılmasını göstermektedir.
Introduction
Virüsler veya bakterilerin neden olduğu solunum yolu enfeksiyonları, dünyadaki tüm ölüm yaklaşık üçte birini neden dünya çapında en sık görülen toplum kökenli veya klinik sorunlardan biri olmaya devam etmektedir. Anahtar bakteri türleri arasında Haemophilus influenzae ve Streptococcus pneumoniae 2 'dir. Bununla birlikte, bu bakteri türleri normal olarak doğal solunum yolları florasının bilinen bileşenleridir. Böylece bakteri taşıma invazif hastalık ve bağışıklık durumu veya bireylerin yatkınlıklar bağlı olarak belirli risk aynı zamanda. Asemptomatik kolonizasyon invazif hastalık tetiklenir. Streptococcus pneumoniae toplum kökenli pnömoni (TKP) ve insanlarda bakteriyemi en yaygın nedenlerinden birinin önde gelen patojen olduğunu. Sağlıklı bireylerde S. pneumoniae (pnömokok) genellikle patojenik bakteriler ile karşı karşıya, üst solunum yolu, asemptomatik ve zararsız kolonizerleridirama aynı zamanda Haemophilus spp patojenler ile kalıcı floranın. veya Staphylococcus aureus ve insan bağışıklık savunma sisteminin ilk satırı. Taşıyıcılık oranları küçük çocuklarda yüksek olduğu (% 37) ve 3-5 (% 58) kalabalık gündüz bakım merkezleri içinde bile yüksek. Genç nüfus ve yaşlı, taşıyıcıları ve nazofarenks sekresyonları 6 aerosol iletimi yoluyla pnömokokkustan alma, konjuge pnömokok aşıları (yetişkinlerde, çocuklarda ve 23-valan polisakkarid PPSV23 içinde PCV10 veya PCV13) birini kullanarak yüksek risk gruplarına ve aşılama ait Amerika Birleşik Devletleri (ABD) ve birçok Avrupa ülkesinde 4 önerilir. PCVS çocuklarda en yaygın serotipini kapsarken PPSV23, yetişkinlerde böylece verimli invazif pnömokok hastalıkları (IPD) önlenmesinde ABD ve Avrupa'da bakteremik pnömokok hastalıkları,% 90 ~ sorumludur serotiplerini kapsar. Sonuç olarak, IPD nedeniyle aşı türleri (VT) için gdrm vardıryüksek virulans potansiyeli ve antibiyotik direnç göstererek CED ama nonvaccine serotipleri 4,7-12 ortaya çıkmıştır. Rezervuar olarak nazofarenks zararlı lokal enfeksiyonlara başlatılması sinüs veya orta kulağına yaymak pnömokoklar için başlangıç noktasıdır. Hayatı tehdit eden bir CAP 4,13 sonuçlanan bronşlara ve akciğere solunum yoluyla direkt olarak yayılan Daha da önemlisi, pnömokokkinin. Akciğer enfeksiyonları genellikle bu şekilde kana yaymak için patojen etkinleştirme ve IPD neden doku ve bariyer imha ile eşlik eder. TKP ve IPD'nin olaylar bağışıklığı baskılanmış kişilerde yaş veya 4,13 en uç en yüksek bulunmaktadır. Yüksek zehirlilik ile bir patojene bir commensal gelen dönüşüm sorumlu koşullar tartışma sürüyor. Ancak, daha yüksek virülans ve antibiyotik direnç artışı ile birlikte konakçı duyarlılık ve evrimsel değişikliklerden uyum yanı sıra PNE üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu önerilmiştirumococcal enfeksiyonlar 14-16.
Patojen epitel hücreleri mukozal yakın temas aracılık adezinlerin çokluğu ile donatılmıştır. Hava yolu mukus üstesinden sonra, konukçu hücrelere pnömokokkal yapışmayı hücresel reseptörler ile yüzeye maruz kalan adezinlerin doğrudan etkileşimler yoluyla ve molekül 4,17,18 köprü gibi hücre dışı matris bileşenleri veya serum proteinleri istismar tarafından kolaylaştırılır. Gibi çok yönlü patojenler pnömokoklar da ana bağışıklık savunma mekanizmaları kaçırma katılan faktörler ile donatılmıştır. Ayrıca, bu tür sırasıyla akciğer, kan ve beyin omurilik sıvısı (CSF), 5,17,19,20 gibi çeşitli konak çevrelerde uyum kapasitesine sahiptir.
Patogenezi ve enflamatuar yanıtları ana bakteri faktörlerin etkisi pnömoni, bakteremi hayvan modellerinde incelenmiştir veya 21-25 menenjit. Bir insan patojen olmasına rağmen, bu modeller bizpnömokok doku tropizminin, virülans mekanizmaları veya pnömokok aşısı adayların korunabilirliğini deşifre ll-kurmuştur. Kendilenmiş fare suşlarının genetik arka pneumococci için duyarlılık belirler. CBA / Ca ve SJL farenin pnömokokal enfeksiyonlara 22 karşı daha duyarlı iken burun pnömokok ile enfekte olmuş BALB / c fareleri, dirençli olduğu bulunmuştur. Bu, insanlarda genetik arka plan ve ana savunma mekanizmalarına benzer enfeksiyonun sonucunu belirlemek, anlamına gelir. Bu nedenle, daha fazla çaba pnömokokal enfeksiyonlara karşı daha az duyarlı farelerin genomuna loci direnci çözmek için gereklidir. Bulgular in vivo virülans protokollere değişikliklere yol açmıştır. Bunun yerine sık sık geçmişte kullanılan doğal BALB / c farelerde, son derece duyarlı CD-1/MF1 outbred fare suşları bugünlerde sık sık kayıp fonksiyon-pnömokok virülansa veya uygunluk 26-28 faktörlerin etkisini incelemek için kullanılır. Dahası, kullanılabilirliğiBio-ışıldar pneumococci ve optik görüntüleme teknikleri enfeksiyonların gerçek zamanlı biyoluminesans bio sağlar. Pnömokok olarak optimize luxABCDE gen kaseti (plazmid pAUL-A Tn 4001 luxABCDE Km r) transposon mutagenez ile kromozomun tek bir entegrasyon alanı içine eklenir edilmiştir. Bioluminescent pnömokok hastalık oluşturma ya da spor faktörleri ve başka 26,28-31 bir anatomik yerinden itibaren translokasyona eksikliği olan pnömokok mutantların zayıflama değerlendirmek için kullanılmıştır.
Burada bir murin pnömoni veya sepsis modelinde pnömokok enfeksiyonlarının bio için bir protokol sağlamaktır. Burun içine veya intraperitoneal olarak enfekte olan farelerde amplifikasyonu ve biyolüminesans pnömokokkinin yayma kolay bir şekilde farklı zaman noktalarında bir optik görüntüleme sistemi ile aynı hayvan kullanılarak zaman içinde izlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada anlatılan hayvan enfeksiyon deneyleri kurallar ve omurgalı hayvanların kullanımı için düzenlemeler yerel ve uluslararası (Laboratuar Hayvan Bilimi Konfederasyonu (FELASA) Federasyonu örneğin, Avrupa Sağlık Hukuku) ile sıkı göre yapılmalıdır. Deneyleri yerel etik kurulu ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir. S ile Tüm deneyler laboratuar veya hayvan enfeksiyonlarda pneumoniae Sınıf II Biyogüvenlik Kurulu yapılmaktadır.
1.. Biyoluminesen Pneumocococi ve Bulaşıcı Stok hazırlanması
- 80 ° C de (ağ / hac) maya ekstresi ve bakımı için,% 20 gliserol bir nihai konsantrasyon% 1 ile takviye Todd-Hewitt lapası içindeki stok kültürleri pnömokok hazırlayın
- Kan agar plakası üzerine, derin dondurulmuş bir stok kültürünün pnömokok küçük bir miktar Plate ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 10 saat boyunca bakteri inkübe edin. TO, kan agar plaka genomuna luxABCDE gen kasetinin transpozon sokulması için, kanamisin (150 ug / ml) halinde uygun bir antibiyotik içerir.
- 10 saat arasında bir süre için bir yeni kan agar plakası üzerine yeni bir koloni Alt yetiştirmek.
- THY ortam% 10 (v / v) ısı (56 ° C 'de 30 dakika) etkisizleştirilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş olan pnömokok ve OD 0,05-0,07 600 de başlangıç kültürü inoküle.
- Kültür OD 0,35-0,40 600 ulaşıncaya kadar 37 ° C'de çalkalanarak ve% 5 CO2 olmadan pnömokok inkübe edin. Büyüme 3-4 saat arasında sürer.
- 10 dakika boyunca 3750 x g ve% 0.5 FBS ile takviye edilmiş fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) içinde yeniden süspanse biyolüminesans pnömokok santrifüjleme ile hasat pnömokokkinin.
- PBS/10% FBS içinde istenen konsantrasyona inokulum ayarlayın. Enfeksiyon dozu, kullanılan pnömokok gerilme ve mikrofon genetik arka plan bağlıdıre. S ile burun outbred CD-1 fareleri enfekte etmek için pneumoniae D39 Enfeksiyon dozu 90 Units hiyaluronidaz ile takviye edilmiş 20 ul bir süspansiyon içinde 1 x 10 7 CFU ayarlanmalıdır lux. Bu otolitik tetikler, çünkü sallamak veya vorteks pnömokokki etmeyin.
- % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca büyüme sonrası kan agar ve kolonilerin sayımı üzerine 10 kat seri dilüsyonları kaplama ile inokulum konsantrasyonunun kontrol edin.
- Bir optik görüntüleme sistemi kullanılarak ışıldaması ölçülerek pnömokok inokulum biyo-kontrol edin.
2. Bioluminescent Pnömokok ile burun içi ve intraperitoneal Farelerin enfeksiyonu
- Akut pnömoni ve sepsis model için 7-10 hafta çağında kadın outbred fareler kullanın. Bu farelerin ağırlığı 20-30 g arasında olmalıdır.
- Ketamin ve ksilazin intraperitonal enjeksiyonu ile farelerin anestezisi. Karışımı 1.0 mg hazırlanması100 ul steril% 0.9 ve 0.1 mg ketamin xylazine 20 g bir vücut ağırlığına sahip fareler için (w / v) sodyum klorit ilave edildi. Bu, ketamin / kg vücut ağırlığı ve 50 mg ksilazin boyunca 5 mg / kg vücut ağırlığı dozunda ile tutarlıdır. Doğrusu, anestezik enjeksiyondan önce fareler tartın.
- Intraperitoneal boşluğuna karışımı enjekte edilir ve anestezik hareket ve hayvanlar uyuşturulur kadar geri kafese hayvanları yerleştirin. Farelerin Solunum çok yavaş ve düzenli olacak. Fareler bakteri süspansiyonu intranazal aşılama ve soluma, dolayısıyla aşı kaybı hapşırma ve neden olmaz, böylece tam olarak uyuşturulur olması gerekir. Bu onların kuyruk sonunda fareyi sıkarak değerlendirilebilir; tamamen uyuşturulur fare yanıt yoksun olacaktır.
- Yavaşça uyuşturulur fareyi alıp dik burun (Şekil 1) ile parmak ve başparmak arasında fareyi tutun.
- Uzun dar ipuçları (Jel Yükleyici ile bir pipet kullanınİpuçları) ve fare 26-29 burun (10 ul / burun) üzerine birden fazla küçük damlacıklar biyolüminesens pnömokok bırakın. Fare istemsiz bakteri nefes olacaktır. Dik fare 1-2 dakika tutun ve fare hapşırma veya inokülumu tutar mı gözlemleyin.
- Gerçek zamanlı olarak izlemek için enfeksiyon, sırasıyla, D39 ve gerilme TIGR4, 1 x 10 7 ya da 7.5 x 10 7, pnömokokkinin bir enfeksiyon dozu ile burun içinden 7-10 haftalık CD-1 fareler, Infect. Dokuda herhangi bir emme olmaksızın sistemi için tespit limiti, yaklaşık 1 x 10 6-ışıldar bakteridir.
- Enfekte fareler intraperitoneal (İP) değerlendirmek ve sepsis fare enfeksiyon modelinde, pnömokokkinin biyoimaj ölümcüllüğe. D39 suşu 100 ul 5 x 10 3 CFU kullanın ve gerginlik TIGR4 1 x 10 4. IP yolu kullanırken Fareler anestezi değildir.
- PBS ile kontrol farelere inoküle.
Şekil 1. S ile CD-1 mice intranazal enfeksiyonu pneumoniae. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
3. Görüntüleme Sistemi kullanarak Akciğer ve Kan içine Pnömokok Yaygınlaştırma görselleştirme
Bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçek zamanlı olarak dişi CD1 Dışarıda gelişen farelerin burun içi enfeksiyondan sonra, pnömokokkinin görüntü dağıtılması.
- Görüntüleme sistemi açın ve preconfigurated bilgisayarda bulunan görüntü analiz yazılımı başlatmak.
- Görüntüleme sistemi otomatik olarak başlatılır ve CCD kamerası thermoelectrically aktif edilmeden önce 90 ° C'ye soğutulur.
- Ayarları ve gruplaması ölçülen farelerin sayısı bağlıdıraynı anda ve bioluminescent sinyal gücüne bağlıdır. Hayvanların ışıldaması izlemek için görünüm (FOV) alanında değişkendir ve büyütme göğüs gibi hayvanın tek bir fare veya parçalar ölçmek için beş fareler ölçmek için 22.5 sm bir FOV arasında değişir, ve 3.9 cm'lik bir FOV ya da baş.
- Rutin 1 dakika, binning orta derecede, ve 22.5 cm bir FOV (set D) bir pozlama süresi kullanın. Öncelikle, ışıldayan görüntüleme modu seçin ve ardından görüntüleme parametrelerini ayarlamak.
- Sinyalin emisyonu bakteri suşu ve ikinci fare suşu ve fare pigment bağlıdır. Örneğin, C57BL / 6 fareleri kullanırken bu farelerde pnömoni gelişimini görüntüleme avantajlı olabilir ki, farelerin göğüs tıraş.
- Görüntü önceden seçilmiş zaman aralıklarında fareler bulaşmış. En fazla 8-12 saat arasında bir zaman aralıklarında akut pnömoni modelinde, farelerin biyo-ölçün. Observi tarafından da enfekte farelerin refah izleyinOnların görünüm, davranış ve kilo kaybı belirlenmesini ng.
- Önce bölme içindeki ölçümler için görüntüleme ekipmanının anestezi sisteminin narkotik odasındaki fareler anestezi. Izofluran ve oksijen karışımı teneffüs başlatın ve fareler yavaş yavaş ve düzenli olarak nefes kadar bekleyin.
- Sistemin görüntüleme odasına anestezi hayvanları yerleştirin ve yatar pozisyonda fareler tutun. Bölmenin olacak sonra görüntü murin solunum yolu üstündeki CCD kamerası.
- Anestezik solunmasını izin tüpleri içine kendi burun hayvanları yerleştirin.
- Bir gaz boru vasıtasıyla görüntüleme haznesine Isoflurane giriş anesteziyi muhafaza etmek üzere bırakılır.
- Odasının üstüne CCD kamerayı etkinleştirmek için ve görüntüleme yazılımı biyolüminesan optik görüntüleme, basın "Al'ı" başlatmak için. Hemen kapalı bir odada, farelerin bir fotoğrafıdır ekranda belirir. Bir dakika beklemeden sonra biyoışıldama verilerin bir kaplamasını ölçümü ve fotoğraf gösterilir.
- Görüntü bindirmesi yazılım penceresinde göründükten sonra anestezi durdurmak ve geri kafesler içine fareler koydu.
- Fareler kurtarma için izlenir.
Şekil 2,. Anestezi ve inkübasyon odası içinde anestezi inkübasyon odası ile. A) IVIS Spectrum görüntüleme sistemi. B) IVIS anestezi sistemi. C) Fare sırasıyla IVIS anestezi ve IVIS Spectrum sistemi kullanarak Bio-ışıldar pnömokok ile enfekte edilen farelerin izlenmesi onların burun anestezi teneffüs ile IVIS Spektrum Görüntüleme odasının içinde bulunan. D) Fare._blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
4. Bioluminescent S. ile Enfekte Farelerde ışıldama Kantitasyonu ve Değerlendirilmesi pneumoniae
- Görüntü analiz yazılımı kullanılarak toplam foton emisyonu (foton / saniye) miktarının farelerin ya da bir fare, seçilen bölgenin biyoışıldama yoğunluklarını belirler.
- Bir grafik hazırlamak için bir Excel veri sayfasında sağlanan foton emisyon değerleri kullanın. Veri varyasyonu genelde gruplandırılmış fareler içinde yüksek olduğu için, farklı pnömokok suşları ile enfekte olmuş farelerde farkları göstermek için bir kutu bıyık grafik oluşturmak.
- Farelerde başına fotonlar veya seçilen alanın parlaklık ortalamasının (fotonlar / sn / cm 2 / sr) gibi alternatif sonuçları sağlar.
- Foton modunda ROI (bölge-faiz) ölçüm verileri nicel gelen farklı in vivo görüntüleme sistemlerinde farklı arasında mukayese edilebilirparlaklık birimlerde ölçümler otomatik olarak hesaba kamera ayarlarını (örneğin entegrasyon süresi, gruplaması, f / stop ve görüş alanı) almak beri ra ayarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metioninin edinimi ve alımı ev sahibi niş 32,33 olarak formunu korumak pnömokokkinin için merkezi öneme sahiptir. Metionin ABC taşıyıcı lipoprotein spd _ 0151 gen (TIGR4: sp_0149) tarafından D39 kodlanmış ve MetQ 32 atadı. Pnömokok daha metionin biyosentezi enzimleri (: -; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete ve metF Spd_0511 Spd_0510 D39) üretirler. Kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam içinde metioninin eksikliği pnömokok ve benzeri, metionin 32,33 arasında metionin bağlayıcı lipoprotein MetQ engelli alınmasından eksikliği büyümesini etkiler. Bu kusur metionin yüksek konsantrasyonlarda ilavesiyle eski haline getirilebilmektedir. MetQ eksikliği ile gösterildiği gibi sepsis ve pnömoni fare modellerinde pnömokok zayıflatılmış, fare kolonizasyon deneylerde MetQ eksik, mutant, izogenik yabani-tür ile birlikte-enfeksiyon deneylerde gösterildiği gibi, zayıflatılmış hastalık oluşturma etkenin değildibakteri yükü 32 saptanması. Burada kullanılan IVIS Spektrum kullanarak gerçek zamanlı optik bio farklı zaman noktalarında tek enfekte olmuş bir hayvanda çarpma ve bakterilerin yayılmasını izleme sağlar.
Burada gösterilen örnekte, akut pnömoni enfeksiyonu fare modelini uygulayarak kolonizasyonu ve şiddeti üzerinde lipoprotein MetQ bağlayıcı metionin etkisini değerlendirdik. CD-1 Dışarıda gelişen farenin (n = 10), vahşi tip suşu S. 1 x 10 7 bakteri ile burun içinden enfekte edildi pneumoniae D39 lux (PN149) ya da izogenik mutant D39 lux Δ metQ (Tablo 1). MetQ mutant (PN252) Bio-ışıldar D39 pnömokoklar metQ geninin ekleme silme mutagenezi ile inşa edilmiştir. Bu nedenle, metQ geni, 5 'dizisi ve 3'sequence primerleri 382 ve 385 kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiştir. PCR ürünü, vektör PGE klonlanmıştırMT-kolay plasmid p559 (Tablo 1) ile sonuçlanmıştır. Ters PCR ile primerler 383 ve 384 (Tablo 2) metQ dizisi (nt 58 ila nt 777) silinir ve DNA şablon olarak plazmid pE89 (Tablo 1) kullanarak, PCR ile amplifiye bir eritromisin direnç geni kaset (ermB) ile değiştirildi kullanarak primer çifti ermB_105/ermB_106 (Tablo 2). Elde edilen plazmid, daha önce yeterlilik uyarıcı peptit-1 ile tarif edildiği gibi 34 pnömokok dönüştürüldü p563. Lipoprotein MetQ (Spd_0151) eksikliği mutantlar THY veya eritromisin (5 ug / ml) ile takviye edilmiş, kan agar plakaları üzerinde yetiştirildi.
Farelerin sağlık durumu sürekli olarak izlenmiştir. Hiçbir şekilde yanıt ya da morbidite belirtileri gösteren zaman hayvanlar kurban edildi. Ayrıca, ağır pnömoni ve sepsis önde akciğerlere ve kana Nazofarenksin pnömokok yaygınlaştırma, monito oldubiyoışıldama her sekiz saatte bir ölçerek kırmızı. Diğer 3 farenin herhangi bir biyo-gösterdi (Şekil 3A) hayatta kaldığını enfekte edilmiş farelerin her grupta 10 fare üzerinden 7, hastalığın ciddi işaretleri geliştirmiştir. Başarıyla biyolüminesans yabani tip D39 lux ile enfekte edilen fareler 32 saat sepsis (Şekil 3A) 8-16 saat içinde ilerledikçe enfeksiyon sonrası ciddi akciğer enfeksiyonları, geliştirdi. Zaman noktası 96 saat tüm fareler pnömoni ve sepsis D39 lux ile enfeksiyon sonrası gelişmiş olduğunu yenik düştü. Kayıp fonksiyon-metionin bağlayıcı lipoprotein anlamlı pnömokoklardan virülans bozulmuş. Diğerleri hastalık ve zatürre hiçbir belirgin belirtileri gösterdi ise 32 saat sonra metQ mutant ile enfekte tek bir fare, bir zayıf bir akciğer enfeksiyonu gösterdi. Ancak, 48 saat sonra şiddetli akciğer enfeksiyonları mutant ile enfekte edilen farelerin de ortaya çıkmıştır. Bunun bir sonucu olarak, bu farenin sepsis 72 saat geliştirilmiştirsonrası enfeksiyon ve akut pnömoni enfeksiyon modelinde MetQ bir eksikliği pnömokok azalttığını gösteren, en geç 72 saat sonrası enfeksiyon daha can çekişir hale geldi.
Tablo 1.. Gerilme ve plazmid listesi.
Tablo 2.. Primer liste. Sınırlama siteleri altı çizilmiştir.
| Primer Amaçlanan Kullanım | Primer adı | Dizi (5'-3 '); |
| Ekleme silme mutagenezi | ||
| + 5 sp_0149 'amplifikasyonu ve 3 'yan bölgesine | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| Ters + 5 sp_0149 PCR 've 3 'yan bölgesi (pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| Antibiyotik kaset amplifikasyon | ||
| eritromisin (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
Burun içi enfeksiyondan sonra farelerde pnömokok yayma Şekil 3.. Izlenmesi. D39 lux veya izogenik mutant D39 luxΔmetQ. B) ile burun içinden enfekte edilen farelerin A) Bioluminescent optik görüntüleme gruplandırılmış farelerin biyoışıldama yoğunluklarının değerleri (n = 10) gösterilmektedirBir kutu bıyık grafikte belirtilen zaman noktaları için. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvanlarda yapılan tüm deneyler, yerel yönetimler ve etik komisyonları tarafından onaylanmış olması gerekir. In vivo enfeksiyon deneylerde, enfekte hayvanların çeşitli ev sahibi niş bakteri yükü çeşitli zaman noktalarında Enfeksiyondan tespit edilmelidir. Bu deney koşulları altında, hayvanlara önce kan, nazofarenks, bronchoalvelar lavaj, ya da akciğer, dalak ve beyin gibi organlardan bakterilerin izolasyonu için feda edilmesi gerekir. Ev sahibi niş başına bakteri sayısını hesaplar ve hastalık oluşturma etkeni üzerinde bakteri faktörlerin etkisini değerlendirmek için, kan ya da organ bakteriyel ardından izole edilmesi ve geri kazanılması gerekir katı ortam üzerinde kaplama. Bakteri yükü, daha sonra CFU numaralandırmasıyla ölçülür. Istatistiksel olarak her zaman noktası, belirli deney şartlarında nedeniyle farelerin yüksek sayıda deney alınmasında zorluklar neden farelerin bir grup, ihtiyacı önemli verilere ulaşmak.
ove_content "> Bunun tersine, gerçek zamanlı bio yöntem, daha az zaman gerektiren bir yaklaşım ve her bir bakteri ile enfekte olmuş farenin bir süre boyunca birkaç kez izlenebilir olan. görüntüleme tekniği, farklı da hayvan içinde bakteri görüntülenmesini sağlar: saat post-enfeksiyon ya da uzun bir zaman süresi için işaret eder. Ayrıca, optik görüntü analiz yazılımı ile ölçülen biyoışıldama ayrıca enfekte hayvan tarafından yayılan foton ölçümü sağlar. bu fare ya da tamamının tanımlı bir alana sınırlandırılabilir Hayvan olarak kabul edilebilir. pnömokok yayılması outbred CD-1 farelerinde hızla ilerleme çünkü in vivo enfeksiyon deneyleri pnömokokki ile enfekte olmuş farelerde, 8-12 saatlik aralıklarla kontrol edilmesi gerekir. gerçek zamanlı görüntüleme için kullanılabilecektir akciğer ve kana Nazofarenksin pnömokokkinin görselleştirmek bir transmigrasyonu, ve ek olarak, kandaki pnömokok çarpımKarın içi enfeksiyon biyolüminesans yoğunluğu 26,28,29 dramatik artış ile izlenebilir sonra.Vahşi tip pneumococci ve izojenik mutantların hastalık oluşturma potansiyeli karşılaştırırken ilk in vitro kültür koşulları altında kaybı-geninin etkisinin test edilmesi için gereklidir. Vahşi tip bakteri ve mutantlar arasında istatistiki fark, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam içinde, özellikle, daha önce azalan bakteri spor 26 göstermektedir. Bu nedenle, in vivo koşullarda gözlemlenen zayıflamanın kolonileşme ve enfeksiyon sırasında daha az invazif pnömokok sağlam yol açan değiştirilmiş bir fizyolojisi ile ilişkilidir.
Bununla birlikte, bu görüntüleme tekniği genellikle pnömokok hastalık oluşturma etkeni üzerinde gen knock-out etkisini göstermek için yeterli olmadığını söz edilmesi gerekir. Diğer patojenik bakteriler pneumococci için benzer yönlü mikroorganizmalar ve çok yönlü mekanizmalar t gelişmiştiro ana karşılaşma ve bağışıklık sistemini kaçmasına. Sonuç olarak, bu pnömokok adhesin PspC'den ve, diğer taraftan, böylece mutasyonlar 4,17,18 bir proteinin hatasını telafi edebilir benzer işlevler gösteren çeşitli proteinleri ile donatılmış bulunmaktadır gibi çeşitli fonksiyonları olan bir yandan proteinleri üretmeye 35. Bu tür senaryolarda-enfeksiyon yaklaşım olarak, diğer in vivo enfeksiyon deneyleri kolonizasyona veya yayılımcı enfeksiyonlar 27,28 için mutant kaybı-protein fonksiyonunun etkisini deşifre etmek için kullanılan araçlar vardır.
Pnömokok tercihen insanlarda değil aynı zamanda evcil hayvan ya da hayvanat bahçesi hayvanları 4,36,37 izole edildi kolonize ve enfekte. Ölümcüllüğün etkisini deşifre veya spor faktörler fare enfeksiyon modelleri kullanılmaktadır. Ancak, tüm pnömokok suşları fare virülan, ve daha da önemlisi, farelerin hayvanların duyarlılık 22 genetik arka plan bağlıdır. Pnömokokvirülens çalışmalar ve koruma çalışmaları günümüzde CD-1 outbred fareler ile yürütülmektedir. Ancak, fareler nakavt veya transgenik farenin invasif pnömokok hastalık için bir ev sahibi faktörlerin rolü deşifre yüksek de ilgi konusudur. Knockout ya da transjenik farenin genellikle C57/BL6 ya da Balb / c fare soylarında oluşturulur. Bu fare soyları, pnömokokal enfeksiyonları ve yüksek enfeksiyon dozlarına karşı daha az duyarlı olan bir öldürücü doz,% 50 (LD 50) elde edilmesi için gereklidir. Pnömokokkinin görüntüleme sistemi tarafından tespiti için gerekli bir şekilde çoğalmaya sınırlı olduğundan enfeksiyon dozu bağlı olarak farelerin bu direnç, akciğerlere veya kan pnömokok yayılması gerçek zamanlı Biolmaging bozabilir. Bu sınırlamayı aşmak için ve resmi gerçek zamanlı olarak dağıtılması edebilmek için, yüksek enfeksiyon dozlar kullanılabilir olması gerekir. Bu yaklaşımın riski çok hızlı bir şekilde yayılması ilerledikçe konakçı duyarlılık ayrılıklar edilemez olabilir.
ile enfekte olmuş farelerde pnömokok kökenli enfeksiyonları, izleme karşılaştırmak ve karakterize etmek için mükemmel bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bu yaklaşım, özellikle, vahşi tip ve S. mutantlar arasında hastalık oluşturma potansiyeli karşılaştırmak için uygundur pneumoniae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Laboratuarda araştırma SH Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) ve Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (Bmbf) Tıbbi Enfeksiyon Genomics (FKZ 0315828A) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G.
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J.
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E.
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
